Immunotherapy for Alzheimer\'s disease has emerged as a promising approach for clearing pathological tau protein conformers. To explore this kind of treatment we tested an active immunization with pseudo-phosphorylated tau fragments in P301L tangle model mice that develop neuronal tau aggregates as observed in frontotemporal dementia and Alzheimer’s disease. We found that an immunization reduces neurodegeneration in α-motor neurons in the spinal cord and slows progression of the tangle-related behavioral phenotype. Performance on behavioral assays correlated with tau pathology at the corresponding spinal cord level. Interestingly, a slowed progression of these tauopathy related characteristics were only seen in mice that received a specific immunization with pseudo-phosphorylated tau fragments, not in animals that received a non-specific activation of the immune system. An immunization witch pseudo-phosphorylated tau fragments may be a valuable therapeutic option in targeting one of the major hallmarks of Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia.

Bei der Alzheimerschen Erkrankung handelt es sich um eine progressiv verlaufende, neurodegenerative Erkrankung, die die häufigste Form altersbedingter, kognitiver Dysfunktionen des Menschen darstellt. Sie ist pathomorphologisch durch eine fortschreitende Formation von amorphen und kompakten extrazellulären Amyloid-Ablagerungen (Plaques) sowie durch die Ausbildung intrazellulärer neurofibrillärer Bündel charakterisiert. Die Oligomerisierung und die Aggregation von β-Amyloid1-42-Peptiden zu fibrillären Plaques und davon ausgehende neurodegenerative Veränderungen führen zu einer unspezifischen Aktivierung von Mikrogliazellen und zu Entzündungsprozessen im ZNS. Diese Antigen-unspezifische Form der Mikroglia-Aktivierung ist neurotoxisch und fördert daher die Neurodegeneration im Verlauf der Alzheimerschen Erkrankung. Mikroglia-Aktivierung ist allerdings nicht generell neurotoxisch, da es verschiedene, in der vorliegenden Arbeit diskutierte Arten von mikroglialer Aktivierung mit jeweils unterschiedlichen – neurotoxischen bis hin zu neuroprotektiven - Auswirkungen gibt. Das Ziel dieser Arbeit war es, die mikrogliale Aktivierung in einem Mausmodell des Morbus Alzheimer zu modulieren und die resultierenden Effekte zu charakterisieren. Für die Modulation der mikroglialen Aktivierung wurde die subklinische Infektion mit dem neurotropen Borna Disease Virus (BDV) genutzt. Um den Einfluss der veränderten mikroglialen Aktivierung auf die zerebrale β-Amyloid-Belastung zu untersuchen, wurden swAPP-transgene Mäuse der Linie Tg2576 verwendet, die die schwedische Mutationsvariante des humanen app überexprimieren. Diese Mäuse produzieren humane β-Amyloid-Peptide, die sich mit zunehmendem Alter zu Plaques formieren. Transgene Mäuse wurden in drei Altersgruppen (11, 13,5 und 18 Monate) BDV-infiziert. Vier Wochen später wurden im Gehirn der Mäuse immunhistochemisch Lymphozyteninfiltration, Astroglia- und Mikroglia-Aktivierung untersucht. Die zerebrale βA-Belastung dieser BDV-infizierten Mäuse wurde mittels βA1-42-Immunhistochemie und Thioflavin-S-Markierung histometrisch quantifiziert und mit nicht infizierten, transgenen Kontrollmäusen verglichen. Auch eine biochemische Analyse der βA1-40- und βA1-42-Peptide mittels ELISA wurde vorgenommen. Zu keinem Zeitpunkt wurde eine klinisch manifeste BDV-Erkrankung registriert; die BDV-infizierten Mäuse blieben klinisch unauffällig. βA-Ablagerungen allein waren nur bei massiver Formation in der Lage, einzelne Mikroglia-zellen zu aktivieren. Erst die intrazerebrale BDV-Infektion induzierte vorrangig CD4-T-lymphozytäre Infiltrationen sowie eine deutliche BDV-spezifische Aktivierung der Mikroglia-zellen, die vier Wochen p.i. maximal ausgeprägt waren. Es lag eine positive lokale und graduelle Korrelation zwischen CD4-T-Lymphozyteninfiltrationen und Mikroglia-Aktivierung in den Gehirnen BDV-infizierter Mäuse vor. Bis auf eine Untersuchungsgruppe wurde keine nachweisbare Reaktion der Astroglia - weder auf die BDV-Infektion, noch auf die βA-Ablagerungen - registriert. In allen untersuchten Altersgruppen wurde ein tendenziell reduzierter βA-Gehalt in den Gehirnen der BDV-infizierten Tiere gegenüber den nicht infizierten Kontrolltieren registriert. Diese βA-Reduktion nach BDV-Infektion war in der Altersgruppe 13,5 Monate am deutlichsten ausgeprägt, wo die βA-Belastung der BDV-infizierten Tiere in vielen untersuchten Arealen signifikant geringer war als die der Kontrolltiere. Eine lokale Korrelation zwischen Mikroglia-Aktivierung und βA-Reduktion wurde nicht nachgewiesen. In zahlreichen untersuchten Hirnarealen aller drei Altersgruppen war der Anteil von vaskulär lokalisiertem β-Amyloid in den Gehirnen der BDV-infizierten Mäuse gegenüber den nicht infizierten Kontrollmäusen signifikant erhöht. Schlussfolgerungen: 1) In unserem Mausmodell führt die BDV-Infektion zu einer Modulation der Mikroglia-Aktivierung. 2) Die Korrelation der Mikroglia-Aktivierung mit viral bedingter T-Zellinfiltration und erhöhter Zytokinexpression deutet auf adaptive, T-Zell-vermittelte Modulation als Induktor dieser Aktivierung. 