Na busca por soluções que maximizem a produção de etanol, o melhoramento genético de diferentes linhagens de levedura tornou-se foco de investigação em diversos centros de pesquisa. Com o recente sequenciamento de uma linhagem selvagem utilizada nas usinas sucroalcooleiras brasileiras, a linhagem PE-2 da espécie Saccharomyces cerevisiae, surgiu o interesse em estudar sua dinâmica durante o processo de fermentação a fim de encontrar aspectos que possam explicar como estas se tornaram mais adaptadas às dornas de fermentação mantendo a alta produtividade de bioetanol. A partir da análise transcricional da linhagem PE-2, Buscamos por métodos de inferência de redes que possam representar a dinâmica dessa levedura. Propomos nesse trabalho a modelagem de dados experimentais temporais das linhagens PE-2 e S288c (utilizada como referência) baseado em um modelo de Redes Booleanas. Trata-se de um modelo onde convertemos dados contínuos em dados discretos (0 or 1) no qual, de acordo com restrições ditadas pelo modelo, são inferidas redes que representem interações gênicas ao longo do tempo baseados nas amostras temporais. Conseguimos modelar, com sucesso, algumas redes utilizando conjuntos com 11 e 12 genes relacionados a genes pertencentes à via da glicólise e fermentação da levedura. / Ethanol production improvements give rise to the breeding of yeast strains, that became the investigation focus in several research centers. Recently, a wild strain used in Brazilian sugarcane industry was sequenced, the PE-2 strain of Saccharomyces cerevisiae, and this event brought an interest in studying the dynamics of the fermentation of this strain in order to understand which aspects this strain become more adapted to the fermentation conditions, maintaining a high capacity to produce bioethanol. From the analysis of transcriptional strain PE-2, we seek for inference networks methods that can represent the dynamics of this yeast.In this work, we model an experimental temporal data of strain PE-2 and strain S288c (used as a reference) based on Boolean networks model. In this model, the data are converted from continuous into discrete data (0 or 1) and, based on constraints rules of Boolean Network model, networks are inferred to represent gene interactions over time based on temporal data. We successfully model networks using a set with 11 and 12 genes related to yeast glycolysis and fermentation pathways.

O presente trabalho teve como objetivo estudar a influência de 8 compostos fenólicos de baixa massa molar, oriundos da degradação da lignina, sobre a fermentação de glicose a etanol, em meio semidefinido, utilizando-se as leveduras Saccharomyces cerevisiae PE-2 e de panificação. Esses compostos são formados quando o bagaço de cana-de-açúcar é pré-tratado, por explosão a vapor. Assim, p-hidroxibenzaldeído, vanilina, siringaldeído, ácido p-hidroxibenzoico, ácido vanílico, ácido siríngico, ácido cumárico e ácido ferúlico foram adicionados individualmente aos meios de fermentação. Objetivou-se, também, identificar e quantificar os produtos da bioconversão desses compostos pela S. cerevisiae PE-2, por cromatografia líquida seguida de espectrometria de massas. Os resultados mostraram que o p-hidroxibenzaldeído e o ácido p-hidroxibenzoico não foram tóxicos para ambas as cepas. Para a cepa PE-2, o siringaldeído e os ácidos cumárico e ferúlico também não apresentaram toxicidade. No caso da S. cerevisiae de panificação, a vanilina, o siringaldeído e o ácido vanílico (1,0 g.L-1) dificultaram o consumo de glicose, diminuíram a produtividade volumétrica (Qp) e aumentaram o desvio de glicose para ácido acético. Vanilina (1,0 g.L-1) aumentou o fator de conversão de glicose em células (YX/S). Os ácidos siríngico e ferúlico (1,0 g.L-1) e o ácido cumárico (0,6 e 1,0 g.L-1) diminuíram YX/S (~50%), aumentaram o desvio de glicose para glicerol, dificultaram o consumo de glicose e diminuíram Qp, tendo os ácidos cumárico e ferúlico apresentado o maior efeito inibitório. Para a S. cerevisiae PE-2, a presença da vanilina provocou a queda de Qp, devido à dificuldade inicial em consumir o substrato. Já os ácidos vanílico e siríngico foram bastante inibitórios, dificultando o consumo da glicose, diminuindo Qp e aumentando os desvios de glicose para a produção de glicerol e ácido acético. Os ácidos cumárico e ferúlico aumentaram o YX/S (~ 45 e 80%). Quanto à bioconversão dos compostos fenólicos pela levedura S. cerevisiae PE-2, apenas os ácidos que apresentam carboxila benzílica (ácidos p-hidroxibenzoico, vanílico e siríngico) não foram transformados. A cepa PE-2 transformou rapidamente os aldeídos, formando os respectivos ácidos e alcoóis (esses últimos, provavelmente, formados em maior extensão). Esta levedura também foi capaz de converter