Das Amyloid-beta Peptid (Ab) ist der Hauptbestandteil der extrazellulären Plaques bei der Alzheimerschen Krankheit. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Mechanismen der Wechselwirkungen des Ab mit der Plasmamembran und der nachfolgenden zellulären Aufnahme aufzuklären. Die Aggregation, die zelluläre Aufnahme und die Zytotoxizität von Ab42 wurden durch Verwendung von fluoreszenzmarkierten Ab42 in einem Neuroblastomzellkulturmodell untersucht. Sowohl bei Inkubation mit Monomeren als auch mit Aggregaten wurde in den Zellen Ab42 detektiert. Dabei binden Ab42 Monomere und kleine Aggregate zunächst an die Zellmembran. Allerdings erfolgt keine direkte Aufnahme von Monomeren in die Zelle. Erst nach Ausbildung von Aggregaten mit geordneter Sekundärstruktur wurde Ab42 in den endozytotischen Vesikel detektiert. Voraussetzung für den an der Membran ablaufenden Aggregationsprozess ist, dass die Monomere oberhalb einer kritischen Konzentration anwesend sind, um eine Bildung von beta-Faltblatt-Strukturen (bF) und entsprechenden Aggregaten zu ermöglichen. Ab42 Aggregate, die sich durch eine bF auszeichneten, benötigten keine kritische Schwellenkonzentration für die endozytotische Aufnahme. Eng mit der Aufnahme von Ab42 Aggregaten war die Veränderung des zellulären Metabolismus verbunden. Um die Wechselwirkung zwischen Ab und der Membrannäher zu charakterisieren, wurden Modellmembransystemen einschl. riesigen Membranvesikeln genutzt. Dabei wurde beobachtet, dass sowohl Ab42 als auch Ab40 Einstülpungen in der Membran induzieren können. Kleine Aggregate beider Isoformen, die noch keine bF aufweisen, interagierten bevorzugt mit der ungeordneten Lipidphase und induzierten dabei eine negative Membrankrümmung. Diese Beobachtungen legen den Schluss nahe, dass möglicherweise das Ab selbst den endozytotischen Prozess unterstützt oder diesen sogar einleiten könnte. Dies könnte auch auf eine mögliche physiologische Funktion von Ab Aggregaten, die nicht toxisch sind, hindeuten. / The accumulation of Amyloid beta peptide 1-42 (Ab42) in extracellular plaques is one of the pathological hallmarks of Alzheimer’s disease. Several studies have suggested that a cellular reuptake of Ab42 may be a crucial step in its cytotoxicity, but mechanisms of Ab-membrane interaction and subsequent cellular uptake are not yet understood. The first aim of the present study is to answer the question whether aggregate formation is a prerequisite or a consequence of Ab-membrane interaction and of Ab endocytosis. We visualized aggregate formation of fluorescently labeled Ab42 by Förster resonance energy transfer and tracked its internalization by human neuroblastoma cells. Both monomeric and aggregated Ab42 entered the cells, however, monomer uptake faced a concentration threshold and occurred only at concentrations and time scales that allowed beta-sheet-rich (bS) aggregates to form. By uncoupling membrane binding from internalization, we found that Ab42 monomers as well as small aggregate species bound rapidly to the plasma membrane and formed bS aggregates. These structures were subsequently taken up and accumulated in endocytic vesicles. This process correlated with inhibition of cellular metabolism activities. Our data therefore imply that the formation of bS aggregates at the cell membrane is a prerequisite for Ab42 uptake and cytotoxicity. The second aim of the study is to investigate the Ab-membrane interaction in vitro by using giant unilamellar vesicles and giant plasma membrane vesicles as model membrane systems. We found that both Ab isoforms, Ab42 and Ab40, interacted with the liquid disordered phase of model membranes. Early aggregation intermediates, which did not yet bind to the amyloiddophilic dye Thioflavin T, induced negative membrane curvature. The ability of Ab to induce membrane deformation suggests that Ab may facilitate its own endocytosis. It also hints at a possible physiological function of non-toxic Ab aggregate species.

