Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_8805_TESE WALKÍRIA.pdf: 5771036 bytes, checksum: 6f45c5743cc1f2e65059ae28ce2eee7c (MD5) Previous issue date: 2016-09-27 / O Pineapple mealybug wilt-associated virus (PMWaV) em associação com a cochonilha Dysmicoccus brevipes tem sido reportado como a causa da murcha do abacaxizeiro. A disseminação do vírus ocorre principalmente através de material propagativo infectado e assintomático. Neste trabalho foi validada uma metodologia por PCR em tempo real, como estratégia, para o diagnóstico dos vírus: PMWaV-1, PMWaV-2 e PMWaV-3, em abacaxizeiro. Folhas de plantas adultas e mudas de abacaxizeiro das cultivares Smooth Cayenne, Pérola e Vitória foram analisadas por RT-PCR convencional e em tempo real. Cochonilhas D. brevipes provenientes de plantas com sintomas de murcha também foram analisadas. Genes específicos para cada vírus foram obtidos em resposta a infecção. Análise in silico identificou quatro genes de referência para folhas e material propagativo de abacaxizeiro sob estresse biótico. O vírus PMWaV-3 foi prevalente nas plantas sintomáticas e assintomáticas, enquanto que o PMWaV-2 foi encontrado nos abacaxizeiros assintomáticos, e associado vírus PMWaV-3 nas plantas doentes. O vírus PMWaV-1 não mostrou relação direta com a doença. Observou-se que o estado nutricional da planta interferiu na manifestação dos sintomas e na presença do PMWaV-2. Os três vírus foram detectados em amostras da cochonilha D. brevipes. Confirmou-se também a transmissão dos vírus por esta espécie de cochonilhas, porém, não foi vetor eficiente para o PMWaV-1. Com este estudo disponibilizou-se um método de diagnóstico que atende as exigências fitossanitárias para indexação e certificação quarentenária de mudas comerciais. Isso contribui para prevenir a disseminação do vírus em material propagativo para novas áreas e uma ferramenta para estudo epidemiológico da doença. Essa é a primeira validação de um método rápido, sensível e específico, capaz de detectar os três vírus do PMWaV em plantas em abacaxizeiros assintomáticos e sintomáticas. Palavras chaves: Ananas comosus var. comosus, material propagativo, PCR tempo real, housekeeping, Dysmicoccus brevipes.

O ciclo estral das cadelas difere das demais espécies domésticas. Estudos demonstraram que o aumento da concentração plasmática de P4 durante a fase luteínica das cadelas pode levar a alterações metabólicas como a resistência insulínica, acarretando complicações como Diabetes mellitus. A glicose é uma molécula transportada, na maioria das células, por proteínas transportadoras. O processo de instalação da resistência insulínica é caracterizado por alterações teciduais da expressão de algumas proteínas transportadoras de glicose, como o GLUT4. Atualmente 13 isoformas de proteínas transportadoras já foram seqüenciadas (GLUT1 ao GLUT13). O GLUT4 está presente nos músculos e no tecido adiposo, principalmente. Para avaliar se a expressão do GLUT 4 está presente nas células luteínicas e se esta expressão relaciona-se à produção de P4 e E2, 28 cadelas foram divididas em 7 grupos de acordo com os dias após a ovulação -p.o. (de 10 à 70 dias, n = 4 por grupo). Os ovários foram dissecados e congelados em nitrogênio líquido, o RNA extraído e o cDNA confeccionado e submetido ao PCR em tempo real. O gene GAPDH foi utilizado como controle endógeno para padronização da expressão do gene alvo. Foi coletado sangue para dosagem da glicemia, insulinemia, progesterona e estradiol. Para avaliar a regulação positiva do GLUT4 avaliamos também a expressão do mRNA do HIF-1α, destas mesmas cadelas. A expressão do GLUT4 apresentou tendência a aumento de expressão aos 20 dias (p. o.), quando comparado aos 10, 30 e 40 dias, pico de expressão aos 50 dias (p.o.), e então apresentou tendência a queda aos 60 e 70 dias p.o. Já a expressão do HIF-1α manteve-se muito semelhante através dos dias, tendendo a queda aos 10 e aos 40 dias pós ovulação, quando comparado com os demais grupos. Os resultados de dosagem de P4 e E2 variaram dentro do esperado para o diestro e não apresentaram correlação com a expressão de GLUT 4; a glicemia e insulina, aqui expressas através do índice HOMA (insulina x glicose % 22,5), apresentou pico aos 40 dias. Sabe-se que quanto mais alto o índice HOMA, menos este animal é sensível à insulina, ou seja, mais resistente à ela. Observou-se que o índice HOMA apresentou-se mais alto aos 40 dias, associado aos menores valores de expressão do GLUT4. Por outro lado, obtivemos o pico de expressão de GLUT4 aos 50 dias, quando o índice HOMA apresentou valores baixos. Sugere-se que a queda da P4 associada à elevação do estradiol plasmático possa influenciar o índice HOMA. Pode-se concluir que a expressão do GLUT4 no corpo lúteo de cadelas segue o padrão observado para tecidos sensíveis à insulina, nos quais existe uma maior expressão durante a fase de maior sensibilidade à insulina e diminuição drástica em fase de pré ou já instalada resistência insulínica. / The canine estral cycle differs from other domestic species. Some studies demonstrated that the increase of the plasmatic concentration of progesterone during canine luteinic phase can lead to metabolic alterations, such as insulinic resistance and may cause complications such as Diabetes mellitus. Glucose is a molecule that is transported in most cells by transporting proteins. The process of