os ácidos cumárico e ferúlico, mas neste trabalho não foram identificados os produtos dessa transformação. Concluiu-se que os compostos afetaram mais a Qp do que YX/S. O fator de conversão de glicose em etanol não foi afetado por nenhum dos compostos. Alguns provocaram um maior desvio de glicose para a formação de glicerol. O desvio de glicose para ácido acético, nos meios aos quais se adicionou os aldeídos, acompanhou a bioconversão dos mesmos em seu produto de redução, preferencialmente. Este trabalho confirmou os dados da literatura de que a inibição dos processos fermentativos não depende apenas da natureza do composto, mas também de sua concentração e do tipo de micro-organismo. / The main objective of the present work was to investigate the influence of eight low molecular weight phenolic compounds, obtained from lignin degradation, in the fermentation of glucose to ethanol using S. cerevisiae PE-2 and the baker\'s yeast S. cerevisiae in a semi-defined medium. These compounds are originated from the pretreated sugarcane bagasse by steam explosion. Thus, 4-hydroxybenzaldehyde, vanillin, syringaldehyde, 4-hydroxybenzoic acid, vanillic acid, syringic acid, coumaric acid and ferulic acid were added separately in the fermentative media. Moreover, the bioconversion products of these molecules by S. cerevisiae were identified and quantified by high performance liquid chromatography and mass spectrometry. These results indicated that 4-hydroxybenzaldehyde and 4-hydroxybenzoic acid were not toxic for both strain. Additionally, syringaldehyde and coumaric and ferulic acids were also not toxic for PE-2 strain. Vanillin, syringaldehyde and vanillic acid (at 1.0g.L-1) made the glucose consumption slower, reduced the volumetric productivity (Qp), increased the deviation of glucose to produce acetic acid for the baker\'s yeast S. cerevisiae system. Vanillin (at 1.0 g.L-1) increased the cellular mass yield. Syringic and ferulic acids (at 1.0g.L-1) and coumaric acid (at 0.6 and 1.0 g.L-1) highly inhibited the microbial growth (about 50 %), increased the deviation of glucose to produce the glycerol and made slower the glucose consumption, reducing Qp. Coumaric and ferulic acids were the greatest inhibitors compounds for the baker\'s yeast S. cerevisiae. For Saccharomyces cerevisiae PE-2, the presence of vanillin led to a Qp reduction, based on the initial difficult in substrate consumption. Vanillic and syringic acids were extremely inhibitory, making difficult the glucose consumption, reducing Qp and increasing both, glycerol and acetic acid production by deviation of glucose. Coumaric and ferulic acids increased the cellular yield (about 48 and 80 %). Concerning the bioconvertion of the phenolic acids by S. cerevisiae PE-2, only those molecules presenting the benzilic carboxyl group (4-hydroxybenzoic, vanillic and syringic acids) did not reacted. In contrast, aldehydes were rapidly transformed into their respective acids and alcohols (being this last one probably formed in greater amount). S. cerevisiae PE-2 was also capable to convert coumaric and ferulic acids, however, herein none products were identified. Thus, the compounds most affect ethanol productivity than the cellular mass yield. The ethanol yield was not affected by any of the compounds. Some of them led to a greater glucose deviation to produce glycerol and acetic acid. This work confirmed previously data published in the literature indicating that the inhibition of fermentative process did not depend exclusively on the compounds, but also its concentration and microorganism type.

O presente trabalho teve como objetivo estudar a influência de 8 compostos fenólicos de baixa massa molar, oriundos da degradação da lignina, sobre a fermentação de glicose a etanol, em meio semidefinido, utilizando-se as leveduras Saccharomyces cerevisiae PE-2 e de panificação. Esses compostos são formados quando o bagaço de cana-de-açúcar é pré-tratado, por explosão a vapor. Assim, p-hidroxibenzaldeído, vanilina, siringaldeído, ácido p-hidroxibenzoico, ácido vanílico, ácido siríngico, ácido cumárico e ácido ferúlico foram adicionados individualmente aos meios de fermentação. Objetivou-se, também, identificar e quantificar os produtos da bioconversão desses compostos pela S. cerevisiae PE-2, por cromatografia líquida seguida de espectrometria de massas. Os resultados mostraram que o p-hidroxibenzaldeído e o ácido p-hidroxibenzoico não foram tóxicos para ambas as cepas. Para a cepa PE-2, o siringaldeído e os ácidos cumárico e ferúlico também não apresentaram toxicidade. No caso da S. cerevisiae de panificação, a vanilina, o siringaldeído e o ácido vanílico (1,0 g.L-1) dificultaram o consumo de glicose, diminuíram a produtividade volumétrica (Qp) e aumentaram