Der bedeutendste Risikofaktor für die Demenz vom Azheimer Typ (DAT) ist, neben dem Alter, der Besitz des e4-Allels des Lipidtransportmoleküls Apolipoprotein E (APOE, Gen; ApoE, Protein). Neben funktionellen Unterschieden der Isoformen könnte auch die quantitative Verfügbarkeit des Proteins bei der Pathogenese der DAT eine Rolle spielen. Da ApoE als Lipidtransporter insbesondere bei plastischen Umbauprozessen in Gehirn wichtig sein könnte, wurde der Proteingehalt in Bezug auf die Schwere der DAT-assoziierten Veränderungen entsprechend der neuropathologischen Stadieneinteilung nach Braak untersucht. Neben ApoE wurde auch Apolipoprotein D (ApoD) in der Pathogenese der DAT diskutiert. Um herauszufinden, ob es hier eine Beziehung zur Schwere der neuropathologischen Veränderungen und/oder dem APOE-Polymorphismus gibt, wurde auch der ApoD-Gehalt untersucht. Bestimmt wurde der Apolipoproteingehalt in 104 nach Alter, Geschlecht, Braak-Stadium und APOE-Genotyp abgeglichenen Hippokampusproben, da diese Hirnregion im Verlauf einer Demenz früh und nachhaltig betroffen ist. Die Daten zeigen einen Anstieg von ApoE in den frühen Stadien der Erkrankung, in denen neuroplastische Reparationsvorgänge nachweisbar sind, und eine kontinuierliche Zunahme des ApoD-Gehalts mit der Schwere der neurofibrillären Veränderungen in den APOE e3/3-Proben. In den Proben, die das Risikoallel APOE e4 trugen, waren keine statistisch signifikanten Veränderungen nachweisbar. / The most important risk factor for Alzheimer´s disease (AD), besides age, is the inheritance of the e4-allele of the lipid transporting apolipoprotein E (APOE, gen; apoE, protein). Apart from functional differences of the apoE isoforms, the quantitative availability of the protein might be important in AD pathogenesis. As a lipidtransporter, apoE should be relevant especially during plastic response of neuronal structures. Hence, apoE levels were investigated in correlation to the severity of pathological changes as staged according to the neuropathological Braak classification of AD. Besides apoE, apolipoprotein D (apoD) is discussed in AD pathogenesis. To clarify whether there is a correlation to AD related neuropathological changes, apoD levels were also determined. The apolipoproteins were determined in 104 age-, gender-, Braak stage- and APOE genotype-matched samples of hippocampal protein extracts because this brain region is early and enduring affected by the disease. The data show an increase in apoE in the early stages of the disease where plastic remodelling occurs and a continuous increase in apoD with the severity of neurofibrillary changes in the APOE e3/3-group only. No statistically relevant changes were observed in samples carrying the AD-risk allele e4.

Die Alzheimer Krankheit ist die häufigste Altersdemenz. Ein spezifisches pathologisches Merkmal der Alzheimer Krankheit ist die Amyloid-Ablagerung im Gehirn. Die Hauptkomponente der so genannten Amyloid-Plaques ist das Amyloid beta-Peptid (A-beta). A-beta entsteht durch sequenzielle proteolytische Spaltung aus einem membrangebundenen Vorläuferprotein, dem beta-APP (betaamyloid precursor protein). Die kürzlich identifizierte beta-Sekretase (BACE, beta-site APPcleaving enzyme) generiert den Schnitt am N-Terminus von A-beta. Es entsteht ein C-terminales, membrangebundenes beta-APP-Fragment, das beta-APP-CTF. Beta-APP-CTF ist das direkte Substrat für die gamma-Sekretase, die innerhalb der Membrandomäne schneidet, wodurch A-beta freigesetzt wird. In der vorliegenden Arbeit kann erstmalig gezeigt werden, dass BACE auf dem sekretorischen Transportweg aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER), über den Golgi-Apparat zur Zelloberfläche transportiert wird. Auf dem Transport wird BACE durch N-Glycosylierung und Propeptidabspaltung posttranslational modifiziert. BACE wird im ER N-glycosyliert und die mannosereichen Zucker werden auf dem Transport durch den Golgi-Apparat in Endoglycosidase H resistente Zucker des komplexen Typs modifiziert. Die Propeptidabspaltung, durch Furin oder furinähnliche Propeptidkonvertasen, findet unmittelbar vor dem Aufbau der komplexen Zucker statt. Ferner konnte gezeigt werden, dass der Transport von BACE die A-beta-Entstehung limitieren kann. In polarisierten Madin-Darby canine kidney (MDCK) Zellen wird BACE überwiegend zur apikalen Plasmamembran transportiert und damit entgegengesetzt zu seinem Substrat beta-APP. Der gegensätzliche Transport von BACE und beta-APP begrenzt die A-beta Entstehung. Wird der apikale Transport von beta-APP durch Deletion seines basolateralen Sortierungssignals erhöht, entsteht vermehrt A-beta. Der differenzielle Transport von BACE und beta-APP könnte ein Hinweis darauf sein, dass beta-APP