installation of the insulinic resistance is characterized by tissue alterations of the expression of some glucose transporting proteins, as GLUT4. Currenly, 13 isoforms of transporting proteins were sequenced (GLUT1 to GLUT13). GLUT4 is present mainly in muscle and fat tissue. In order to assess if GLUT4 expression is present in luteal cells, and if this expression is related to P4 and E2 production, 28 bitches were divided into 7 groups, in accordance with the days after the ovulation -p.o. (from 10 to 70 days, n=4 for group). The ovaries were dissected and frozen in liquid nitrogen. The RNA was extracted and the cDNA was made and submitted to real time PCR. GAPDH gene was used as endogenous conntrol to standardization of target gene expression. Blood was collected to glycemia, insulinemia, P4, and E2β dosage. To assess the positive regulation of GLUT4, we also assessed HIF-1α mRNA expression of the same bitches. GLUT4 expression showed a tendency to increase the expression on the twentieth day (p.o.), when compared to the 10th, 30th, and 40th days, expression top on the 50 th day (p.o.) , and then, it showed a tendency to foll on the 60th and 70th days p.o. HIF-1α expression was very similar over the days, tending to fall on the 10th and 40th days post ovulation, when compared to other groups. P4 and E2β dosage results varied according to thr expectations in diestrus and have not shown correlation with GLUT4 expression; glycemia and insulin, here expressed by HOMA index (insulin x glucose % 22,5) showed crest (highest point) on the 40 th day. It is knows that the higher the HOMA index, the less sensitive this animal is to insulin, it is, more resistant to it. It was observed that HOMA index was higher on the 40th day, associated to small values of the GLUT4 expression. Otherwise, the got the top of GLUT4 expression on the 50th day, when HOMA index showed low values. It has been suggested that P4 fall associated to the plasmatic E2 increase may influence HOMA index. We may conclude that GLUT4 expression into the corpus luteum of bitches follows the standard observed in insulin-sensitive tissues, in which there is a higher expression over the phase of higher sensitiveness to insulin and remarkable decrease in pre or even installed insulinic resistance.

O ciclo estral das cadelas difere das demais espécies domésticas. Estudos demonstraram que o aumento da concentração plasmática de P4 durante a fase luteínica das cadelas pode levar a alterações metabólicas como a resistência insulínica, acarretando complicações como Diabetes mellitus. A glicose é uma molécula transportada, na maioria das células, por proteínas transportadoras. O processo de instalação da resistência insulínica é caracterizado por alterações teciduais da expressão de algumas proteínas transportadoras de glicose, como o GLUT4. Atualmente 13 isoformas de proteínas transportadoras já foram seqüenciadas (GLUT1 ao GLUT13). O GLUT4 está presente nos músculos e no tecido adiposo, principalmente. Para avaliar se a expressão do GLUT 4 está presente nas células luteínicas e se esta expressão relaciona-se à produção de P4 e E2, 28 cadelas foram divididas em 7 grupos de acordo com os dias após a ovulação -p.o. (de 10 à 70 dias, n = 4 por grupo). Os ovários foram dissecados e congelados em nitrogênio líquido, o RNA extraído e o cDNA confeccionado e submetido ao PCR em tempo real. O gene GAPDH foi utilizado como controle endógeno para padronização da expressão do gene alvo. Foi coletado sangue para dosagem da glicemia, insulinemia, progesterona e estradiol. Para avaliar a regulação positiva do GLUT4 avaliamos também a expressão do mRNA do HIF-1α, destas mesmas cadelas. A expressão do GLUT4 apresentou tendência a aumento de expressão aos 20 dias (p. o.), quando comparado aos 10, 30 e 40 dias, pico de expressão aos 50 dias (p.o.), e então apresentou tendência a queda aos 60 e 70 dias p.o. Já a expressão do HIF-1α manteve-se muito semelhante através dos dias, tendendo a queda aos 10 e aos 40 dias pós ovulação, quando comparado com os demais grupos. Os resultados de dosagem de P4 e E2 variaram dentro do esperado para o diestro e não apresentaram correlação com a expressão de GLUT 4; a glicemia e insulina, aqui expressas através do índice HOMA (insulina x glicose % 22,5), apresentou pico aos 40 dias. Sabe-se que quanto mais alto o índice HOMA, menos este animal é sensível à insulina, ou seja, mais resistente à ela. Observou-se que o índice HOMA apresentou-se mais alto aos 40 dias, associado aos menores valores de expressão do GLUT4. Por outro lado, obtivemos o pico de expressão de GLUT4 aos 50 dias, quando o índice HOMA apresentou valores baixos. Sugere-se que a queda da P4 associada à elevação do estradiol plasmático possa influenciar o índice HOMA. Pode-se concluir que a expressão do GLUT4 no corpo lúteo de cadelas segue o padrão observado para tecidos sensíveis à insulina, nos quais existe uma maior expressão durante a fase de maior sensibilidade à insulina e diminuição drástica em fase de pré ou já instalada resistência insulínica. / The canine estral cycle differs from other domestic species. Some studies demonstrated that the increase of the plasmatic concentration of progesterone during canine luteinic phase can lead to metabolic alterations, such as insulinic resistance and may cause complications such as Diabetes mellitus. Glucose is a molecule that