o desvio de glicose para ácido acético. Vanilina (1,0 g.L-1) aumentou o fator de conversão de glicose em células (YX/S). Os ácidos siríngico e ferúlico (1,0 g.L-1) e o ácido cumárico (0,6 e 1,0 g.L-1) diminuíram YX/S (~50%), aumentaram o desvio de glicose para glicerol, dificultaram o consumo de glicose e diminuíram Qp, tendo os ácidos cumárico e ferúlico apresentado o maior efeito inibitório. Para a S. cerevisiae PE-2, a presença da vanilina provocou a queda de Qp, devido à dificuldade inicial em consumir o substrato. Já os ácidos vanílico e siríngico foram bastante inibitórios, dificultando o consumo da glicose, diminuindo Qp e aumentando os desvios de glicose para a produção de glicerol e ácido acético. Os ácidos cumárico e ferúlico aumentaram o YX/S (~ 45 e 80%). Quanto à bioconversão dos compostos fenólicos pela levedura S. cerevisiae PE-2, apenas os ácidos que apresentam carboxila benzílica (ácidos p-hidroxibenzoico, vanílico e siríngico) não foram transformados. A cepa PE-2 transformou rapidamente os aldeídos, formando os respectivos ácidos e alcoóis (esses últimos, provavelmente, formados em maior extensão). Esta levedura também foi capaz de converter os ácidos cumárico e ferúlico, mas neste trabalho não foram identificados os produtos dessa transformação. Concluiu-se que os compostos afetaram mais a Qp do que YX/S. O fator de conversão de glicose em etanol não foi afetado por nenhum dos compostos. Alguns provocaram um maior desvio de glicose para a formação de glicerol. O desvio de glicose para ácido acético, nos meios aos quais se adicionou os aldeídos, acompanhou a bioconversão dos mesmos em seu produto de redução, preferencialmente. Este trabalho confirmou os dados da literatura de que a inibição dos processos fermentativos não depende apenas da natureza do composto, mas também de sua concentração e do tipo de micro-organismo. / The main objective of the present work was to investigate the influence of eight low molecular weight phenolic compounds, obtained from lignin degradation, in the fermentation of glucose to ethanol using S. cerevisiae PE-2 and the baker\'s yeast S. cerevisiae in a semi-defined medium. These compounds are originated from the pretreated sugarcane bagasse by steam explosion. Thus, 4-hydroxybenzaldehyde, vanillin, syringaldehyde, 4-hydroxybenzoic acid, vanillic acid, syringic acid, coumaric acid and ferulic acid were added separately in the fermentative media. Moreover, the bioconversion products of these molecules by S. cerevisiae were identified and quantified by high performance liquid chromatography and mass spectrometry. These results indicated that 4-hydroxybenzaldehyde and 4-hydroxybenzoic acid were not toxic for both strain. Additionally, syringaldehyde and coumaric and ferulic acids were also not toxic for PE-2 strain. Vanillin, syringaldehyde and vanillic acid (at 1.0g.L-1) made the glucose consumption slower, reduced the volumetric productivity (Qp), increased the deviation of glucose to produce acetic acid for the baker\'s yeast S. cerevisiae system. Vanillin (at 1.0 g.L-1) increased the cellular mass yield. Syringic and ferulic acids (at 1.0g.L-1) and coumaric acid (at 0.6 and 1.0 g.L-1) highly inhibited the microbial growth (about 50 %), increased the deviation of glucose to produce the glycerol and made slower the glucose consumption, reducing Qp. Coumaric and ferulic acids were the greatest inhibitors compounds for the baker\'s yeast S. cerevisiae. For Saccharomyces cerevisiae PE-2, the presence of vanillin led to a Qp reduction, based on the initial difficult in substrate consumption. Vanillic and syringic acids were extremely inhibitory, making difficult the glucose consumption, reducing Qp and increasing both, glycerol and acetic acid production by deviation of glucose. Coumaric and ferulic acids increased the cellular yield (about 48 and 80 %). Concerning the bioconvertion of the phenolic acids by S. cerevisiae PE-2, only those molecules presenting the benzilic carboxyl group (4-hydroxybenzoic, vanillic and syringic acids) did not reacted. In contrast, aldehydes were rapidly transformed into their respective acids and alcohols (being this last one probably formed in greater amount). S. cerevisiae PE-2 was also capable to convert coumaric and ferulic acids, however, herein none products were identified. Thus, the compounds most affect ethanol productivity than the cellular mass yield. The ethanol yield was not affected by any of the compounds. Some of them led to a greater glucose deviation to produce glycerol and acetic acid. This work confirmed previously data published in the literature indicating that the inhibition of fermentative process did not depend exclusively on the compounds, but also its concentration and microorganism type.