3) Die BDV-induzierte Mikroglia-Aktivierung führt zu einer: a) β-Amyloid-Reduktion, an der vermutlich von spezifisch aktivierten Mikrogliazellen ausgehende Clearance-Mechanismen beteiligt sind. b) β-Amyloid-Umverteilung vom Parenchym zu den Gefäßen, vermutlich, um den βA-Abtransport über das Gefäßsystem zu realisieren, wobei Amyloid-Einlagerungen in die Gefäßwände möglich sind. 4) Die viral induzierte Mikroglia-Aktivierung hängt sowohl vom Alter als auch von möglicher Voraktivierung der Zellen ab; altersbedingte Dysfunktionalität der Mikroglia ist eine potentielle Ursache der geringeren β-Amyloid-Clearance in der Altersgruppe 18 Monate. 5) Die Modulation der Mikroglia-Aktivierung ist prinzipiell möglich und führt zu potentiell positiven Effekten. 6) Dieses Modell ist zur Untersuchung der Modulation mikroglialer Aktivierung über adaptive Mechanismen geeignet. / Alzheimer´s Disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder and the most common form of age-related cognitive failure in humans. Pathomorphologically, it is characterized by a progressive accumulation of amorphous and compact extracellular amyloid-β deposits (plaques) as well as intracellular neurofibrillary tangles. Oligomerization and aggregation of amyloid-β1-42, its formation of fibrillary deposits as well as associated neurodegenerative changes lead to an unspecific activation of microglial cells and to inflammatory processes in the CNS. This unspecific form of microglial activation is neurotoxic and enhances neurodegeneration in the course of Alzheimer´s Disease. However, microglial activation is not neurotoxic per se, since there are various types of microglial activation that are being discussed in this study; the different activation types have varying effects reaching from neurotoxic to neuroprotective. The aim of the study was to modify microglial activation in a mouse model of Morbus Alzheimer and to characterize the resulting effects. For the modulation of microglial activation, we used the subclinic infection with the neurotropic Borna Disease Virus (BDV). In order to study the impact of the modulated microglial activation on the cerebral amount of beta-amyloid material, we used swAPP-transgenic Tg2576 mice, which overexpress the Swedish mutation variant of the human APP. These mice produce human amyloid β peptides that form amyloid plaques upon aging. We infected transgenic mice intracerebrally with BDV at different ages (11, 13,5 and 18 months old) and investigated brain-sections of these mice four weeks later by means of immunohistochemistry with regard to lymphocytic infiltrations, astroglial and microglial activation. The amount of amyloid β in the brains of BDV-infected mice was compared to that of non-infected, transgenic mice. The investigation of the cerebral amyloid β load was realized immunohistochemically by using an anti-Aβ1-42-antibody as well as by means of Thioflavin-S fluorescence technique followed by histometric quantification. Additionally, a biochemical analysis of Aβ1-40 and Aβ1-42 peptides was done using an ELISA-kit. A clinically apparent BDV-disorder could not be seen at any stage; BDV-infected mice remained free of BDV symptoms. Only massive amyloid-β deposits were able to independently induce activation of single microglial cells. Intracerebral BDV-infection caused marked infiltrations of primarily CD4-T-lymphocytes as well as a prominent specific microglial activation, which reached maximum levels four weeks p.i. A positive local and gradual correlation of CD4-T-lymphocytes and microglial activation was registrated in the brains of BDV-infected mice. Except one age group, neither BDV-infection nor amyloid-β deposits induced a detectable reaction of astrocytes. In all investigated age groups, a reduced amount of amyloid-β could be measured in the brains of BDV-infected mice compared to non-infected control mice. This Aβ reduction after BDV-infection was most prominent in the age group 13,5 months, where Aβ-load of BDV-infected mice was significantly decreased in many brain areas compared to that of control mice. A local correlation of microglial activation and Aβ reduction could not be observed. Several brain areas in all three age groups showed a significantly higher amount of vascular amyloid-β in the brains of BDV-infected mice compared to those of non-infected controls. Conclusions: 1) In our mouse model, BDV-infection leads to a modulation of microglial activation. 2) The correlation of microglial activation with viral-induced infiltrations of T cells and with upregulated cytokine expression suggests an adaptive, T cell-induced modulation as trigger of this acivation. 3) BDV-specific microglial activation leads to: a) Reduced cerebal amyloid-β load, possibly realized by clearance mechanisms of activated microglial cells. b) Redistribution of amyloid-β from the parenchyma to the vessels, possibly in order to clear the amyloidogenic material via the vasculature. During these processes, amyloid deposition in the walls of the cerebral blood vessels is possible. 4) Viral-induced microglial activation depends on the cell´s age and possible pre-activation; dysfunctional changes in microglia might be a cause for the less effective Aβ-clearance observed in the age group 18 months. 5) In principle, modulation of microglial activation is possible and leads to potential beneficial effects. 6) This study displays a proper model for investigations of the modulation of microglial activation via adaptive mechanisms.

