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Génétique et architecture clonale des leucémies myélomonocytaires juvéniles sporadiques et syndromiques / Genetics and clonal architecture of Juvenile Myelomonocytic LeukemiaCaye-Eude, Aurélie 26 June 2018 (has links)
La LMMJ est un syndrome myéloprolifératif et myélodysplasique rare du jeune enfant, initiée par des mutations classiquement décrites comme mutuellement exclusives de RAS (NRAS, KRAS) ou de régulateurs de la voie RAS (PTPN11, NF1 ou CBL). Ces mutations, somatiques ou constitutionnelles, entraînent l’hyperactivation de cette voie de signalisation et une hypersensibilité spécifique au GM-CSF. La LMMJ est une hémopathie sévère dont le seul traitement est l’allogreffe de moelle osseuse. Cependant sa présentation et son évolution sont particulièrement hétérogènes puisqu’une transformation en leucémie aiguë myéloide survient chez un tiers des patients quand d’autres présentent des formes plus indolentes, voire des rémissions spontanées en l’absence de greffe. Cette hétérogénéité n’est que partiellement liée à la mutation initiatrice et pourrait s’expliquer par la présence de mutations additionnelles et/ou par une variabilité dans la cellule initiatrice de la leucémie, qui n’a jamais été précisément caractérisée.La caractérisation génétique de 118 LMMJ nous a permis de montrer que les anomalies génétiques additionnelles sont peu nombreuses dans les LMMJ sporadiques, et exceptionnelles dans les LMMJ syndromiques sauf en cas de neurofibromatose de type-1. Ces anomalies se concentrent sur deux grands systèmes, la voie RAS et le PRC2, et leur présence s’accompagne d’un pronostic défavorable (particulièrement en cas de mutations multiples de la voie RAS). L’absence d’anomalie additionnelle permet à l’inverse de distinguer un sous-groupe de patients qui présentent une forte probabilité de survie à long terme sans greffe et pour lesquels une soultion attentiste serait à privilégier. Une collaboration avec l’équipe de D Bonnet (Crick Institute) nous a ensuite permis d’établir un modèle murin de xénotransplantation dans des souris immunodéficientes de type NSG ou NSG-S et de montrer que la capacité de propagation de la leucémie est bien portée par la fraction souche, mais s’étend aussi chez certains patients à des fractions plus différenciées. Le profil génétique des 15 xénogreffes étudiées reproduit fidèlement l’architecture clonale des LMMJ natives, tant dans les souris NSG que NSG-S. L’architecture clonale des LMMJ est dans la majorité des cas compatible avec une acquisition linéaire des altérations, mais une architecture complexe est parfois observée, avec coexistence de clones distincts, dont les plus faiblement représentés sont susceptibles de devenir dominants lors de la rechute. Le séquençage de sous-populations isolées a montré que l’ensemble des mutations (initiatrice et additionnelles) est présent dès les fractions les plus immatures (HSC/MPP/MLP). Le séquençage de colonies obtenues par culture des progéniteurs en méthylcellulose révèle que les mutations coexistent dans les mêmes cellules, sans qu’il soit possible de hiérarchiser leur ordre de survenue, témoignant d’un avantage sélectif majeur de leur association dès la cellule souche. Au total, nos résultats remettent en cause le dogme de l’exclusivité mutuelle des mutations activant RAS dans les LMMJ, confirment le rôle central et initiateur de cette voie oncogénique dans la leucémogénèse et suggérent un effet-dose de l’activation de RAS, en particulier en cas de mutation de NRAS. La présence d’altérations multiples ciblant la voie RAS marque des LMMJ agressives et rapidement évolutives. La mise en évidence d’une fréquente dérégulation du PRC2 offre de nouvelles perspectives therapeutiques (comme l’utilisation des inhibiteurs de bromodomaine). La mise en place d’un modèle de souris xénotransplantée devrait de plus faciliter les études biologiques et la mise en place d’évaluations précliniques. / JMML is a rare myeloproliferative and myelodysplastic neoplasm of early childhood, initiated by mutations classically described as mutually exclusive of RAS (NRAS, KRAS) or RAS pathway regulators (PTPN11, NF1 or CBL). These mutations, either germline or somatically aquired, lead to an hyperactivation of the RAS signalling pathway and a to a specific hypersensitivity to GM-CSF. JMML is a severe hemopathy, and the only curative treatment is allogenic bone marrow transplantation. However, its presentation and evolution are particularly heterogeneous since transformation into acute myeloid leukaemia occurs in about one third of patients, when others present more indolent forms, or even spontaneous remissions in the absence of transplantation. This heterogeneity is only partially accounted for by the initiating mutation and could be related to