Na busca por soluções que maximizem a produção de etanol, o melhoramento genético de diferentes linhagens de levedura tornou-se foco de investigação em diversos centros de pesquisa. Com o recente sequenciamento de uma linhagem selvagem utilizada nas usinas sucroalcooleiras brasileiras, a linhagem PE-2 da espécie Saccharomyces cerevisiae, surgiu o interesse em estudar sua dinâmica durante o processo de fermentação a fim de encontrar aspectos que possam explicar como estas se tornaram mais adaptadas às dornas de fermentação mantendo a alta produtividade de bioetanol. A partir da análise transcricional da linhagem PE-2, Buscamos por métodos de inferência de redes que possam representar a dinâmica dessa levedura. Propomos nesse trabalho a modelagem de dados experimentais temporais das linhagens PE-2 e S288c (utilizada como referência) baseado em um modelo de Redes Booleanas. Trata-se de um modelo onde convertemos dados contínuos em dados discretos (0 or 1) no qual, de acordo com restrições ditadas pelo modelo, são inferidas redes que representem interações gênicas ao longo do tempo baseados nas amostras temporais. Conseguimos modelar, com sucesso, algumas redes utilizando conjuntos com 11 e 12 genes relacionados a genes pertencentes à via da glicólise e fermentação da levedura. / Ethanol production improvements give rise to the breeding of yeast strains, that became the investigation focus in several research centers. Recently, a wild strain used in Brazilian sugarcane industry was sequenced, the PE-2 strain of Saccharomyces cerevisiae, and this event brought an interest in studying the dynamics of the fermentation of this strain in order to understand which aspects this strain become more adapted to the fermentation conditions, maintaining a high capacity to produce bioethanol. From the analysis of transcriptional strain PE-2, we seek for inference networks methods that can represent the dynamics of this yeast.In this work, we model an experimental temporal data of strain PE-2 and strain S288c (used as a reference) based on Boolean networks model. In this model, the data are converted from continuous into discrete data (0 or 1) and, based on constraints rules of Boolean Network model, networks are inferred to represent gene interactions over time based on temporal data. We successfully model networks using a set with 11 and 12 genes related to yeast glycolysis and fermentation pathways.

Este trabalho teve como objetivo o estudo de parâmetros experimentais do fracionamento do bagaço de cana-de-açúcar, tais como o tipo de ácido (H3PO4 1,5 % m/v e H3SO4 1,0 % m/v) empregado como catalisador na etapa de pré-tratamento em reator piloto (350 L) a 120 ºC por 20 min. Avaliou-se também os efeitos de temperatura, tempo, concentração de hidróxido de sódio e relação sólido-líquido, de acordo com um planejamento fatorial completo 24 com três repetições no ponto central, para a etapa de deslignificação alcalina em reator de bancada (2 L) do bagaço de cana-de-açúcar previamente pré-tratado de forma a obter uma fração celulósica com elevadas taxas de conversão enzimática e maior recuperação de lignina no licor negro. As melhores condições experimentais obtidas em reator de bancada para o processo de deslignificação alcalina foram reproduzidas em reator piloto de 350 L, como forma de escalonamento deste processo. As ligninas obtidas foram caracterizadas e a fração celulósica da polpa bruta do bagaço pré-tratado com ácido fosfórico foi submetida à hidrólise enzimática de forma a obter quantidade de hidrolisado suficiente para a realização de um ensaio de fermentação alcoólica, com Saccharomyces cerevisiae Pe-2, em biorreator de 700 mL de volume de trabalho, empregando a tecnologia de reciclo de células. Os resultados mostraram que o pré-tratamento com H3PO4 1,5 % (m/v) removeu 45,5 % de hemicelulose, contra 75,6 % pelo pré-tratamento com H3SO4 1,0 % (m/v). Os fatores concentração de NaOH e relação sólido-líquido apresentaram maior influência do que os fatores tempo e temperatura, no processo de deslignificação alcalina dos bagaços pré-tratados, sendo reproduzidas em escala piloto as condições 120 ºC, 30 min, NaOH 1,5 % (m/v) e relação sólido-líquido 1:15. Estas condições de reação proporcionaram a obtenção de polpas celulósicas com conversão enzimática próxima a 80 %. Análises das polpas celulósicas por difração de raios X comprovam um aumento de cristalinidade da celulose, proporcionada pela remoção de hemicelulose e lignina. Já a análise de termoporometria mostrou um aumento do tamanho dos poros na estrutura da celulose, ao longo do seu processamento. Imagens de microscopia eletrônica de varredura mostram uma maior exposição das fibras celulósicas no bagaço de cana após a deslignificação alcalina. O ensaio de fermentabilidade mostrou que o hidrolisado celulósico foi bem assimilado pela levedura Saccharomyces cerevisiae Pe-2, com a possibilidade da realização de 5 bateladas sucessivas, sendo obtidos valores de 0,45 g/g para YP/S e 5,81 g L-1h-1 para produtividade. As ligninas obtidas apresentaram características muito parecidas entre si com pureza (lignina total) entre 95-97 %, massa molar média entre 9500 e 10200 g mol-1, ponto de transição vítrea entre 140 e 160 ºC, poder calorífico na ordem de 25 MJ/kg, sendo atribuída a razão H:G:S de 1:0,9:1,1 para a lignina (ácido fosfórico) e 1:1,4:1,7 para a lignina (ácido sulfúrico). Pelos resultados de caracterização foram também propostas as fórmulas C9H8,57O2,64 (OCH3)1,00 para a lignina (ácido fosfórico) e C9H9,05O3,19 (OCH3)0,92 para a lignina (ácido sulfúrico). Palavras-chave: Fracionamento do bagaço de cana-de-açúcar. Etanol. Saccharomyces cerevisiae Pe-2. Reciclo de células. Caracterização de ligninas. / This work aimed to the study of experimental parameters of sugarcane bagasse fractionation, such as, the type of acid (H3PO4 1.5 % w/v and H2SO4 1.0 % w/v) employed as catalyst in the pretreatment step carried out in a 350 L pilot reactor at 120 ºC for 20 min. Temperature, time, NaOH concentration and solid to liquid ratio effects were also evaluated according to a 24 full factorial design with three replications in the central point, for the alkaline delignification of pretreated bagasse, carried out in a 2 L reactor, aiming to get cellulosic fraction with high enzymatic conversion rates and greater lignin recovery in black liquor. Scaling up the alkaline delignification process, the best experimental conditions obtained from 2 L reactor were reproduced in 350 L reactor. Lignins obtained were characterized and the cellulosic fraction from bagasse pulp pretreated with H3PO4 was subjected to enzymatic hydrolysis in order to obtain sufficient amount of hydrolysate to conduct an alcoholic fermentation assay with Saccharomyces cerevisiae Pe-2 yeast in a bioreactor with 700 mL working volume, employing the cell recycle technology. The results showed that 45.5 % of hemicellulosic fraction were solubilised by H3PO4 1.5 % w/v pretreatment, versus 75.6 % of hemicellulose that was solubilised by H2SO4 1.0 % w/v. In the alkaline delignification process of pretreated sugarcane bagasse, NaOH concentration and solid to liquid ratio factors had higher influence than the time and temperature factors, with 120 ºC, 30 min, NaOH 1.5 % (w/v) and 1:15 solid to liquid ratio conditions performed in pilot scale. Enzymatic conversion near to 80 % was achieved for cellulosic pulps obtained in these alkaline delignification conditions. X-ray diffraction of cellulosic pulps confirms an increase of cellulose crystallinity, proportioned by hemicellulose and lignin removal. In relation to thermoporometry analysis, an increasing of pore large in cellulose structure was observed, throughout its processing. Scanning electronic microscopy images showed more exposed cellulosic fibers after alkaline delignification. The cellulosic hydrolysate was well assimilated by the Saccharomyces cerevisiae Pe-2 yeast, with the possibility of performing five successive batches, with 0.45 g/g for YP/S and 5.81 g L-1h-1 for productivity, as resulted of fermentation assay. Lignin obtained showed very similar characteristics each other with purity (total lignin) between 95-97 %, average molecular weight between 9500 and 10200 g mol-1, glass transition point between 140 and 160 ºC, calorific value of 25 MJ/kg being attributed H:G:S ratio of 1:0.9:1.1 for lignin (phosphoric acid) and 1:1.4:1.7 ratio for lignin (sulfuric acid). Lignin formulas C9H8.57O2.64 (OCH3)1.00 to lignin (phosphoric acid) and C9H9.05O3.19 (OCH3)0.92 to lignin (sulfuric acid) were also proposed by the characterization results.

No Brasil, a produção de etanol é feita exclusivamente por via fermentativa. Devido ao baixo teor alcoólico do vinho (8 a 10 % v v-1), para cada litro de etanol produzido são gerados de 10 a 12 litros de vinhaça. Este subproduto é rico em matéria orgânica (matéria orgânica variável de 15 a 37 Kg m3 vinhaça, dependendo do tipo de mosto) e pode ser usado como adubo líquido na lavoura. Porém, a vinhaça no solo junto com outros efluentes líquidos, são fontes potenciais de poluição que podem contaminar águas subterrâneas. Por esses motivos, o objetivo deste trabalho foi produzir etanol a partir de fermentações com altos teores de açúcar, a partir da tecnologia VHG (Very High Gravity), visando a obtenção de vinhos com altos teores alcoólicos e com isso reduzir a quantidade de vinhaça gerada por litro de etanol produzido. Para tal foi realizada a adaptação da levedura PE-2 em meio de cultivo com crescentes concentrações de açúcares (9 a 24oBrix), sob 30oC. Nestas condições foi possível adaptar a célula das leveduras dessa linhagem em fermentações com altos teores de açúcar, sem promover morte celular ou perda visível da produtividade. Também foi observado que os volumes de vinhaça gerados em meios com altas concentrações de açúcar sofreram diminuição de até 72%. Ainda foi possível verificar que a levedura PE-2 se adaptou às concentrações crescentes de açúcar do mosto, mostrando tolerância em vinhos com altos níveis de álcool no final da fermentação, com alta viabilidade celular após o reciclo das células e não apresentou alterações morfológicas significativas na parede celular, quando observadas no microscópio eletrônico de varredura. Conclui-se