Clinical findings have linked multiple risk factors and associated pathologies to Alzheimer\'s disease (AD). Amongst them are vascular risk factors such as hypertension and pathologies such as stroke. Coexistence of AD and these associated pathologies worsenes dementia, the clinical hallmark of the disease, as compared to pure AD. One general common denominator of these associated pathologies is the presence of hypoxic tissue conditions. It was asked the question, whether there exists a mutual, causal interaction between hypoxia and AD pathology, that could explain the clinical observations. Alternatively, the worsened clinical state of multiple brain pathologies could \"simply\" be the consequence of multimorbidity, i.e. accumulated disease load, without any causal interaction between the constituents. To approach this question whether hypoxia influences AD progression, use was made of a murine animal model of AD (transgenic mice: APPswe, PSEN1dE). Animals of two ages (8 and 14 months, \"young\" and \"old\" respectively) and two genotypes (transgenic and wild- type) were either treated under hypoxia or normoxia, corresponding to 8% and 21% oxygen, for 20 consecutive days. The resulting changes in the brain were assessed with a variety of techniques, namely by histology, ELISA, dot and Western blotting. Additional experiments in primary cell cultures were performed. Animals exposed to hypoxia showed an increased hematocrit (HCT), weight loss, reactive angiogenesis, but no infarctions. This illustrates that our hypoxic treatment put significant stress on the animals, without causing major pathologies. A large number of variables exists that could potentially be measured to assess the effect of hypoxia on AD. The focus was put on three of them: First, there is the Abeta1-42- protein, known to be the Abeta- isoform associated with the most detrimental disease progression. In AD, the self-combinatory Amyloid- beta peptide (Abeta) accumulates in the brain in so- called plaques, which is a main histologic finding of the disease. Its quantity was determined through histology and ELISA. Secondly, it was attempted to estimate the structural quality of the Abeta- protein by assessing the amount of A!- oligomers present. Abeta- protein does self- accumulate in various grades of complexity, i.e. as monomer, oligomer or fibril. Since oligomers are known to be the most neurotoxic \"species\" of the Abeta- protein, it was hypothesized that under hypoxic treatment their quantity could increase. And third, the organism\'s response to the Abeta- protein stimulus was investigated. Microglial cells have been described as the first cells to encounter the Abeta- protein \"threat\" in the shape of plaques, i.e. Abeta- protein aggregates. They then try to encapsulate and subsequently degrade them. Therefore, the attention was put on this cellular population. It was asked whether hypoxia could change the Abeta- protein quantity in the brain. This was assessed in two ways: First histologically, by staining for Abeta- protein depositions and quantifying them. Second, an ELISA was performed. Our findings state that hypoxic treatment does not alter the Abeta1-42 protein load in the brain, neither in young nor old animals, as assessed by histology and by total ELISA quantification of Abeta1-42 protein. Since hypoxia did not alter the quantity of the Abeta- protein, it was asked whether it influenced it qualitatively? If hypoxia increased oligomer formation, this change in the spectrum of the Abeta- species could, without any change in total Abeta- protein load, lead to increased neurotoxicity in animals under hypoxia. Initial experiments showed that oligomer formation in the brain seems to increase. However, this was not statistically significant and future experiments are necessary to evaluate this hypothesis further. It was then asked, whether hypoxia alters the cellular response to the protein. The total number of microglia in the hippocampal dentate gyrus, our structure of interest for practical purposes, and, it can be argued, by extension the brain, changes dynamically with various factors. First, transgenic animals present an increase in microglia. Second, microglia increase with age. Third, microglia decrease under hypoxia, but only do so significantly in old animals. Next, a parameter called \"plaque occupancy\" was coined to assess the microglia function to confront Abeta- plaques. Plaque occupancy is defined as the number of microglia in spatial proximity to one square millimeter of Abeta- plaque. This means, that microglia restricting one plaque are counted, and then normalized to this plaque\'s area. It was hypothesized that hypoxia would decrease plaque occupancy. Indeed, plaque occupancy roughly halved under hypoxia. Summarizing, our results demonstrate that long- term exposure to hypoxia significantly reduces the number of microglia. The reduced number results in significantly reduced plaque occupancy and compromizes the function of microglia to confront Abeta- plaques. The Abeta1-42 load, however, is not affected. On the other hand, Abeta shows an increased trend towards oligomer formation. A variety of possible explanations to these phenomena have been presented, that in our opinion deserve further investigation.

Immunotherapy for Alzheimer\''s disease has emerged as a promising approach for clearing pathological tau protein conformers. To explore this kind of treatment we tested an active immunization with pseudo-phosphorylated tau fragments in P301L tangle model mice that develop neuronal tau aggregates as observed in frontotemporal dementia and Alzheimer’s disease. We found that an immunization reduces neurodegeneration in α-motor neurons in the spinal cord and slows progression of the tangle-related behavioral phenotype. Performance on behavioral assays correlated with tau pathology at the corresponding spinal cord level. Interestingly, a slowed progression of these tauopathy related characteristics were only seen in mice that received a specific immunization with pseudo-phosphorylated tau fragments, not in animals that received a non-specific activation of the immune system. An immunization witch pseudo-phosphorylated tau fragments may be a valuable therapeutic option in targeting one of the major hallmarks of Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia.