nicht das physiologische Substrat von BACE ist. / Alzheimer`s disease is the most common cause of progressive cognitive decline in the aged population. Pathologically Alzheimer`s disease is characterized by the invariant accumulation of senile plaques. Senile plaques are predominantly composed of the amyloid beta-peptide (A-beta), which is derived from the membrane bound beta-amyloid precursor protein (beta-APP) by sequential proteolytic cleavage. The recently identified beta-secretase (BACE) is responsible for the cleavage at the N-terminus of the A-beta domain. This cleavage generates membrane-bound beta-APP-Cterminal fragments (beta-APP-CTF) which are the immediate precursor for gamma-secretase cleavage and therefore for liberation of A-beta. The present work shows that BACE moves along the secretory pathway, while it undergoes post-translational modifications, which can be monitored by a significant increase in the molecular mass and cleavage of its pro-peptide. BACE becomes N-glycosylated within the ER and the increase in molecular mass is caused by complex N-glycosylation. The mature form of BACE is resistant to endoglycosidase H treatment; this indicates that BACE traffics through the Golgi. Furthermore the mature form of BACE does not contain the pro-peptide anymore. Pro-BACE is predominantly located within the endoplasmic reticulum. Pro-peptide cleavage occurs immediately before full maturation by furin or a furin-like proprotein convertase. Moreover traffic of BACE can limit A-beta generation. In the well established model system of polarized Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells, the majority of BACE is sorted to the apical domain. Interestingly it has been shown previously that the substrate of BACE, beta-APP is transported to the basolateral surface of MCDK cells. Therefore, substantial amounts of BACE are targeted away from beta-APP to a non-amyloidogenic compartment, a cellular mechanism that limits A-beta generation. Upon deletion of the basolateral sorting signal of beta-APP, apically missorted beta-APP is processed by BACE. The differential targeting of BACE and its substrate beta-APP suggest that beta-APP might not be the major physiological substrate of BACE.

Als Metallopeptidase mit einem großen Substratspektrum hat die Neutrale Endopeptidase (Neprilysin, EC 3.4.24.11, NEP) Einfluss auf so verschiedene Krankheiten oder pathophysiologischen Vorgänge wie Hypertonie, die Alzheimersche Erkrankung oder krankhafte Prostataveränderungen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Beziehungen der NEP zur Alzheimerschen Erkrankung sowie zu zwei weiteren pathophysiologischen Veränderungen – einem erhöhten Alkoholkonsum unter Stress sowie zu Adipositas/Übergewicht – eingehend untersucht. In Bezug auf die Alzheimersche Erkrankung wurde der Frage nachgegangen, warum Mäuse und Ratten keine vollständige Alzheimer-Symptomatik ausbilden. Dabei wurde ein verlangsamter Abbau des murinen beta-Amyloid-Peptids im Gegensatz zur humanen Form gefunden und biochemisch charakterisiert. Diese Befunde wurden durch den Nachweis, dass das murine im Gegensatz zum humanen Abeta-Peptid keine Amyloidfibrillen ausbildet, komplettiert. Am Modell der NEP-Knockout-Maus wurde in freiwilligen Trinkversuchen ein Alkoholverbrauch beobachtet, der dem von C57BL6-Wildtyp-Mäusen vergleichbar war. Nach einem kurzzeitigen sozialen Stress nahm jedoch der Alkoholkonsum der NEP-Knockout-Mäuse für ca. 3 Wochen deutlich und nach einem weiteren Stress sogar für mehrere Monate zu. An NEP-Knockout-Mäusen wurde überdies erstmals ein übergewichtiger Phänotyp beschrieben, der der menschlichen polygenetischen Adipositas sehr ähnlich ist. Dieser Phänotyp wurde eingehend physiologisch und biochemisch sowie in Abhängigkeit von verschiedenen Futtersorten (fettreiche bzw. Kohlenhydrat-modifizierte Nahrung) charakterisiert. In diesem Rahmen wurde erstmals die Hydrolyse des orexigenen Peptids Galanin durch die NEP beschrieben. Erste Erklärungsansätze für die Ausprägung des übergewichtigen Phänotyps bei NEP-Knockout-Mäusen sowie die Eignung dieses Tiermodells als Modell der komplexen humanen Adipositas werden diskutiert. / As a metallopeptidase with a large substrate spectrum neutral endopeptidase (Neprilysin, EC 3.4.24.11, NEP) influences diseases or pathophysiological states as different as hypertonia, Alzheimer’s disease or pathologic changes of the prostate. In this work the relations of NEP to Alzheimer’s disease and to two other pathophysiologic changes – an increased alcohol consumption under stress conditions as well as to adiposity/obesity – were examined in detail. Regarding Alzheimer’s disease the question was addressed why mice and rats do not show a complete Alzheimer’s pathology. The hydrolytic rate of the murine beta-Amyloid peptide was found to be decreased in contrast to the human form. The hydrolysis was further characterized by biochemistry. These findings were completed by the confirmation that murine abeta peptide does not form amyloid fibrils in contrast to the human peptide. By using the NEP knockout-mouse model in a free-choice drinking paradigm these mice showed an alcohol consumption comparable to that of C57BL6 wildtype mice. However, after a temporary social stress the alcohol consumption of the NEP knockout-mice increased for approx. 