the presence of additional mutations, or some variability in the leukemia initiating cell, which has never been precisely characterized so far.Establishing the genetic landscape of 118 LMMJ allowed us to show that additional genetic abnormalities are scarse in sporadic JMML and exceptional in syndromic JMML, except in the case of type-1 neurofibromatosis. These additional abnormalities mainly target two major biologic components, the RAS pathway and the PRC2, and their presence is associated with an unfavourable prognosis (particularly in the case of multiple mutations targeting the RAS pathway). On the other hand, the absence of any additional abnormality allows to delineate a subgroup of patients who have a high probability of long-term survival in the absence of bone marrow transplantation, and for whom a wait-and-see approach would be preferable. A collaboration with D. Bonnet’s group (Crick Institute) allowed us to establish a mouse model of xenotransplantation in immunodeficient NSG or NSG-S mice and to demonstrate that the leukemia propagating cell is present in the stem cell fractions (HSC, CD34+/CD38-…) but also extends in certain patients to more differentiated fractions, such as CMP. The genetic profile of xenografts established from 15 JMML faithfully reproduced the clonal architecture of the native leukemia, either in NSG or NSG-S mice. The clonal architecture of JMML is linear in the great majority of cases, with linear acquisition of alterations, but a complex architecture is sometimes observed, with coexistence of distinct clones, the weakest of which being susceptible to become dominant at relapse. Sequencing of sorted cell populations showed that all mutations (initiating and additional) are present in the most immature fractions (HSC/MPP/MLP). The sequencing of colonies obtained by culturing progenitors into methylcellulose revealed that mutations coexist in the same cells, their order of appearance being often impossible to determine, showing a major selective advantage of their association from the most immature compartment. In conclusion, our findings confirm the central role of RAS activation in JMML leukemogenesis. The identification of multiple alterations targeting the RAS pathway challenges the dogma of the mutual exclusivity of these mutations and defines a subset of aggressive and rapidly evolving JMML, suggesting a dose-effect of RAS activation, particularly in case with NRAS mutation. Recurrent deregulation of PRC2 in JMML may offer new therapeutic approaches, such as bromodomain inhibitors. The implementation of a xenotransplanted mouse model should also facilitate biological studies and the implementation of preclinical evaluations.
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Rôle de EZH2 et du complexe PRC2 dans l’homéostasie du cortex surrénalien / Role of EZH2 and PRC2 complex in adrenal cortex homeostasisMathieu, Mickael 23 March 2018 (has links)
Les surrénales sont des glandes endocrines permettant la réponse au stress de l’organisme. Alors que la medulla produit des catécholamines, la corticosurrénale sécrète des minéralocorticoïdes au niveau de la zone glomérulée, et des glucocorticoïdes grâce aux cellules de la zone fasciculée. Ces hormones sont notamment impliquées dans l’homéostasie hydrominérale, la réponse immunitaire et la maturation pulmonaire au cours de la vie fœtale. Les insuffisances surrénaliennes peuvent donc être très délétère en absence de traitement. Pour maintenir l’intégrité tissulaire au cours de la vie et pour mieux répondre aux variations des besoins de l’organisme, le cortex surrénalien est en renouvellement cellulaire constant. Des expériences de lignage ont mis en évidence que ce renouvellement repose sur le recrutement de cellules progénitrices capsulaires et situées dans la partie externe du cortex. Lorsqu’ils sont mobilisés, ces progéniteurs se différencient en cellules de la zone glomérulée, qui vont alors migrer de façon centripète le long du cortex et se différencier en cellules de la zone fasciculée après une conversion de lignage, au cours de leur migration. Cette conversion de lignage est orchestrée via un équilibre entre l’activation des voies Wnt/β-caténine, imposant une identité glomérulée, et PKA, permettant une différenciation fasciculée. Les facteurs épigénétiques jouent de nombreux rôles essentiels, du développement embryonnaire jusqu’à la tumorigenèse, en passant par l’homéostasie des tissus. Nous avons montré que la méthyltransférase EZH2 était le facteur épigénétique le plus surexprimé dans les carcinomes corticosurrénaliens et que cette surexpression était associée à l’agressivité de ces cancers. EZH2 est la sous-unité catalytique du complexe multi-protéique PRC2 qui permet, entre autres, la répression de la transcription de ses gènes cibles en posant la