Die Bildung von Amyloidablagerungen ist ein Kennzeichen der Alzheimerschen Erkrankung. Hauptbestandteil dieser senilen Plaques sind sogenannte A beta Peptide, die durch proteolytische Prozessierung aus einem Vorläufermolekül (APP) gebildet werden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Klonierung des Meerschweinchen - APP. Diese cDNA-Sequenz zeigt auf DNA-Ebene eine Homologie zum Human-APP von ca. 90%, auf Proteinebene beträgt die Identität ca. 97 %. Damit wird ein weiterer experimenteller Beweis für die evolutionäre Konservierung des Amyloidvorläuferproteins in Säugetieren erbracht. APP mRNA wird in Meerschweinchen-Geweben ubiquitär exprimiert. Durch alternatives Spleißen wird ein zum Human-APP im wesentlichen ähnliches Isoformenmuster gebildet: Isoformen, welche eine Proteaseinhibitordomäne enthalten, werden dominierend in peripheren Organen exprimiert, dagegen ist im Zentralnervensystem das APP 695 mit über 60 % der Gesamttranskripte die bevorzugt exprimierte Isoform. Die klonierte cDNA des Meerschweinchen-APP wurde in prokaryontischen wie auch eukaryontischen Zellsystemen exprimiert. Dabei wurde die Eignung einer Anzahl von gegen Human-APP gewonnenen Antikörpern zur Detektion des Meerschweinchen-APP und seiner Prozessierungsprodukte gezeigt. Die Expression der neuronal dominierend exprimierten Isoform APP 695 des Meerschweinchen-APP in humanen Neuroblastom-Zellen zeigte keine Unterschiede hinsichtlich der APP-Prozessierung und A beta-Bildung im direkten Vergleich zu Human-APP 695. Die proteolytische Prozessierung des Proteins wurde durch Detektion der typischen Spaltprodukte in vivo (im Liquor) als auch in einem neu etablierten in vitro-Modell primär kultivierter neuronaler Zellen untersucht. Diese Zellkulturen wurden zunächst immunhistochemisch und biochemisch charakterisiert und als "mixed brain"-Typ mit einem hohen neuronalen Anteil beschrieben. Die Prozessierung des endogenen Meerschweinchen-APP in kultivierten Zellen führt dabei zur Bildung und Akkumulation aggregationsfähiger A beta - Peptide. Zur Detektion dieser Peptide wurde ein sensitiver Nachweis durch Western-Blot etabliert. Es wird damit ein Modellsystem für in vitro-Untersuchungen vorgeschlagen, welches ein Studium der Expression und Prozessierung des Amyloidvorläuferproteins unter angenähert physiologischen Bedingungen ermöglicht. / A beta peptides, the major component of neuritic plaques found in the brains of patients with Alzheimer’s disease, are derived by proteolytic processing from a larger precursor molecule (amyloid precursor protein - APP). A combination of PCR methods was used to clone and sequence APP cDNA from guinea pig (Cavia porcellus). Guinea pig APP exhibits extensive similarities to human APP in terms of primary structure, mRNA expression of differentially spliced isoforms as shown by Northern blot and RT-PCR analysis as well as proteolytic processing to amyloidogenic A beta peptides. In contrast to rat and mouse APP, guinea pig APP - recombinantly expressed in human neuroblastoma-cells - was processed indistinguishable from human APP thus excluding intrinsic sequence-specific factors influencing processing. Further studies were performed using newly established primary cell cultures of guinea pig neurons. Refined methods have been used to detect and characterize major proteolytic processing products of APP in vitro and in vivo. In conclusion, guinea pigs provide a model to study expression and processing of APP that closely resembles the physiological situation in humans and should, therefore, be important in elucidating potential strategies to prevent amyloid formation in Alzheimers Disease.

Clinical findings have linked multiple risk factors and associated pathologies to Alzheimer\''s disease (AD). Amongst them are vascular risk factors such as hypertension and pathologies such as stroke. Coexistence of AD and these associated pathologies worsenes dementia, the clinical hallmark of the disease, as compared to pure AD. One general common denominator of these associated pathologies is the presence of hypoxic tissue conditions. It was asked the question, whether there exists a mutual, causal interaction between hypoxia and AD pathology, that could explain the clinical observations. Alternatively, the worsened clinical state of multiple brain pathologies could \"simply\" be the consequence of multimorbidity, i.e. accumulated disease load, without any causal interaction between the constituents. To approach this question whether hypoxia influences AD progression, use was made of a murine animal model of AD (transgenic mice: APPswe, PSEN1dE). Animals of two ages (8 and 14 months, \"young\" and \"old\" respectively) and two genotypes (transgenic and wild- type) were either treated under hypoxia or normoxia, corresponding to 8% and 21% oxygen, for 20 consecutive days. The resulting changes in the brain were assessed with a variety of techniques, namely by histology, ELISA, dot and Western blotting. Additional experiments in primary cell cultures were performed. Animals exposed to hypoxia showed an increased hematocrit (HCT), weight loss, reactive angiogenesis, but no infarctions. This illustrates that our hypoxic treatment put significant stress on the animals, without causing major pathologies. A large number of variables exists that could potentially be measured to assess the effect of hypoxia on AD. The focus was put on three of them: First, there is the Abeta1-42- protein, known to be the Abeta- isoform associated with the most detrimental disease progression. In AD, the self-combinatory Amyloid- beta peptide (Abeta) accumulates in the brain in so- called plaques, which is a main histologic finding of the disease. Its quantity was determined through histology and ELISA. Secondly, it was attempted to estimate the structural quality of the Abeta- protein by assessing the amount of A!