is transported in most cells by transporting proteins. The process of installation of the insulinic resistance is characterized by tissue alterations of the expression of some glucose transporting proteins, as GLUT4. Currenly, 13 isoforms of transporting proteins were sequenced (GLUT1 to GLUT13). GLUT4 is present mainly in muscle and fat tissue. In order to assess if GLUT4 expression is present in luteal cells, and if this expression is related to P4 and E2 production, 28 bitches were divided into 7 groups, in accordance with the days after the ovulation -p.o. (from 10 to 70 days, n=4 for group). The ovaries were dissected and frozen in liquid nitrogen. The RNA was extracted and the cDNA was made and submitted to real time PCR. GAPDH gene was used as endogenous conntrol to standardization of target gene expression. Blood was collected to glycemia, insulinemia, P4, and E2β dosage. To assess the positive regulation of GLUT4, we also assessed HIF-1α mRNA expression of the same bitches. GLUT4 expression showed a tendency to increase the expression on the twentieth day (p.o.), when compared to the 10th, 30th, and 40th days, expression top on the 50 th day (p.o.) , and then, it showed a tendency to foll on the 60th and 70th days p.o. HIF-1α expression was very similar over the days, tending to fall on the 10th and 40th days post ovulation, when compared to other groups. P4 and E2β dosage results varied according to thr expectations in diestrus and have not shown correlation with GLUT4 expression; glycemia and insulin, here expressed by HOMA index (insulin x glucose % 22,5) showed crest (highest point) on the 40 th day. It is knows that the higher the HOMA index, the less sensitive this animal is to insulin, it is, more resistant to it. It was observed that HOMA index was higher on the 40th day, associated to small values of the GLUT4 expression. Otherwise, the got the top of GLUT4 expression on the 50th day, when HOMA index showed low values. It has been suggested that P4 fall associated to the plasmatic E2 increase may influence HOMA index. We may conclude that GLUT4 expression into the corpus luteum of bitches follows the standard observed in insulin-sensitive tissues, in which there is a higher expression over the phase of higher sensitiveness to insulin and remarkable decrease in pre or even installed insulinic resistance.

No presente estudo, foi inicialmente padronizada uma PCR para detecção do DNA viral da semente de Parvovírus Canino utilizado na vacina brasileira Imunovet® (VR-953TM), tendo como alvo o gene VP2. O produto de PCR foi submetido ao seqüenciamento a fim de caracterizar geneticamente a semente vacinal. A seguir, foi padronizada uma reação de PCR em tempo real (RT-PCR) para detecção de um fragmento de 119 pb do gene VP2, a qual foi empregada para avaliar a cinética de replicação da amostra vacinal do CPV em diferentes métodos e tempos de cultivo celular. A correlação entre os resultados do título infeccioso das amostras virais e o número de cópias obtido na RT-PCR foi avaliado pelo Coeficiente de Correlação de Pearson. A PCR padronizada apresentou uma sensibilidade analítica de 457 DICC50/mL. O seqüenciamento do produto de PCR revelou que a amostra vacinal é do tipo CPV-2. A RT-PCR padronizada apresentou uma sensibilidade analítica de 1030 cópias de DNA/mL e uma boa especificidade analítica, pois não detectou o DNA de Adenovírus canino tipos 1 e 2 e Herpesvírus Equino tipo 1. A RT-PCR exibiu Coeficientes de Variação de triplicatas intra-ensaio de 0,43% e inter-ensaio de 0,29%. O Coeficiente de Correlação de Pearson entre o título infeccioso das amostras virais e o número de cópias obtido na RT-PCR foi de 0,55, considerado moderadamente positivo. Considerando que a região alvo da RT-PCR padronizada apresentou 100% de identidade com 93,52% (159/170) das amostras pesquisadas no GenBank pelo BLAST, a RT-PCR padronizada sugere ter um potencial uso no diagnóstico. / In this study, was originally a standard PCR for detection of viral DNA from the canine parvovirus vaccine seed used in Brazilian Imunovet® (VR-953TM), targeting the VP2 gene. The PCR product was subjected to sequencing to genetically characterized the vaccine seed. Then, a reaction was standardized real-time PCR (RT-PCR) to detect a fragment of 119 bp VP2 gene, which was used to evaluate the growth kinetics of the CPV vaccine sample in different methods and cell culture times. The correlation between results of the infectious titre and the number of copies obtained in RT-PCR was evaluated by Pearsons correlation coefficient. The standardized PCR showed an analytical sensitivity of 457 TCID50/mL. The sequencing of the PCR product showed that the vaccine sample is CPV type 2. The standardized RT-PCR showed an analytical sensitivity of 1030 DNA copies/mL and a good analytical specificity, it does not detect the DNA of canine adenovirus type 1 and 2 and equine herpesvirus type 1. The RT-PCR showed coefficients of variation intra-assay triplicates of 0,43% and inter-assay of 0,29%. The Pearsons correlation coefficient between the titre of infectious viral samples and the number of copies obtained in RT-PCR was 0,55, considered moderately positive. Whereas the target region of the standardized RT-PCR showed 100% identity with 93,52% (159/170) of samples surveyed in Genbank by BLAST, the standard RT-PCR suggests a potential diagnostic use.