marque H3K27me3. L’objectif de ma thèse a été d’identifier les potentiels rôles physiologiques de EZH2 dans la surrénale, qui n’avaient jusque là, jamais été recherchés.En développant un modèle murin d’invalidation génétique de Ezh2 dans le cortex surrénalien, dès l’émergence de l’ébauche surrénalienne au cours du développement embryonnaire, nous avons pu mettre en évidence une hypoplasie corticosurrénalienne, résultant d’une forte atrophie de la zone fasciculée, et associé à une insuffisance primaire en glucocorticoïdes. Nos analyses nous ont permis de démontrer le rôle original et inattendu de Ezh2 dans le contrôle de la voie de signalisation PKA, en réprimant l’expression d’inhibiteurs de cette voie comme les phosphodiestérases (PDE) et la sous-unité régulatrice Prkar1b. EZH2 régule ainsi la zonation fonctionnelle du cortex surrénalien via son activité histone méthyltransférase. A l’inverse, on n’observe pas d’altération marquée de la voie Wnt/β-caténine, suggérant que Ezh2 n’est pas essentiel au contrôle de cette voie dans la surrénale. Nous avons également pu mettre en évidence une dédifférenciation de cellules corticales qui retrouvent, suite à la perte de Ezh2, une identité progénitrice en exprimant des marqueurs adréno-gonadique tels que Gata4 et Wt1. Cette dédifférenciation est un phénomène naturel que l’on retrouve avec le vieillissement et qui pourrait être associée avec la diminution progressive de l’expression de Ezh2 dans les cellules stéroïdogènes. L’ensemble de ces résultats, met en évidence une nouvelle fonction de Ezh2 dans le contrôle de la voie de signalisation PKA et de l’homéostasie de la glande surrénale. / Adrenals are endocrine glands allowing the stress response of the organism. While the medulla produces catecholamines, the adrenal cortex secretes mineralocorticoids in the glomerular zone, and glucocorticoids through cells in the fasciculated zone. These hormones are notably involved in hydromineral homeostasis, the immune response and pulmonary maturation during fetal life. Adrenal insufficiency can therefore be very deleterious in the absence of treatment. To maintain tissue integrity over the course of life and to better respond to the changing needs of the body, the adrenal cortex is in constant cell renewal. Lineage experiments have shown that this renewal is based on the recruitment of capsular progenitor cells and progenitors located in the outer part of the cortex. When mobilized, these progenitors differentiate into cells of the glomerular zone, which then migrate centripetally along the cortex and differentiate into cells of the fasciculated zone after lineage conversion, during their migration. This lineage conversion is orchestrated via a balance between the activation of the Wnt/β-catenin pathway, imposing a glomerular identity, and PKA pathway, allowing fasciculated differentiation. Epigenetic factors play many important roles, from embryonic development to tumorigenesis, passing by tissue homeostasis. We have shown that methyltransferase EZH2 is the most overexpressed epigenetic factor in adrenocortical carcinomas and this overexpression is associated with cancer agressivity. EZH2 is the catalytic subunit of the multiprotein complex PRC2 that allow, among others things, the repression of the transcription of its target genes by posing the mark H3K27me3. The aim of my thesis was to indentify the putative physiological roles of EZH2 in the adrenal, never investigated yet.By developing a murine model of genetic invalidation of Ezh2 in the adrenal cortex, from the emergence of the adrenal anlagen during embryonic development, we have been able to demonstrate adrenocortical hypoplasia, resulting from a strong atrophy of the zona fasciculata, and associated with primary glucocorticoid insufficiency. Our analyses allowed us to demonstate the original and unexpected role of EZH2 in the controle of the PKA pathway, by repressing expression of this pathway inhibitors such as phosphodiesterases (PDE) and regulatory subunit Prkar1b. EZH2 thus regulate functionel zonation of adrenal cortex via its histone methyltransferase activity. On the contrary, we don’t observe marked alteration of the Wnt/β-catenin pathway, suggesting EZH2 is not essential for the control of this pathway in the adrenal. We could also show a dedifferenciation of cortical cells which, after the loss of Ezh2, exhibit progenitors identity by expressing adreno-gonadal marks as Gata4 and Wt1. This dedifferenciation is a natural phenomenon that appear with ageing and could be associated with processive decrease of Ezh2 expression in steroidogenic cells. All of these results, highlights a new function of Ezh2 in the control of the PKA signaling pathway and in the homeostasis of the adrenal gland.
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