- oligomers present. Abeta- protein does self- accumulate in various grades of complexity, i.e. as monomer, oligomer or fibril. Since oligomers are known to be the most neurotoxic \"species\" of the Abeta- protein, it was hypothesized that under hypoxic treatment their quantity could increase. And third, the organism\''s response to the Abeta- protein stimulus was investigated. Microglial cells have been described as the first cells to encounter the Abeta- protein \"threat\" in the shape of plaques, i.e. Abeta- protein aggregates. They then try to encapsulate and subsequently degrade them. Therefore, the attention was put on this cellular population. It was asked whether hypoxia could change the Abeta- protein quantity in the brain. This was assessed in two ways: First histologically, by staining for Abeta- protein depositions and quantifying them. Second, an ELISA was performed. Our findings state that hypoxic treatment does not alter the Abeta1-42 protein load in the brain, neither in young nor old animals, as assessed by histology and by total ELISA quantification of Abeta1-42 protein. Since hypoxia did not alter the quantity of the Abeta- protein, it was asked whether it influenced it qualitatively? If hypoxia increased oligomer formation, this change in the spectrum of the Abeta- species could, without any change in total Abeta- protein load, lead to increased neurotoxicity in animals under hypoxia. Initial experiments showed that oligomer formation in the brain seems to increase. However, this was not statistically significant and future experiments are necessary to evaluate this hypothesis further. It was then asked, whether hypoxia alters the cellular response to the protein. The total number of microglia in the hippocampal dentate gyrus, our structure of interest for practical purposes, and, it can be argued, by extension the brain, changes dynamically with various factors. First, transgenic animals present an increase in microglia. Second, microglia increase with age. Third, microglia decrease under hypoxia, but only do so significantly in old animals. Next, a parameter called \"plaque occupancy\" was coined to assess the microglia function to confront Abeta- plaques. Plaque occupancy is defined as the number of microglia in spatial proximity to one square millimeter of Abeta- plaque. This means, that microglia restricting one plaque are counted, and then normalized to this plaque\''s area. It was hypothesized that hypoxia would decrease plaque occupancy. Indeed, plaque occupancy roughly halved under hypoxia. Summarizing, our results demonstrate that long- term exposure to hypoxia significantly reduces the number of microglia. The reduced number results in significantly reduced plaque occupancy and compromizes the function of microglia to confront Abeta- plaques. The Abeta1-42 load, however, is not affected. On the other hand, Abeta shows an increased trend towards oligomer formation. A variety of possible explanations to these phenomena have been presented, that in our opinion deserve further investigation.

Bei der Alzheimerschen Erkrankung handelt es sich um eine progressiv verlaufende, neurodegenerative Erkrankung, die die häufigste Form altersbedingter, kognitiver Dysfunktionen des Menschen darstellt. Sie ist pathomorphologisch durch eine fortschreitende Formation von amorphen und kompakten extrazellulären Amyloid-Ablagerungen (Plaques) sowie durch die Ausbildung intrazellulärer neurofibrillärer Bündel charakterisiert. Die Oligomerisierung und die Aggregation von β-Amyloid1-42-Peptiden zu fibrillären Plaques und davon ausgehende neurodegenerative Veränderungen führen zu einer unspezifischen Aktivierung von Mikrogliazellen und zu Entzündungsprozessen im ZNS. Diese Antigen-unspezifische Form der Mikroglia-Aktivierung ist neurotoxisch und fördert daher die Neurodegeneration im Verlauf der Alzheimerschen Erkrankung. Mikroglia-Aktivierung ist allerdings nicht generell neurotoxisch, da es verschiedene, in der vorliegenden Arbeit diskutierte Arten von mikroglialer Aktivierung mit jeweils unterschiedlichen – neurotoxischen bis hin zu neuroprotektiven - Auswirkungen gibt. Das Ziel dieser Arbeit war es, die mikrogliale Aktivierung in einem Mausmodell des Morbus Alzheimer zu modulieren und die resultierenden Effekte zu charakterisieren. Für die Modulation der mikroglialen Aktivierung wurde die subklinische Infektion mit dem neurotropen Borna Disease Virus (BDV) genutzt. Um den Einfluss der veränderten mikroglialen Aktivierung auf die zerebrale β-Amyloid-Belastung zu untersuchen, wurden swAPP-transgene Mäuse der Linie Tg2576 verwendet, die die schwedische Mutationsvariante des humanen app überexprimieren. Diese Mäuse produzieren humane β-Amyloid-Peptide, die sich mit zunehmendem Alter zu Plaques formieren. Transgene Mäuse wurden in drei Altersgruppen (11, 13,5 und 18 Monate) BDV-infiziert. Vier Wochen später wurden im Gehirn der Mäuse immunhistochemisch Lymphozyteninfiltration, Astroglia- und Mikroglia-Aktivierung untersucht. Die zerebrale βA-Belastung dieser BDV-infizierten Mäuse wurde mittels βA1-42-Immunhistochemie und Thioflavin-S-Markierung histometrisch quantifiziert und mit nicht infizierten, transgenen Kontrollmäusen verglichen. Auch eine biochemische Analyse der βA1-40- und βA1-42-Peptide mittels ELISA wurde vorgenommen. Zu keinem Zeitpunkt wurde eine klinisch manifeste BDV-Erkrankung registriert; die BDV-infizierten Mäuse blieben klinisch unauffällig. βA-Ablagerungen allein waren nur bei massiver Formation in der Lage, einzelne Mikroglia-zellen zu aktivieren. Erst die intrazerebrale BDV-Infektion induzierte vorrangig CD4-T-lymphozytäre Infiltrationen sowie eine deutliche BDV-spezifische Aktivierung der Mikroglia-zellen, die vier Wochen p.i. maximal ausgeprägt waren. Es lag eine positive lokale und graduelle Korrelation zwischen CD4-T-Lymphozyteninfiltrationen und Mikroglia-Aktivierung in den Gehirnen BDV-infizierter Mäuse vor. Bis auf eine Untersuchungsgruppe wurde keine nachweisbare Reaktion der Astroglia - weder auf die BDV-Infektion, noch auf die βA-Ablagerungen - registriert. In allen untersuchten Altersgruppen wurde ein tendenziell reduzierter βA-Gehalt in den Gehirnen der BDV-infizierten Tiere gegenüber den nicht infizierten Kontrolltieren registriert. Diese βA-Reduktion nach BDV-Infektion war in der Altersgruppe 13,5 Monate am deutlichsten ausgeprägt, wo die βA-Belastung der BDV-infizierten Tiere in vielen untersuchten Arealen signifikant geringer war als die der Kontrolltiere. Eine lokale Korrelation zwischen Mikroglia-Aktivierung und βA-Reduktion wurde nicht nachgewiesen. In zahlreichen untersuchten Hirnarealen aller drei Altersgruppen war der Anteil von vaskulär lokalisiertem β-Amyloid in den Gehirnen der BDV-infizierten Mäuse gegenüber den nicht infizierten Kontrollmäusen signifikant erhöht. Schlussfolgerungen: 1) In unserem Mausmodell führt die BDV-Infektion zu einer Modulation der Mikroglia-Aktivierung. 