que, é possível fazer a adaptação da levedura PE-2 em mostos com até 24 ºBrix. A adaptação dessa levedura em mostos com altos teores de açúcar na fermentação permite a diminuição de até 72 % do volume de vinhaça gerado / In Brazil, ethanol production is made only by fermentative pathway. Due to low alcohol wine (8-10% v v-1), per liter of ethanol produced are generated from 10 to 12 liters of vinasse. This by-product is rich in organic matter (organic matter variable 15- 37 Kg m3 vinasse, depending on the type of wine) and can be used as liquid fertilizer in agriculture. However, vinasse in the soil along with other liquid effluents, are potential sources of pollution that can contaminate groundwater. For these reasons, the objectives of this work was to produce ethanol from fermentation with high levels of sugar, from the VHG (Very High Gravity) technology in order to produce wines with high alcohol levels and thereby decrease the amount of vinasse produced per liter of ethanol. For this adaptation of the yeast PE-2 in media with increasing concentrations of sugars (9 to 24 oBrix) under 30 °C was performed. Under these conditions it was possible to adapt the yeast cells of this strain in fermentations with high sugar contents, without promoting cell death or visible loss of productivity. It was also noted that the volumes of vinasse generated in media with high concentrations of sugar suffered decrease of up to 72%. Still been possible to see that the PE-2 yeast has adapted to increasing concentrations of sugar in the must, showing tolerance for wines with high alcohol levels at the end of fermentation with high cell viability after the cells recycle and no significant morphological changes in cell wall, as observed in the scanning electron microscope. It is concluded that it is possible to adapt the yeast PE-2 in musts with up to 24 ºBrix. The adaptation of this yeast in musts with high levels of sugar in the fermentation allows the decrease of up to 72% of the volume of vinasse generated

Este trabalho teve como objetivo o estudo de parâmetros experimentais do fracionamento do bagaço de cana-de-açúcar, tais como o tipo de ácido (H3PO4 1,5 % m/v e H3SO4 1,0 % m/v) empregado como catalisador na etapa de pré-tratamento em reator piloto (350 L) a 120 ºC por 20 min. Avaliou-se também os efeitos de temperatura, tempo, concentração de hidróxido de sódio e relação sólido-líquido, de acordo com um planejamento fatorial completo 24 com três repetições no ponto central, para a etapa de deslignificação alcalina em reator de bancada (2 L) do bagaço de cana-de-açúcar previamente pré-tratado de forma a obter uma fração celulósica com elevadas taxas de conversão enzimática e maior recuperação de lignina no licor negro. As melhores condições experimentais obtidas em reator de bancada para o processo de deslignificação alcalina foram reproduzidas em reator piloto de 350 L, como forma de escalonamento deste processo. As ligninas obtidas foram caracterizadas e a fração celulósica da polpa bruta do bagaço pré-tratado com ácido fosfórico foi submetida à hidrólise enzimática de forma a obter quantidade de hidrolisado suficiente para a realização de um ensaio de fermentação alcoólica, com Saccharomyces cerevisiae Pe-2, em biorreator de 700 mL de volume de trabalho, empregando a tecnologia de reciclo de células. Os resultados mostraram que o pré-tratamento com H3PO4 1,5 % (m/v) removeu 45,5 % de hemicelulose, contra 75,6 % pelo pré-tratamento com H3SO4 1,0 % (m/v). Os fatores concentração de NaOH e relação sólido-líquido apresentaram maior influência do que os fatores tempo e temperatura, no processo de deslignificação alcalina dos bagaços pré-tratados, sendo reproduzidas em escala piloto as condições 120 ºC, 30 min, NaOH 1,5 % (m/v) e relação sólido-líquido 1:15. Estas condições de reação proporcionaram a obtenção de polpas celulósicas com conversão enzimática próxima a 80 %. Análises das polpas celulósicas por difração de raios X comprovam um aumento de cristalinidade da celulose, proporcionada pela remoção de hemicelulose e lignina. Já a análise de termoporometria mostrou um aumento do tamanho dos poros na estrutura da celulose, ao longo do seu processamento. Imagens de microscopia eletrônica de varredura mostram uma maior exposição das fibras celulósicas no bagaço de cana após a deslignificação alcalina. O ensaio de fermentabilidade mostrou que o hidrolisado celulósico foi bem assimilado pela levedura Saccharomyces cerevisiae Pe-2, com a possibilidade da realização de 5 bateladas sucessivas, sendo obtidos valores de 0,45 g/g para YP/S e 5,81 g L-1h-1 para produtividade. As ligninas obtidas apresentaram características muito parecidas entre si com pureza (lignina total) entre 95-97 %, massa molar média entre 9500 e 10200 g mol-1, ponto de transição vítrea entre 140 e 160 ºC, poder calorífico na ordem de 25 MJ/kg, sendo atribuída a razão H:G:S de 1:0,9:1,1 para a lignina (ácido fosfórico) e 1:1,4:1,7 para a lignina (ácido sulfúrico). Pelos resultados de caracterização foram também propostas as fórmulas C9H8,57O2,64 (OCH3)1,00 para a lignina (ácido fosfórico) e C9H9,05O3,19 (OCH3)0,92 