3 weeks and after a further stress it remained on a higher level for several months. Moreover, an obese phenotype of NEP knockout-mice was described here for the first time. This phenotype was found to be very similar to the human polygenetic adiposity. It was physiologically and biochemicaly characterized in detail as well as its dependence on different food types (high-fat and carbohydrate-modified diet). Within this work the hydrolysis of the orexigenic peptide galanin by NEP was described for the first time. A first explanatory approach to the development of the obese phenotype in NEP knockout-mice as well as the suitability of this animal model as a model of the complex human obesity is discussed.

Verhaltensstörungen bei Demenz sind von zentraler klinischer Bedeutung. Zur Beurteilung solcher Phänomene liegen eine Anzahl standardisierter Beobachtungsbögen vor. Problematisch sind diese Skalen im Hinblick auf ihre Reliabilität bei der Anwendung durch Angehörige und Pflegende. Wir schlagen daher die aktometrische Darstellung von motorischer Aktivität, wie sie etwa aus der Schlafforschung bekannt ist, vor. In dieser Dissertation wurde zunächst die Reliabilität und konkurrente Validität der Messung von motorischer Unruhe bei Demenz mittels eines aktometrischen Gerätes untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die aktometrische Messung von Verhaltensstörungen eine valide und reliable Methode auch bei schwerer Demenz darstellt. Im zweiten Teils dieser Arbeit wurde unter quasiexperimenteller Kontrolle von Modulatoren der circadianen Rhythmizität Unterschiede der circadianen Rhythmik zwischen vaskulärer Demenz und Demenz vom Alzheimer-Typ untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass es bei Patienten mit Demenz vom Alzheimer-Typ und bei Patienten mit vaskulärer Demenz in Abhängigkeit von der motorischen AktivitŠt zu einer charakteristischen Phasenverschiebung der circadianen Rhythmik kommt. Dieser Zusammenhang ist jedoch bei Alzheimer-Demenz, bei der von einer neurobiologischen Störung des suprachiasmatischen Nukleus ausgegangen werden kann, stärker ausgeprägt. Dieses Befundmuster unterstützt theoretische Modelle der circadianen Rhythmik und ihrer Störung bei Demenz und legt nahe, dass der suprachiasmatischen Nukleus bei Demenz vom Alzheimer-Typ eine zentrale Rolle bei der circadianen Regulation des Verhaltens einnimmt. / Behavioural signs and symptoms in dementia are of central clinical significance. There are a number of standardised rating scales available for the assessment of motor phenomena in dementia. However, there is no objective method of assessing these symptoms. In addition, the reliability of these scales, especially when used by caregivers from within families, has been questioned. In order to overcome this flaw, we propose the use of an actometric device for assessing behaviour motor symptoms in dementia. In the first part of this dissertation we assessed the reliability and the concurrent validity of an actometric device against two behavioural scales. Results show satisfactory validity and good reliability of this method. In the second part of this dissertation, we reanalysed data from our validation study, investigating whether the pattern of circadian rhythm disturbances is different in patients suffering from Alzheimer disease and patients suffering from vascular dementia, controlling experimentally for the severity of behaviour disturbances. With regards to circadian motor activity, we found increased nocturnal activity and fragmentation of diurnal rhythm in both groups. In patients showing an equal severity of behaviour disturbances, the phase-delay of the rest-activity rhythm was delayed in patients with Alzheimer disease as compared to patients with vascular dementia. These findings suggest that, in Alzheimer disease, structural changes in the SCN might induce disturbance in the circadian pacemaker, leading to a phase shift in the circadian rhythm. The differential pattern of rhythm disturbance found in this study could be indicative of different processes involved in sleep disorders in the dementias.