2) Die Korrelation der Mikroglia-Aktivierung mit viral bedingter T-Zellinfiltration und erhöhter Zytokinexpression deutet auf adaptive, T-Zell-vermittelte Modulation als Induktor dieser Aktivierung. 3) Die BDV-induzierte Mikroglia-Aktivierung führt zu einer: a) β-Amyloid-Reduktion, an der vermutlich von spezifisch aktivierten Mikrogliazellen ausgehende Clearance-Mechanismen beteiligt sind. b) β-Amyloid-Umverteilung vom Parenchym zu den Gefäßen, vermutlich, um den βA-Abtransport über das Gefäßsystem zu realisieren, wobei Amyloid-Einlagerungen in die Gefäßwände möglich sind. 4) Die viral induzierte Mikroglia-Aktivierung hängt sowohl vom Alter als auch von möglicher Voraktivierung der Zellen ab; altersbedingte Dysfunktionalität der Mikroglia ist eine potentielle Ursache der geringeren β-Amyloid-Clearance in der Altersgruppe 18 Monate. 5) Die Modulation der Mikroglia-Aktivierung ist prinzipiell möglich und führt zu potentiell positiven Effekten. 6) Dieses Modell ist zur Untersuchung der Modulation mikroglialer Aktivierung über adaptive Mechanismen geeignet. / Alzheimer´s Disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder and the most common form of age-related cognitive failure in humans. Pathomorphologically, it is characterized by a progressive accumulation of amorphous and compact extracellular amyloid-β deposits (plaques) as well as intracellular neurofibrillary tangles. Oligomerization and aggregation of amyloid-β1-42, its formation of fibrillary deposits as well as associated neurodegenerative changes lead to an unspecific activation of microglial cells and to inflammatory processes in the CNS. This unspecific form of microglial activation is neurotoxic and enhances neurodegeneration in the course of Alzheimer´s Disease. However, microglial activation is not neurotoxic per se, since there are various types of microglial activation that are being discussed in this study; the different activation types have varying effects reaching from neurotoxic to neuroprotective. The aim of the study was to modify microglial activation in a mouse model of Morbus Alzheimer and to characterize the resulting effects. For the modulation of microglial activation, we used the subclinic infection with the neurotropic Borna Disease Virus (BDV). In order to study the impact of the modulated microglial activation on the cerebral amount of beta-amyloid material, we used swAPP-transgenic Tg2576 mice, which overexpress the Swedish mutation variant of the human APP. These mice produce human amyloid β peptides that form amyloid plaques upon aging. We infected transgenic mice intracerebrally with BDV at different ages (11, 13,5 and 18 months old) and investigated brain-sections of these mice four weeks later by means of immunohistochemistry with regard to lymphocytic infiltrations, astroglial and microglial activation. The amount of amyloid β in the brains of BDV-infected mice was compared to that of non-infected, transgenic mice. The investigation of the cerebral amyloid β load was realized immunohistochemically by using an anti-Aβ1-42-antibody as well as by means of Thioflavin-S fluorescence technique followed by histometric quantification. Additionally, a biochemical analysis of Aβ1-40 and Aβ1-42 peptides was done using an ELISA-kit. A clinically apparent BDV-disorder could not be seen at any stage; BDV-infected mice remained free of BDV symptoms. Only massive amyloid-β deposits were able to independently induce activation of single microglial cells. Intracerebral BDV-infection caused marked infiltrations of primarily CD4-T-lymphocytes as well as a prominent specific microglial activation, which reached maximum levels four weeks p.i. A positive local and gradual correlation of CD4-T-lymphocytes and microglial activation was registrated in the brains of BDV-infected mice. Except one age group, neither BDV-infection nor amyloid-β deposits induced a detectable reaction of astrocytes. In all investigated age groups, a reduced amount of amyloid-β could be measured in the brains of BDV-infected mice compared to non-infected control mice. This Aβ reduction after BDV-infection was most prominent in the age group 13,5 months, where Aβ-load of BDV-infected mice was significantly decreased in many brain areas compared to that of control mice. A local correlation of microglial activation and Aβ reduction could not be observed. Several brain areas in all three age groups showed a significantly higher amount of vascular amyloid-β in the brains of BDV-infected mice compared to those of non-infected controls. Conclusions: 1) In our mouse model, BDV-infection leads to a modulation of microglial activation. 2) The correlation of microglial activation with viral-induced infiltrations of T cells and with upregulated cytokine expression suggests an adaptive, T cell-induced modulation as trigger of this acivation. 3) BDV-specific microglial activation leads to: a) Reduced cerebal amyloid-β load, possibly realized by clearance mechanisms of activated microglial cells. b) Redistribution of amyloid-β from the parenchyma to the vessels, possibly in order to clear the amyloidogenic material via the vasculature. During these processes, amyloid deposition in the walls of the cerebral blood vessels is possible. 4) Viral-induced microglial activation depends on the cell´s age and possible pre-activation; dysfunctional changes in microglia might be a cause for the less effective Aβ-clearance observed in the age group 18 months. 5) In principle, modulation of microglial activation is possible and leads to potential beneficial effects. 6) This study displays a proper model for investigations of the modulation of microglial activation via adaptive mechanisms.