para a lignina (ácido sulfúrico). Palavras-chave: Fracionamento do bagaço de cana-de-açúcar. Etanol. Saccharomyces cerevisiae Pe-2. Reciclo de células. Caracterização de ligninas. / This work aimed to the study of experimental parameters of sugarcane bagasse fractionation, such as, the type of acid (H3PO4 1.5 % w/v and H2SO4 1.0 % w/v) employed as catalyst in the pretreatment step carried out in a 350 L pilot reactor at 120 ºC for 20 min. Temperature, time, NaOH concentration and solid to liquid ratio effects were also evaluated according to a 24 full factorial design with three replications in the central point, for the alkaline delignification of pretreated bagasse, carried out in a 2 L reactor, aiming to get cellulosic fraction with high enzymatic conversion rates and greater lignin recovery in black liquor. Scaling up the alkaline delignification process, the best experimental conditions obtained from 2 L reactor were reproduced in 350 L reactor. Lignins obtained were characterized and the cellulosic fraction from bagasse pulp pretreated with H3PO4 was subjected to enzymatic hydrolysis in order to obtain sufficient amount of hydrolysate to conduct an alcoholic fermentation assay with Saccharomyces cerevisiae Pe-2 yeast in a bioreactor with 700 mL working volume, employing the cell recycle technology. The results showed that 45.5 % of hemicellulosic fraction were solubilised by H3PO4 1.5 % w/v pretreatment, versus 75.6 % of hemicellulose that was solubilised by H2SO4 1.0 % w/v. In the alkaline delignification process of pretreated sugarcane bagasse, NaOH concentration and solid to liquid ratio factors had higher influence than the time and temperature factors, with 120 ºC, 30 min, NaOH 1.5 % (w/v) and 1:15 solid to liquid ratio conditions performed in pilot scale. Enzymatic conversion near to 80 % was achieved for cellulosic pulps obtained in these alkaline delignification conditions. X-ray diffraction of cellulosic pulps confirms an increase of cellulose crystallinity, proportioned by hemicellulose and lignin removal. In relation to thermoporometry analysis, an increasing of pore large in cellulose structure was observed, throughout its processing. Scanning electronic microscopy images showed more exposed cellulosic fibers after alkaline delignification. The cellulosic hydrolysate was well assimilated by the Saccharomyces cerevisiae Pe-2 yeast, with the possibility of performing five successive batches, with 0.45 g/g for YP/S and 5.81 g L-1h-1 for productivity, as resulted of fermentation assay. Lignin obtained showed very similar characteristics each other with purity (total lignin) between 95-97 %, average molecular weight between 9500 and 10200 g mol-1, glass transition point between 140 and 160 ºC, calorific value of 25 MJ/kg being attributed H:G:S ratio of 1:0.9:1.1 for lignin (phosphoric acid) and 1:1.4:1.7 ratio for lignin (sulfuric acid). Lignin formulas C9H8.57O2.64 (OCH3)1.00 to lignin (phosphoric acid) and C9H9.05O3.19 (OCH3)0.92 to lignin (sulfuric acid) were also proposed by the characterization results.

No Brasil, a produção de etanol é feita exclusivamente por via fermentativa. Devido ao baixo teor alcoólico do vinho (8 a 10 % v v-1), para cada litro de etanol produzido são gerados de 10 a 12 litros de vinhaça. Este subproduto é rico em matéria orgânica (matéria orgânica variável de 15 a 37 Kg m3 vinhaça, dependendo do tipo de mosto) e pode ser usado como adubo líquido na lavoura. Porém, a vinhaça no solo junto com outros efluentes líquidos, são fontes potenciais de poluição que podem contaminar águas subterrâneas. Por esses motivos, o objetivo deste trabalho foi produzir etanol a partir de fermentações com altos teores de açúcar, a partir da tecnologia VHG (Very High Gravity), visando a obtenção de vinhos com altos teores alcoólicos e com isso reduzir a quantidade de vinhaça gerada por litro de etanol produzido. Para tal foi realizada a adaptação da levedura PE-2 em meio de cultivo com crescentes concentrações de açúcares (9 a 24oBrix), sob 30oC. Nestas condições foi possível adaptar a célula das leveduras dessa linhagem em fermentações com altos teores de açúcar, sem promover morte celular ou perda visível da produtividade. Também foi observado que os volumes de vinhaça gerados em meios com altas concentrações de açúcar sofreram diminuição de até 72%. Ainda foi possível verificar que a levedura PE-2 se adaptou às concentrações crescentes de açúcar do mosto, mostrando tolerância em vinhos com altos níveis de álcool no final da fermentação, com alta viabilidade celular após o reciclo das células e não apresentou alterações morfológicas significativas na parede celular, quando observadas no microscópio eletrônico de varredura. Conclui-se que, é possível fazer a adaptação da levedura PE-2 em mostos com até 24 ºBrix. A adaptação dessa levedura em mostos com altos teores de açúcar na fermentação permite a diminuição de até 72 % do volume de vinhaça gerado / In Brazil, ethanol production is made only by fermentative pathway. Due to low alcohol wine (8-10% v v-1), per liter of ethanol produced are generated from 10 to 12 liters of vinasse. This by-product is rich in organic matter (organic matter variable 15- 37 Kg m3 vinasse, depending on the type of wine) and can be used as liquid fertilizer in agriculture. However, vinasse in the soil along with other liquid effluents, are potential sources of pollution that can contaminate groundwater. For these reasons, the objectives of this work was to produce ethanol from fermentation with high levels of sugar, from the VHG (Very High Gravity) technology in order to produce wines with high alcohol levels and thereby decrease the amount of vinasse produced per liter of ethanol. For this adaptation of the yeast PE-2 in media with increasing concentrations of sugars (9 to 24 oBrix) under 30 °C was performed. Under these conditions it was possible to adapt the yeast cells of this strain in fermentations with high sugar contents, without promoting cell death or visible loss of productivity. It was also noted that the volumes of vinasse generated in media with high concentrations of sugar suffered decrease of up to 72%. Still been possible to see that the PE-2 yeast has adapted to increasing concentrations of sugar in the must, showing tolerance for wines with high alcohol levels at the end of fermentation with high cell viability after the cells recycle and no significant morphological changes in cell wall, as observed in the scanning electron microscope. It is concluded that it is possible to adapt the yeast PE-2 in musts with up to 24 ºBrix. The adaptation of this yeast in musts with high levels of sugar in the fermentation allows the decrease of up to 72% of the volume of vinasse generated

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4058.pdf: 1157673 bytes, checksum: 2346bf567a5ddfbb9217c250df00ce8e (MD5) Previous issue date: 2011-09-09 / Universidade Federal de Sao Carlos / Saccharomyces cerevisiae is the most important microorganism used in alcoholic fermentation process. A strain of Saccharomyces cerevisiae widely used to produce alcohol in Brazil is the PE-2, due to its high fermentation capacity. The goal of this study was to develop an expression system for recombinant proteins using the industrial strain of Saccharomyces cerevisiae, PE-2. The protein chosen to be used as a model for this system was the Cane-CPI-1, an inhibitor of cysteine protease. Initially the construction of plasmids containing CaneCPI-1 gene was performed and yeast cells were transformed with pYADE4-CaneCPI-1 construction. The transformed strain was submitted to expression analyses during batch fermentative process with cell recycle. The recombinant protein was expressed in yeast cells and it was possible to purify the recombinant protein by affinity chromatography on nickel column. This purified protein was immunodetected using a polyclonal anti-CaneCPI-1antibody and monoclonal anti His-Tag antibody, which were also able to detect the CaneCPI-1 in a crude extract from Saccharomyces cerevisiae cells. Assays of inhibitory activity performed with the purified CaneCPI-1 revealed its ability to inhibit the catalytic activity of a cysteine proteinase. This study showed that the use of transformed strain did not affect the fermentation process and that the PE-2 industrial strain of S. cerevisiae can be a viable expression system for recombinant protein production and open perspectives for production of any protein of biotechnological applications during fermentation alcoholic process. / Saccharomyces cerevisiae é o microrganismo mais importante usado no processo de fermentação alcoólica. Uma linhagem de S. cerevisiae amplamente utilizado para produzir álcool no Brasil é a PE-2, devido à sua alta capacidade de fermentação e persistência no sistema. Neste trabalho utilizou-se esta linhagem industrial de levedura como um sistema de expressão de proteínas de interesse biotecnológico. A proteína escolhida como modelo para este sistema foi a CaneCPI-1, uma cistatina de cana-de-açúcar que possui ação inseticida. Inicialmente, foi realizada a construção de um plasmídeo contendo o gene que codifica para a proteína CaneCPI-1 e este foi utilizado para transformar células da levedura S.cerevisiae linhagem PE-2. Posteriormente foram realizados sucessivos ciclos de fermentação (5 ciclos) com esta levedura transformada e as células fermentadas foram submetidas a análises de expressão da proteína CaneCPI-1. Foi possível purificar a proteína recombinante por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. Anticorpo policlonal anti-CaneCPI-1 e anticorpo monoclonal anti-His-Tag foram capazes de imunodetectar a proteína purificada e no extrato proteico bruto do último ciclo fermentativo. Ensaios da atividade inibitória mostraram que a CaneCPI-1 purificada foi capaz de inibir a atividade hidrolítica da papaína. A utilização da linhagem transformada não afetou a eficiência do processo fermentativo durante os quatro primeiros reciclos. A produção da CaneCPI-1 em uma linhagem industrial de S. cerevisiae ao longo do processo fermentativo se mostrou viável, abrindo-se novas perspectivas para a produção de qualquer proteína de aplicações biotecnológicas durante o processo de fermentação alcoólica.