No presente estudo, foi inicialmente padronizada uma PCR para detecção do DNA viral da semente de Parvovírus Canino utilizado na vacina brasileira Imunovet® (VR-953TM), tendo como alvo o gene VP2. O produto de PCR foi submetido ao seqüenciamento a fim de caracterizar geneticamente a semente vacinal. A seguir, foi padronizada uma reação de PCR em tempo real (RT-PCR) para detecção de um fragmento de 119 pb do gene VP2, a qual foi empregada para avaliar a cinética de replicação da amostra vacinal do CPV em diferentes métodos e tempos de cultivo celular. A correlação entre os resultados do título infeccioso das amostras virais e o número de cópias obtido na RT-PCR foi avaliado pelo Coeficiente de Correlação de Pearson. A PCR padronizada apresentou uma sensibilidade analítica de 457 DICC50/mL. O seqüenciamento do produto de PCR revelou que a amostra vacinal é do tipo CPV-2. A RT-PCR padronizada apresentou uma sensibilidade analítica de 1030 cópias de DNA/mL e uma boa especificidade analítica, pois não detectou o DNA de Adenovírus canino tipos 1 e 2 e Herpesvírus Equino tipo 1. A RT-PCR exibiu Coeficientes de Variação de triplicatas intra-ensaio de 0,43% e inter-ensaio de 0,29%. O Coeficiente de Correlação de Pearson entre o título infeccioso das amostras virais e o número de cópias obtido na RT-PCR foi de 0,55, considerado moderadamente positivo. Considerando que a região alvo da RT-PCR padronizada apresentou 100% de identidade com 93,52% (159/170) das amostras pesquisadas no GenBank pelo BLAST, a RT-PCR padronizada sugere ter um potencial uso no diagnóstico. / In this study, was originally a standard PCR for detection of viral DNA from the canine parvovirus vaccine seed used in Brazilian Imunovet® (VR-953TM), targeting the VP2 gene. The PCR product was subjected to sequencing to genetically characterized the vaccine seed. Then, a reaction was standardized real-time PCR (RT-PCR) to detect a fragment of 119 bp VP2 gene, which was used to evaluate the growth kinetics of the CPV vaccine sample in different methods and cell culture times. The correlation between results of the infectious titre and the number of copies obtained in RT-PCR was evaluated by Pearsons correlation coefficient. The standardized PCR showed an analytical sensitivity of 457 TCID50/mL. The sequencing of the PCR product showed that the vaccine sample is CPV type 2. The standardized RT-PCR showed an analytical sensitivity of 1030 DNA copies/mL and a good analytical specificity, it does not detect the DNA of canine adenovirus type 1 and 2 and equine herpesvirus type 1. The RT-PCR showed coefficients of variation intra-assay triplicates of 0,43% and inter-assay of 0,29%. The Pearsons correlation coefficient between the titre of infectious viral samples and the number of copies obtained in RT-PCR was 0,55, considered moderately positive. Whereas the target region of the standardized RT-PCR showed 100% identity with 93,52% (159/170) of samples surveyed in Genbank by BLAST, the standard RT-PCR suggests a potential diagnostic use.

Para obter resultados rápidos e confiáveis que permitam o monitoramento da segurança microbiológica de alimentos, seja pela indústria ou pelos órgãos de fiscalização, diversos métodos alternativos têm sido desenvolvidos para a detecção e quantificação de Salmonella. Os propósitos do estudo foram avaliar a viabilidade de emprego do QIAamp® DNA Stool Mini Kit para extração e purificação de DNA de Salmonella; validar ensaios baseados em PCR-tempo real (PCR-RT) para quantificar o DNA de Salmonella empregando ttr ou tuf e desenvolver um ensaio para quantificar Salmonella baseado na transcriptase reversa-PCR-tempo real (RT-PCR-RT). Para avaliação do QIAamp® DNA Stool Mini Kit empregaram-se fezes coletadas diretamente do reto de animais infectados ou não, sendo estas últimas artificialmente contaminadas e submetidas à extração segundo protocolo do fabricante. As amostras de DNA isoladas foram quantificadas empregando um ensaio Salmonella-específico PCR-RT utilizando como alvo o lócus ttr. O mesmo ensaio foi utilizado para células de Salmonella provenientes de meio de cultura. O ensaio PCR-RT baseado no alvo tuf foi validado empregando-se primeiramente cepas de diferentes sorotipos de Salmonella e de outras Enterobacteriaceae. A seguir sua eficiência foi avaliada para alimentos-modelo (ave e suíno) artificialmente contaminadas com elevada (≈ 6 log UFC/mL) e baixa (≈ 2 log UFC/mL) população de Salmonella Typhimurium DT 104. A validação do método quantitativo de Salmonella por RT-PCR-RT foi realizada primeiramente com células em meio de cultura e posteriormente nos mesmos alimentos-modelo utilizados para PCR-RT. Em ambos os métodos, alíquotas dos alimentos-modelo foram mantidas a 20 ºC e a 8 ºC, sendo examinadas em diferentes tempos pós-inoculação. Como controle empregou-se a enumeração de microrganismos mesófilos totais e de Salmonella por técnicas convencionais. A taxa de recuperação de Salmonella em fezes suínas artificialmente inoculadas, após tratamento com QIAamp® DNA Stool Kit, variou entre 25% a 50%, dependendo da quantidade inicial de células. Empregando o DNA extraído e submetendo-o à PCR-RT para o ttr obteve-se limite de detecção de 2,8 log UFC eq/g de fezes; método que foi menos sensível que o convencional. A quantificação de Salmonella por PCR-RT empregando tuf apresentou limite de detecção menor que 1 log UFC eq. Os resultados obtidos com este método, empregando-se células em meio de cultura ou alimentos-modelo, foram, de maneira geral, ligeiramente inferiores aos do método convencional. A eficiência de amplificação para PCR-RT e tuf foi de 94%. O método RT-PCR-RT apresentou limite de detecção semelhante ao obtido com o ttr (2 log UFC eq) e sua