Als Metallopeptidase mit einem großen Substratspektrum hat die Neutrale Endopeptidase (Neprilysin, EC 3.4.24.11, NEP) Einfluss auf so verschiedene Krankheiten oder pathophysiologischen Vorgänge wie Hypertonie, die Alzheimersche Erkrankung oder krankhafte Prostataveränderungen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Beziehungen der NEP zur Alzheimerschen Erkrankung sowie zu zwei weiteren pathophysiologischen Veränderungen – einem erhöhten Alkoholkonsum unter Stress sowie zu Adipositas/Übergewicht – eingehend untersucht. In Bezug auf die Alzheimersche Erkrankung wurde der Frage nachgegangen, warum Mäuse und Ratten keine vollständige Alzheimer-Symptomatik ausbilden. Dabei wurde ein verlangsamter Abbau des murinen beta-Amyloid-Peptids im Gegensatz zur humanen Form gefunden und biochemisch charakterisiert. Diese Befunde wurden durch den Nachweis, dass das murine im Gegensatz zum humanen Abeta-Peptid keine Amyloidfibrillen ausbildet, komplettiert. Am Modell der NEP-Knockout-Maus wurde in freiwilligen Trinkversuchen ein Alkoholverbrauch beobachtet, der dem von C57BL6-Wildtyp-Mäusen vergleichbar war. Nach einem kurzzeitigen sozialen Stress nahm jedoch der Alkoholkonsum der NEP-Knockout-Mäuse für ca. 3 Wochen deutlich und nach einem weiteren Stress sogar für mehrere Monate zu. An NEP-Knockout-Mäusen wurde überdies erstmals ein übergewichtiger Phänotyp beschrieben, der der menschlichen polygenetischen Adipositas sehr ähnlich ist. Dieser Phänotyp wurde eingehend physiologisch und biochemisch sowie in Abhängigkeit von verschiedenen Futtersorten (fettreiche bzw. Kohlenhydrat-modifizierte Nahrung) charakterisiert. In diesem Rahmen wurde erstmals die Hydrolyse des orexigenen Peptids Galanin durch die NEP beschrieben. Erste Erklärungsansätze für die Ausprägung des übergewichtigen Phänotyps bei NEP-Knockout-Mäusen sowie die Eignung dieses Tiermodells als Modell der komplexen humanen Adipositas werden diskutiert. / As a metallopeptidase with a large substrate spectrum neutral endopeptidase (Neprilysin, EC 3.4.24.11, NEP) influences diseases or pathophysiological states as different as hypertonia, Alzheimer’s disease or pathologic changes of the prostate. In this work the relations of NEP to Alzheimer’s disease and to two other pathophysiologic changes – an increased alcohol consumption under stress conditions as well as to adiposity/obesity – were examined in detail. Regarding Alzheimer’s disease the question was addressed why mice and rats do not show a complete Alzheimer’s pathology. The hydrolytic rate of the murine beta-Amyloid peptide was found to be decreased in contrast to the human form. The hydrolysis was further characterized by biochemistry. These findings were completed by the confirmation that murine abeta peptide does not form amyloid fibrils in contrast to the human peptide. By using the NEP knockout-mouse model in a free-choice drinking paradigm these mice showed an alcohol consumption comparable to that of C57BL6 wildtype mice. However, after a temporary social stress the alcohol consumption of the NEP knockout-mice increased for approx. 3 weeks and after a further stress it remained on a higher level for several months. Moreover, an obese phenotype of NEP knockout-mice was described here for the first time. This phenotype was found to be very similar to the human polygenetic adiposity. It was physiologically and biochemicaly characterized in detail as well as its dependence on different food types (high-fat and carbohydrate-modified diet). Within this work the hydrolysis of the orexigenic peptide galanin by NEP was described for the first time. A first explanatory approach to the development of the obese phenotype in NEP knockout-mice as well as the suitability of this animal model as a model of the complex human obesity is discussed.