In dieser Doktorarbeit wird die Frage untersucht, wie erfolgreich deep learning bei der Diagnostik von neurodegenerativen Erkrankungen unterstützen kann. In 5 experimentellen Studien wird die Anwendung von Convolutional Neural Networks (CNNs) auf Daten der Magnetresonanztomographie (MRT) untersucht. Ein Schwerpunkt wird dabei auf die Erklärbarkeit der eigentlich intransparenten Modelle gelegt. Mit Hilfe von Methoden der erklärbaren künstlichen Intelligenz (KI) werden Heatmaps erstellt, die die Relevanz einzelner Bildbereiche für das Modell darstellen. Die 5 Studien dieser Dissertation zeigen das Potenzial von CNNs zur Krankheitserkennung auf neurologischen MRT, insbesondere bei der Kombination mit Methoden der erklärbaren KI. Mehrere Herausforderungen wurden in den Studien aufgezeigt und Lösungsansätze in den Experimenten evaluiert. Über alle Studien hinweg haben CNNs gute Klassifikationsgenauigkeiten erzielt und konnten durch den Vergleich von Heatmaps zur klinischen Literatur validiert werden. Weiterhin wurde eine neue CNN Architektur entwickelt, spezialisiert auf die räumlichen Eigenschaften von Gehirn MRT Bildern. / Deep learning and especially convolutional neural networks (CNNs) have a high potential of being implemented into clinical decision support software for tasks such as diagnosis and prediction of disease courses. This thesis has studied the application of CNNs on structural MRI data for diagnosing neurological diseases. Specifically, multiple sclerosis and Alzheimer’s disease were used as classification targets due to their high prevalence, data availability and apparent biomarkers in structural MRI data. The classification task is challenging since pathology can be highly individual and difficult for human experts to detect and due to small sample sizes, which are caused by the high acquisition cost and sensitivity of medical imaging data. A roadblock in adopting CNNs to clinical practice is their lack of interpretability. Therefore, after optimizing the machine learning models for predictive performance (e.g. balanced accuracy), we have employed explainability methods to study the reliability and validity of the trained models. The deep learning models achieved good predictive performance of over 87% balanced accuracy on all tasks and the explainability heatmaps showed coherence with known clinical biomarkers for both disorders. Explainability methods were compared quantitatively using brain atlases and shortcomings regarding their robustness were revealed. Further investigations showed clear benefits of transfer-learning and image registration on the model performance. Lastly, a new CNN layer type was introduced, which incorporates a prior on the spatial homogeneity of neuro-MRI data. CNNs excel when used on natural images which possess spatial heterogeneity, and even though MRI data and natural images share computational similarities, the composition and orientation of neuro-MRI is very distinct. The introduced patch-individual filter (PIF) layer breaks the assumption of spatial invariance of CNNs and reduces convergence time on different data sets without reducing predictive performance. The presented work highlights many challenges that CNNs for disease diagnosis face on MRI data and defines as well as tests strategies to overcome those.