eficiência de amplificação foi de 100%. Observou-se que tuf é expresso na fase logarítmica de multiplicação bacteriana, o que o torna um bom indicador da viabilidade de Salmonella. / In order to get fast and trustworthy results that allow monitoring the microbiological food safety either by industries or governmental agencies, diverse alternative methods have been developed for Salmonella detection and quantification. The purposes of this study were to evaluate the viability of the use of QIAamp® DNA Stool Mini Kit for Salmonella DNA extraction and purification; to validate assays based on real time-PCR (PCR-RT) to quantify Salmonella DNA by using ttr or tuf, and to develop an assay to quantify Salmonella based on reverse transcriptase- PCR-real time (RT-PCR-RT). For QIAamp® DNA Stool Mini Kit evaluation feces taken directly from the rectum of infected or health animals were used, with the former being artificially contaminated. Samples were submitted to DNA extraction, according to manufacturers protocol. The isolated DNA were quantified using a Salmonella-specific PCR-RT targeting the ttr locus. The same assay was used for Salmonella cells originated from culture medium. The PCR-RT assay with tuf as target was first validated employing different Salmonella serovars and other Enterobacteriaceae strains. After, its efficiency was evaluated on food-models (chicken and swine) spiked with high (≈ 6 log CFU/mL) and low (≈ 2 log CFU/mL) Salmonella Typhimurium DT 104 populations. The validation of the quantitative RT-PCR-RT method was first conducted with cells grown in culture medium, and then in the same food-model used for PCR-RT. For both methods aliquots of foodmodels were maintained at 20 ºC and 8 ºC being evaluated at different incubation times. Enumeration of total mesophilic microorganisms and Salmonella based on conventional methods were used as controls. The DNA recovery rate in swine feces artificially inoculated, after QIAamp® DNA Stool Mini Kit treatment, was between 25% to 50% depending the initial amount of cells. Using the extracted DNA and submitting it to PCR-RT for ttr a detection level of 2,8 CFU eq/g of feces was obtained. This method showed lower sensitivity than the conventional. Salmonella quantification by PCR-RT employing tuf showed a detection level lower than 1 log CFU eq. The results obtained with this method and cells suspended in culture medium or in food-model systems were, in general slightly lower that those obtained with the conventional method. The efficiency of amplification for PCR-RT tuf was 94%. Detection limit of RT-PCR-RT was similar to that of ttr (2 log CFU eq) and efficiency of amplification was 100%. tuf was expressed in logarithmic phase of bacteria growth curve showing that it is a good viability indicator for Salmonella.

Para obter resultados rápidos e confiáveis que permitam o monitoramento da segurança microbiológica de alimentos, seja pela indústria ou pelos órgãos de fiscalização, diversos métodos alternativos têm sido desenvolvidos para a detecção e quantificação de Salmonella. Os propósitos do estudo foram avaliar a viabilidade de emprego do QIAamp® DNA Stool Mini Kit para extração e purificação de DNA de Salmonella; validar ensaios baseados em PCR-tempo real (PCR-RT) para quantificar o DNA de Salmonella empregando ttr ou tuf e desenvolver um ensaio para quantificar Salmonella baseado na transcriptase reversa-PCR-tempo real (RT-PCR-RT). Para avaliação do QIAamp® DNA Stool Mini Kit empregaram-se fezes coletadas diretamente do reto de animais infectados ou não, sendo estas últimas artificialmente contaminadas e submetidas à extração segundo protocolo do fabricante. As amostras de DNA isoladas foram quantificadas empregando um ensaio Salmonella-específico PCR-RT utilizando como alvo o lócus ttr. O mesmo ensaio foi utilizado para células de Salmonella provenientes de meio de cultura. O ensaio PCR-RT baseado no alvo tuf foi validado empregando-se primeiramente cepas de diferentes sorotipos de Salmonella e de outras Enterobacteriaceae. A seguir sua eficiência foi avaliada para alimentos-modelo (ave e suíno) artificialmente contaminadas com elevada (≈ 6 log UFC/mL) e baixa (≈ 2 log UFC/mL) população de Salmonella Typhimurium DT 104. A validação do método quantitativo de Salmonella por RT-PCR-RT foi realizada primeiramente com células em meio de cultura e posteriormente nos mesmos alimentos-modelo utilizados para PCR-RT. Em ambos os métodos, alíquotas dos alimentos-modelo foram mantidas a 20 ºC e a 8 ºC, sendo examinadas em diferentes tempos pós-inoculação. Como controle empregou-se a enumeração de microrganismos mesófilos totais e de Salmonella por técnicas convencionais. A taxa de recuperação de Salmonella em fezes suínas artificialmente inoculadas, após tratamento com QIAamp® DNA Stool Kit, variou entre 25% a 50%, dependendo da quantidade inicial de células. Empregando o DNA extraído e submetendo-o à PCR-RT para o ttr obteve-se limite de detecção de 2,8 log UFC eq/g de fezes; método que foi menos sensível que o convencional. A quantificação de Salmonella por PCR-RT empregando tuf apresentou limite de detecção menor que 1 log UFC eq. Os resultados obtidos com este método, empregando-se células em meio de cultura ou alimentos-modelo, foram, de maneira geral, ligeiramente inferiores aos do método convencional. A eficiência de amplificação para PCR-RT e tuf foi de 94%. O método RT-PCR-RT apresentou limite de detecção semelhante ao obtido com o ttr (2 log UFC eq) e sua eficiência de amplificação foi de 100%. Observou-se que tuf é expresso na fase logarítmica de multiplicação bacteriana, o que o torna um bom indicador da viabilidade de Salmonella. / In order to get fast and trustworthy results that