Die Bildung von Amyloidablagerungen ist ein Kennzeichen der Alzheimerschen Erkrankung. Hauptbestandteil dieser senilen Plaques sind sogenannte A beta Peptide, die durch proteolytische Prozessierung aus einem Vorläufermolekül (APP) gebildet werden. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Klonierung des Meerschweinchen - APP. Diese cDNA-Sequenz zeigt auf DNA-Ebene eine Homologie zum Human-APP von ca. 90%, auf Proteinebene beträgt die Identität ca. 97 %. Damit wird ein weiterer experimenteller Beweis für die evolutionäre Konservierung des Amyloidvorläuferproteins in Säugetieren erbracht. APP mRNA wird in Meerschweinchen-Geweben ubiquitär exprimiert. Durch alternatives Spleißen wird ein zum Human-APP im wesentlichen ähnliches Isoformenmuster gebildet: Isoformen, welche eine Proteaseinhibitordomäne enthalten, werden dominierend in peripheren Organen exprimiert, dagegen ist im Zentralnervensystem das APP 695 mit über 60 % der Gesamttranskripte die bevorzugt exprimierte Isoform. Die klonierte cDNA des Meerschweinchen-APP wurde in prokaryontischen wie auch eukaryontischen Zellsystemen exprimiert. Dabei wurde die Eignung einer Anzahl von gegen Human-APP gewonnenen Antikörpern zur Detektion des Meerschweinchen-APP und seiner Prozessierungsprodukte gezeigt. Die Expression der neuronal dominierend exprimierten Isoform APP 695 des Meerschweinchen-APP in humanen Neuroblastom-Zellen zeigte keine Unterschiede hinsichtlich der APP-Prozessierung und A beta-Bildung im direkten Vergleich zu Human-APP 695. Die proteolytische Prozessierung des Proteins wurde durch Detektion der typischen Spaltprodukte in vivo (im Liquor) als auch in einem neu etablierten in vitro-Modell primär kultivierter neuronaler Zellen untersucht. Diese Zellkulturen wurden zunächst immunhistochemisch und biochemisch charakterisiert und als "mixed brain"-Typ mit einem hohen neuronalen Anteil beschrieben. Die Prozessierung des endogenen Meerschweinchen-APP in kultivierten Zellen führt dabei zur Bildung und Akkumulation aggregationsfähiger A beta - Peptide. Zur Detektion dieser Peptide wurde ein sensitiver Nachweis durch Western-Blot etabliert. Es wird damit ein Modellsystem für in vitro-Untersuchungen vorgeschlagen, welches ein Studium der Expression und Prozessierung des Amyloidvorläuferproteins unter angenähert physiologischen Bedingungen ermöglicht. / A beta peptides, the major component of neuritic plaques found in the brains of patients with Alzheimer’s disease, are derived by proteolytic processing from a larger precursor molecule (amyloid precursor protein - APP). A combination of PCR methods was used to clone and sequence APP cDNA from guinea pig (Cavia porcellus). Guinea pig APP exhibits extensive similarities to human APP in terms of primary structure, mRNA expression of differentially spliced isoforms as shown by Northern blot and RT-PCR analysis as well as proteolytic processing to amyloidogenic A beta peptides. In contrast to rat and mouse APP, guinea pig APP - recombinantly expressed in human neuroblastoma-cells - was processed indistinguishable from human APP thus excluding intrinsic sequence-specific factors influencing processing. Further studies were performed using newly established primary cell cultures of guinea pig neurons. Refined methods have been used to detect and characterize major proteolytic processing products of APP in vitro and in vivo. In conclusion, guinea pigs provide a model to study expression and processing of APP that closely resembles the physiological situation in humans and should, therefore, be important in elucidating potential strategies to prevent amyloid formation in Alzheimers Disease.

Grundlage der vorgelegten Arbeit sind die bei der Alzheimerschen Erkrankung beobachtbaren pathologischen Merkmale, wie die progressive Akkumulation von β-Amyloid-Plaques, cholinerger Dysfunktion und zerebrovaskuläre Abnormalitäten. Die in englischer Sprache verfasste Dissertation ist eine tierexperimentelle Studie, die versucht, den Zusammenhang von β-Amyloid, cholinerger Neurotransmission und zerebralem Gefäßsystem bei der Alzheimerschen Erkrankung näher zu charakterisieren. An Hirnmaterial aus der transgenen Maus Tg2576, die die schwedische Mutation des humanen Amyloidpräkursorproteins als Transgen trägt und ab dem 10. Lebensmonat durch humane β-Amyloid-Plaqueablagerungen in der Hirnrinde imponiert, wurden im Altersverlauf (4 bis 18 Monate) immunhistochemische Untersuchungen zur morphologischen Integrität der zerebralen Mikrogefäße, der kortikalen cholinergen Nervterminalen und der intrazerebralen cholinergen neurovaskulären Innervation durchgeführt. Am somatosensorischen Kortex werden beispielhaft die Expression des Glukosetransporters 1 oder Solanum tuberosum Lektin als Kapillarmarker und des vesikulären Acetylcholintransporters als Marker für cholinerge Fasern mittels Immunfluoreszenz und Laser-Scanning Mikroskopie erfasst, einer semiquantitativen Computer-gestützten Bildanalytischen Auswertung unterzogen und mit dem Ausmaß der kortikalen Plaquebeladung korreliert. So konnte gezeigt werden, dass die Dichte der Blutgefäße und cholinergen Fasern im somatosensorischen Kortex von transgenen Tieren mit dem Alter im Vergleich zu nichttransgenen Kontrolltieren abnimmt, was mit einer Reduktion der perivaskulären cholinergen Innervation einhergeht. Die erhobenen Befunde stützen die von J.C. de la Torre und T. Mussivand schon im Jahre 1993 formulierte „vaskuläre Hypothese“, wonach bei der sporadischen Form der Alzheimerschen Erkrankung alters- und Lebensstil-bedingte Schädigungen des zerebralen Gefäßsystems eine zentrale Rolle bei der Manifestierung der Erkrankung spielen.