allow monitoring the microbiological food safety either by industries or governmental agencies, diverse alternative methods have been developed for Salmonella detection and quantification. The purposes of this study were to evaluate the viability of the use of QIAamp® DNA Stool Mini Kit for Salmonella DNA extraction and purification; to validate assays based on real time-PCR (PCR-RT) to quantify Salmonella DNA by using ttr or tuf, and to develop an assay to quantify Salmonella based on reverse transcriptase- PCR-real time (RT-PCR-RT). For QIAamp® DNA Stool Mini Kit evaluation feces taken directly from the rectum of infected or health animals were used, with the former being artificially contaminated. Samples were submitted to DNA extraction, according to manufacturers protocol. The isolated DNA were quantified using a Salmonella-specific PCR-RT targeting the ttr locus. The same assay was used for Salmonella cells originated from culture medium. The PCR-RT assay with tuf as target was first validated employing different Salmonella serovars and other Enterobacteriaceae strains. After, its efficiency was evaluated on food-models (chicken and swine) spiked with high (≈ 6 log CFU/mL) and low (≈ 2 log CFU/mL) Salmonella Typhimurium DT 104 populations. The validation of the quantitative RT-PCR-RT method was first conducted with cells grown in culture medium, and then in the same food-model used for PCR-RT. For both methods aliquots of foodmodels were maintained at 20 ºC and 8 ºC being evaluated at different incubation times. Enumeration of total mesophilic microorganisms and Salmonella based on conventional methods were used as controls. The DNA recovery rate in swine feces artificially inoculated, after QIAamp® DNA Stool Mini Kit treatment, was between 25% to 50% depending the initial amount of cells. Using the extracted DNA and submitting it to PCR-RT for ttr a detection level of 2,8 CFU eq/g of feces was obtained. This method showed lower sensitivity than the conventional. Salmonella quantification by PCR-RT employing tuf showed a detection level lower than 1 log CFU eq. The results obtained with this method and cells suspended in culture medium or in food-model systems were, in general slightly lower that those obtained with the conventional method. The efficiency of amplification for PCR-RT tuf was 94%. Detection limit of RT-PCR-RT was similar to that of ttr (2 log CFU eq) and efficiency of amplification was 100%. tuf was expressed in logarithmic phase of bacteria growth curve showing that it is a good viability indicator for Salmonella.

Submitted by EDISON ANTONIO DE SOUZA null (esmidia@gmail.com) on 2016-01-06T16:51:45Z No. of bitstreams: 1 TESE_DOUTORADO_Edison_Souza.pdf: 947001 bytes, checksum: a8a8d690c84bc72a0b5e27d8ebeee92f (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-01-06T19:50:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 souza_ea_dr_bot_par.pdf: 573913 bytes, checksum: 30e1665c27c8c583a0b5ab8dc8bd89e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-06T19:50:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 souza_ea_dr_bot_par.pdf: 573913 bytes, checksum: 30e1665c27c8c583a0b5ab8dc8bd89e0 (MD5) Previous issue date: 2015-12-16 / INFLUÊNCIA DO CONSUMO DA PRÓPOLIS NA EXPRESSÃO DE GENES RELACIONADOS AO SISTEMA IMUNOLOGICO DE ABELHAS Apis mellifera L. SUMETIDAS AO DESAFIO BACTERIANO. As abelhas Apis mellifera podem estar sujeitas a uma série de ameaças como parasitas e patógenos que acometem seu sistema imunológico. Tal fato torna necessária a busca por produtos naturais que possam contribuir com a melhora do sistema imune destes insetos, como a própolis. Diante do exposto, o objetivo foi analisar a influência do fornecimento da própolis em expressões de genes relacionados à imunidade de abelhas Apis mellifera L. submetidas ao desafio bacteriano. Ao longo de 30 dias, quatro colmeias receberam semanalmente os tratamentos com diferentes porcentagens de extrato alcoólico de própolis 30% (0%, 5%, 10%, 15%). O experimento foi casualizado em esquema fatorial 4 x 2 x 2x 3 (tratamentos x com ou sem bactéria x tempos x períodos), totalizando 48 amostras. Foram observadas as expressões dos genes abaecin, hymenoptaecin, apidaecin e defensin1. Como controle interno foi utilizado o gene actina. Os resultados foram comparados por ANOVA seguidos do teste de Tukey (P<0,05). Foram observadas alterações na expressão gênica das abelhas estudadas para todos os períodos e tratamentos, antes e após desafio bacteriano, para todos os genes propostos, sendo ainda verificada induções da expressão relativa nos três períodos. Conclui-se que nas condições do presente trabalho, a própolis pode induzir a expressão relativa dos genes abaecin, hymenoptaecin, apidaecin e defensin1, quando submetidas a desafio bacteriano. Entretanto, não se pôde caracterizar um tratamento com própolis que apresente uma maior expressão relativa para todos os genes simultaneamente. EFEITO DO CONSUMO DE PRÓPOLIS NAS ALTERAÇÕES COMPORTAMENTAIS E MORTALIDADE DE ABELHAS Apis mellifera L. SUBMETIDAS AO INSETICIDA FIPRONIL. Os inseticidas representam o maior risco direto para os polinizadores, como as abelhas Apis mellifera, sendo responsável pela redução das populações de abelhas e da produção apícola, tornando necessária a busca por substâncias que possam contribuir na melhora da saúde dessas abelhas, como a própolis. Este estudo verificou o efeito do consumo do extrato alcoólico de própolis no comportamento, quando submetidas a DL50 (0,2 µg/abelha) e subletal (1/500 DL50), e mortalidade das abelhas Apis mellifera L. quando submetidas a diferentes doses do inseticida fipronil (0,05; 0,1; 0,2; 0,3 e 0,4 µg/abelha). Ao todo foram utilizadas quatro colmeias, uma para cada tratamento (0, 5, 10 e 15% de inclusão de própolis), e em três períodos (0,15 e 30 dias) para verificar o efeito dos tratamentos ao longo do experimento. Para a realização dos testes de mortalidade e de alterações comportamentais foram selecionadas as abelhas campeiras das colmeias tratadas. Para o teste de mortalidade, os dados foram analisados em modelo linear misto generalizado, adicionado do Teste de Tukey (P<0,05) e a análise da avaliação das atividades comportamentais foi feita por (ANOVA) seguida do Teste de Tukey (P<0,05). As colmeias que consumiram própolis apresentaram menor taxa de mortalidade quando comparados com a colmeia controle (0%), com exceção no dia 0 em que a colmeia controle não diferiu do tratamento 10%. Verificou-se ainda que as abelhas que receberam o tratamento 10% apresentaram as menores taxas de mortalidade nos dias 15 e 30 de coleta. Além disso, foi observada mortalidade de 23% nas abelhas quando submetidas a DL50 do fipronil. Nos testes de alterações comportamentais e locomotoras não foram observadas influências dos tratamentos com própolis. Conclui-se que, para o presente estudo, a própolis influenciou na taxa de mortalidade e pode ter promovido um efeito protetor nas abelhas Apis mellifera L. quando submetidas a diferentes concentrações do inseticida fipronil, sendo ainda verificado que o tratamento 10% foi o mais eficaz, devido a ter apresentado as menores taxas de mortalidade nos dias 15 e 30. / INFLUENCE OF PROPOLIS CONSUMPTION IN GENES EXPRESSION RELATED TO IMMUNE SYSTEM OF Apis mellifera L. BEES SUBJECTED TO CHALLENGE BACTERIA. The Apis mellifera bees may be subject to a number of threats as parasites and pathogens that affect your immune system. This fact makes it necessary to look for natural products that can contribute to improving the immune system of these insects such as propolis. Given the above, the objective was to analyze the influence of the supply of propolis in gene expressions related to immunity of Apis mellifera L. bees subjected to bacterial challenge Over 30 days, four hives receive weekly treatments with different percentages of alcoholic extract of propolis 30% (0%, 5%, 10%, 15%). The experiment was randomized in a factorial 4 x 2 x 2x 3 (treatments x with or without bacteria x times x periods), totaling 48 samples. It was observed the expressions of abaecin, hymenoptaecin, apidaecin and defensing1 genes. As internal control was used actin gene. The results were compared by ANOVA followed by Tukey test (P <0.05). Alterations were observed in gene expression of bees studied for all periods and treatments before and after bacterial challenge for all proposed genes, were yet verified inductions of relative expression in the three periods. It is concluded that under the conditions of this study, propolis can induce the relative expression of genes abaecin, hymenoptaecin, apidaecin and defensin1, when subjected to bacterial challenge. However, it is not able to characterize a treatment with propolis presenting greater relative expression for all genes simultaneously. EFFECT OF PROPOLIS CONSUMPTION IN THE BEHAVIORAL CHANGES AND MORTALITY OF Apis mellifera L. BEES SUBMITTED TO PESTICIDE FIPRONIL. Pesticides pose the greatest direct risk for pollinators such as Apis mellifera bees, responsible for reducing bee populations and beekeeping, making it necessary to search for substances that can contribute to improving the health of these bees, such as propolis. Given this, the study found the effect of propolis alcoholic extract consumption behavior when subjected to DL50(0.2 µg/bee) and sublethal (1/500 DL50), and mortality of Apis mellifera L. bees submitted to different doses of the insecticide fipronil (0,05; 0.1, 0.2, 0.3 and 0.4 µg/bee). Four colonies were used, one for each treatment (0, 5, 10 and 15% inclusion of propolis), and in three periods (0,15 and 30 days) to determine the effect of the treatments throughout the experiment. To the achievement of mortality and behavioral changes tests the foraging bees from treated hives were selected. For the mortality test, the data were analyzed in generalized linear mixed model, added the Tukey test (P <0.05) and the analysis of the assessment of behavioral activities was made by (ANOVA) followed by Tukey test (P <0.05). Beehives who consumed propolis have a lower mortality rate compared to the hive control (0%), except on day 0 that the hive control did not differ from treatment 10%. It was also found that the hive that received treatment 10% was among the lowest mortality rates in the fifteenth and thirtieth collection day. Furthermore, the observed mortality was 23% in bees when subjected to LD50. In tests of locomotor and behavioral changes were observed influences of treatments with propolis. It concludes that, for this study, propolis influenced the mortality rate and may have promoted a protective effect on bees Apis mellifera L. when subjected to different concentrations of the insecticide fipronil, and also, that the treatment 10% was effective due to having presented the lowest mortality rates in the 15 and 30. However, treatments with propolis did not influence the behavioral and motor changes.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:26:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SOARES_Lais_2013.pdf: 1502301 bytes, checksum: 5eb3bd554b98070bc2586ad2fed479d4 (MD5) Previous issue date: 2013-05-17 / Universidade Federal de Sao Carlos / This work aimed to quantifier the archaeal and bacterial communities by real time PCR, that shown the number of copies of 16S gene, rDNA into the water samples and to compare the archaeal and bacterial profiles on the PCR/DGGE technique as well as relate them with environmental variables in two points, dam and input on the Itupararanga reservoir, Sorocaba s basin. The bacterial density on the sediment (6,09 x108 e 2,56 x 109, dam and input, respectively) was more than water column (6,79 x 107 e 6,55 x 107, dam and input, respectively) this can be attributed to increase of the nutrients concentration from the surface to bottom. The bacterial (6,09 x 108 e 2,56 x 109 dam and input, respectively ) and archaeal (2,31 x 102 e 4,49 x 102 dam and input, respectively) quantities on the reservoir were more in the water column than in the sediment, which can be caused by the higher nutrients concentration in the top and the lees nutrients concentration in the bottom of Itupararanga reservoir. Since the canonical correspondence analysis has been possible, identify that the archaeal community has correlated with profundity and ammonia concentration suggesting ammonia oxidizing archaea s presence and abundance. The bacterial community quantity has correlated with physical chemical properties like pH and dissolved oxygen suggesting the environmental variables influence the group s abundance. Richness has correlated with nutrients distribution like orthophosphate concentration suggesting that the resources may limit the communities. / Com este trabalho objetivou-se quantificar a comunidade de bactérias e arqueias por meio de PCR em tempo real que determina o número de cópias do gene 16S de rDNA presentes nas amostras ambientais e comparar as comunidades de arqueia e bactérias em um perfil de bandas de PCR/DGGE, bem como relacioná-las às variáveis ambientais de dois pontos, Entrada e Barragem do reservatório de Itupararanga, bacia do rio Sorocaba. A quantidade de bactérias (6,09 x 108 e 2,56 x 109 barragem e entrada, respectivamente) e de arqueias (2,31 x 102 e 4,49 x 102 barragem e entrada, respectivamente) no sedimento foi maior do que na coluna d água o que pode ser atribuído ao aumento da concentração de nutrientes da superfície para o fundo do reservatório. A partir de análise de correspondência canônica foi possível observar que a quantidade de arqueias relacionou-se a profundidade e à concentração de íons amônio indicando possível presença e abundância de arqueias amônio oxidantes (AOA), enquanto que as bactérias foram mais relacionadas às variáveis físico-químicas, como temperatura e oxigênio dissolvido indicando que este grupo é mais sensível às variações ambientais. A riqueza de ambos os grupos foi relacionada à disponibilidade de nutrientes, indicando que os recursos podem ser limitantes às comunidades.

Orientador: Ricardo De Oliveira Orsi / Abstract: INFLUENCE OF PROPOLIS CONSUMPTION IN GENES EXPRESSION RELATED TO IMMUNE SYSTEM OF Apis mellifera L. BEES SUBJECTED TO CHALLENGE BACTERIA. The Apis mellifera bees may be subject to a number of threats as parasites and pathogens that affect your immune system. This fact makes it necessary to look for natural products that can contribute to improving the immune system of these insects such as propolis. Given the above, the objective was to analyze the influence of the supply of propolis in gene expressions related to immunity of Apis mellifera L. bees subjected to bacterial challenge Over 30 days, four hives receive weekly treatments with different percentages of alcoholic extract of propolis 30% (0%, 5%, 10%, 15%). The experiment was randomized in a factorial 4 x 2 x 2x 3 (treatments x with or without bacteria x times x periods), totaling 48 samples. It was observed the expressions of abaecin, hymenoptaecin, apidaecin and defensing1 genes. As internal control was used actin gene. The results were compared by ANOVA followed by Tukey test (P <0.05). Alterations were observed in gene expression of bees studied for all periods and treatments before and after bacterial challenge for all proposed genes, were yet verified inductions of relative expression in the three periods. It is concluded that under the conditions of this study, propolis can induce the relative expression of genes abaecin, hymenoptaecin, apidaecin and defensin1, when subjected to bacterial challenge. However, it i... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: INFLUÊNCIA DO CONSUMO DA PRÓPOLIS NA EXPRESSÃO DE GENES RELACIONADOS AO SISTEMA IMUNOLOGICO DE ABELHAS Apis mellifera L. SUMETIDAS AO DESAFIO BACTERIANO. As abelhas Apis mellifera podem estar sujeitas a uma série de ameaças como parasitas e patógenos que acometem seu sistema imunológico. Tal fato torna necessária a busca por produtos naturais que possam contribuir com a melhora do sistema imune destes insetos, como a própolis. Diante do exposto, o objetivo foi analisar a influência do fornecimento da própolis em expressões de genes relacionados à imunidade de abelhas Apis mellifera L. submetidas ao desafio bacteriano. Ao longo de 30 dias, quatro colmeias receberam semanalmente os tratamentos com diferentes porcentagens de extrato alcoólico de própolis 30% (0%, 5%, 10%, 15%). O experimento foi casualizado em esquema fatorial 4 x 2 x 2x 3 (tratamentos x com ou sem bactéria x tempos x períodos), totalizando 48 amostras. Foram observadas as expressões dos genes abaecin, hymenoptaecin, apidaecin e defensin1. Como controle interno foi utilizado o gene actina. Os resultados foram comparados por ANOVA seguidos do teste de Tukey (P<0,05). Foram observadas alterações na expressão gênica das abelhas estudadas para todos os períodos e tratamentos, antes e após desafio bacteriano, para todos os genes propostos, sendo ainda verificada induções da expressão relativa nos três períodos. Conclui-se que nas condições do presente trabalho, a própolis pode induzir a expressão relativa dos genes a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor