Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / As três desiodases de iodotironina catalizam a iniciação (D1, D2) e o término (D3) dos efeitos dos hormônios tireoideanos nos vertebrados. Enquanto D1 e D3 são proteínas de meia-vida longa localizadas na membrana plasmática, a D2 é uma proteína residente do retículo endoplasmático com meia-vida de apenas 20 min. Nesta série de estudos, foram investigados: (1) os efeitos causados pela combinação da disrupção do gene da D2 (Dio2-/-) com a deficiência familiar de D1 (camundongos C3H) na homeostase do hormônio tiroideano e apesar da múltipla deficiência de D1 e D2, animais C3H-D2KO apresentam T3 sérico na faixa eutiroidea, sugerindo mecanismos compensatórios, que promovem (i) aumento de aproximadamente 2 vezes nos níveis de T4 sérico, comparando com camundongos da linhagem C57/BL6 (C57) e, (ii) aumento da atividade de D1 hepática e renal, 8,4 e 2,0 vezes, respectivamente, em comparação com animais C3H. E ainda, este mecanismo compensatório não depende de aumento da atividade da glândula tiróide ou diminuição do “clearance” de T3 mediado pela D3; (2) o papel da D2 no sistema de retroalimentação negativa do TSH mediado pelo T4 na pituitária, o qual se revelou fundamental neste sistema e que, apesar de sofrer degradação induzida pelo substrato como em qualquer outro tecido que expressa D2, a alta taxa de síntese da enzima assegura atividade e, conseqüentemente, produção constante de T3, mesmo na vigência de doses de T4 muito acima do fisiológico; (3) a importância da geração de T3 adaptativa mediada pela D2 para a resposta termogênica do BAT, a qual não está limitada a mediar a responsividade à catecolaminas, mas também promover lipogênese no tecido, essencial para fornecer substrato para oxidação mitocondrial e, conseqüentemente, desacoplamento e geração de calor; (4) o papel da D2 na conversão da célula pré-adiposa marrom em célula madura, que confirmou in vitro a importância da D2 para a capacidade termogênica deste tipo celular e seu papel chave no recrutamento do programa de diferenciação, o qual, na ausência de D2, apresenta um déficit de ~25%. / The three iodothyronine deiodinases catalyze the initiation (D1,D2) and termination (D3) of thyroid hormone effects in vertebrates. While D1 and D3 are long-lived plasma membrane proteins, D2 is an endoplasmic reticulum resident protein with a half-life of only 20 min. In these series of studies, we investigated: (1) the effects in thyroid hormone homeostasis caused by the combined targeted disruption of D2 gene (Dio2-/-) and inbred D1 deficiency (C3H mice), and despite the multiple D1 and D2 deficiency, C3H-D2KO animals present serum T3 in the euthyroid range, suggesting compensatory mechanisms that promote (i) ~2 fold increase in serum T4, when compared to C57/BL6 (C57) mice and (ii) increase in hepatic and renal D1 activity of 8.4 and 2.0 fold, respectively, when comparing to C3H animals. Furthermore, this compensatory mechanism does not depend on increased thyroidal activity or decreased in D3-mediated T3 clearance.; (2) D2 role in the T4-mediated TSH feedback in the pituitary, which place D2 in a pivotal role in this system, and despite being target to the substrate induced degradation as in any other D2-expressing tissue, the high rate of D2 synthesis assure activity, and consequently, constant T3 production, even at high doses of T4, well above the physiological levels; (3) the importance of adaptive D2-mediated T3 generation to the BAT thermogenic response, which is not limited to mediate responsiveness to catecholamines, but also promote lipogenesis in the tissue, essential to make available substrate for mitochondrial oxidation and, consequently, uncoupling and heat generation; (4) D2 role in brown pre-adipocyte to mature cell conversion, confirming in vitro the importance of D2 to this cell type thermogenic capacity, and its key role in the differentiation program recruitment, which in D2 absence, presents a ~25% déficit. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima derivada de leucócitos que catalisa a formação de numerosas espécies reativas oxidantes. Além de integrantes da resposta imune inata, evidências têm comprovado a contribuição destes oxidantes para o dano tecidual durante inflamação. A MPO participa de atividades biológicas pró-aterogênicas relacionadas à evolução da doença cardiovascular, incluindo iniciação, propagação e as fases de complicação aguda do processo aterosclerótico. Desta forma, a MPO e sua cascata inflamatória representam um alvo atrativo para investigação prognóstica e terapêutica na doença aterosclerótica cardiovascular. Vários estudos apontam para o efeito independente dos níveis de MPO na evolução da doença e ocorrência de eventos em pacientes com síndrome coronariana aguda. Entretanto, ainda não é consistente o valor preditivo adicional da dosagem de MPO na estratificação de risco cardiovascular para incorporá-la à prática clínica como sinalizadora de vulnerabilidade de placa. Estudos adicionais são necessários para avaliar os níveis de MPO como preditor de risco cardiovascular em curto e longo prazo, bem como o potencial benefício em utilizá-la para definir estratégias terapêuticas, além da padronização do ensaio, ponto fundamental para a transição desse marcador do ambiente de pesquisa para uso na rotina clínica.

CARVALHO, F. E. L. A superexpressão de proteínas relacionadas com atividades fotoquímica e fotorespiratória induzida por silenciamento das APX citosólicas contribui para uma fotoinibição similar a de arroz não-transformado submetido à alta luz. 2013. 118 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-01-20T18:03:08Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_felcarvalho.pdf: 6791804 bytes, checksum: 7a0dd96f599fa1365821ce8e5dedba09 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-02-27T19:24:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_felcarvalho.pdf: 6791804 bytes, checksum: 7a0dd96f599fa1365821ce8e5dedba09 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-27T19:24:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_felcarvalho.pdf: 6791804 bytes, checksum: 7a0dd96f599fa1365821ce8e5dedba09 (MD5) Previous issue date: 2013 / In tropical regions, where there is a high incidence of light, electrons can accumulate in the transport chain (PET) producing large quantities of H2O2 and other ROS, which might generate photodamage and photoinhibition. To survive to these challenges, plants have developed several mechanisms to mitigate the excess energy in photosystems, besides having an efficient machinery for removal of excess H2O2, which includes cytosolic APX (cAPX). However, double-silenced rice plants for cAPX (OsAPX1/2) do not show large differences in morpho-phenotype when compared to non-transformed (NT), although OsAPX1/2 presents induction of expression on several proteins related to photosynthesis. The physiological implications of this induction, as well as its consequences for OsAPX1/2 resistance against stresses of high light (HL), are still poorly known. Aiming to clarify the role of cAPx in photosynthesis, OsAPX1/2 plants were produced, subjected to 24 hours of HL (2,000 μmol m-2s-1) and studied for the expression and activity of proteins related to photosynthesis, photorespiration and redox homeostasis. The amount of several PET proteins (Lhcb1, PsbO, PsbP, PsbQ, PSAC, PC, FNR and FDX) and Chl and Pheo were increased in OsAPX1/2 in normal growth conditions, however without causing changes in the in vivo photochemistry activity parameters (Fv/Fm and ΔFm/Fm'). In contrast, expression of proteins associated with Calvin-Benson cycle (Rls, ativase RBC) and rubisco carboxylation activity (in vivo and in vitro) were not altered in mutants under normal growth conditions. In HL, the expression of proteins related to photosynthesis was strongly repressed in all genotypes, as well as gas exchange parameters and Fv/Fm, the latter being strong indication of photoinhibition. Moreover, proteins related to photorespiration showed increased expression/activity in response to HL in NT and maintenance of already high levels in OsAPX1/2. In OsAPX1/2 the expression and activity of chloroplastic Cu/Zn-SOD showed a similar response exhibited by photorespiration-related proteins, although the activity of thylakoid APX has been greatly reduced, meaning deficiency in water-water cycle. Taken together, these data demonstrate that induction of expression of proteins related PET in OsAPX1/2 plants may represent a compensatory mechanism for maintaining the photosynthetic activity levels similar to NT. Moreover, in HL, it is possible that the increased expression of photorespiration-related proteins in OsAPX1/2 acts as alternative electron sink, compensating the deficiency in the water-water cycle from these plants. / Em regiões tropicais, onde existe alta incidência luminosa, os elétrons podem se acumular na cadeia transportadora (PET) produzindo grandes quantidades de H2O2 e outras ROS, que podem gerar fotodano e fotoinibição. Para sobreviver a esse desafio, plantas desenvolveram vários mecanismos de atenuação do excesso de energia nos fotossistemas, além de contar com uma eficiente maquinaria de remoção do excesso de H2O2, da qual fazem parte as APX citosólicas (cAPX). Entretanto, plantas duplamente silenciadas para as cAPX (OsAPX1/2) não apresentam grandes diferenças morfo-fenotípicas quando comparadas às não transformadas (NT), embora OsAPX1/2 apresente indução de expressão de diversas proteínas relacionadas com a fotossíntese, comparadas com as NT. As implicações fisiológicas dessa indução, assim como suas consequências para a resistência de OsAPX1/2 contra estresses de alta luz (HL), ainda são pouco conhecidas. Objetivando clarificar o papel das cAPx na fotossíntese, plantas de arroz OsAPX1/2 foram produzidas, submetidas a 24 horas de HL (2000 μmol m-2s-1) e estudadas quanto à expressão e atividade de proteínas relacionadas com a fotossíntese, fotorespiração e homeostase redox. A quantidade de diversas proteínas da PET (Lhcb1, PsbO, PsbP, PsbQ, PSAC, PC, e FDX FNR), bem como teores de Chl e Pheo foram aumentadas em OsAPX1/2 em condições normais de crescimento sem causar alterações nos parâmetros de atividade fotoquímica in vivo (Fv/Fm e Fm/Fm'). Em contraste, as proteínas relacionadas com expressão ciclo de Calvin-Benson (Rls, ativase de Rbc) e a atividade de carboxilação da rubisco (in vivo e in vitro) não foram alterados nos mutantes em condições normais de crescimento. Em HL, a expressão de proteínas relacionadas com fotossíntese foi fortemente reprimida em ambos os genótipos, assim como os parâmetros de trocas gasosas e Fv/Fm, sendo esse último forte indício de fotoinibição. Por outro lado, as proteínas relacionadas com a fotorespiração, ou mostraram aumento na expressão/atividade em resposta à luz elevada (NT) ou manutenção de níveis já elevados (OsAPX1/2). A expressão e atividade de Cu/Zn-SOD de cloroplastos mostrou resposta similar a exibida pelas proteínas da fotorespiração, embora a atividade de APX de tilacóides tenha sido fortemente reduzida em OsAPX1/2, evidenciando deficiência no ciclo água-água. Tomados em conjunto, estes dados demonstram que a indução da expressão de proteínas relacionadas com o PET em OsAPX1/2 pode representar um mecanismo compensatório para a manutenção da atividade fotossintética aos níveis da NT. Por outro lado, sob HL, é possível que o aumento da expressão de proteínas associadas com fotorespiração em OsAPX1/2 atue como dissipador alternativo de elétrons, compensando a deficiência no ciclo da água-água dessas plantas

As espécies reativas de oxigênio (ERO) afetam significativamente a homeostase redox celular. No entanto, o peróxido de hidrogênio (H2O2), uma das ERO mais estudadas, é considerado regulador chave em uma série de processos fisiológicos, dependendo de sua concentração na célula: em baixas concentrações atua como molécula sinalizadora envolvida na aclimatação da planta a estresses, desencadeando tolerância a estresses bióticos e abióticos; por outro lado, em altas concentrações o H2O2 pode levar à morte celular. Gradientes de ERO e fitohormônios têm influência nas respostas de crescimento local e consecutivamente afetam o estado redox celular. Diversos fitohormônios afetam a sinalização redox celular controlando processos de crescimento e defesa. Os níveis de H2O2 intracelulares são controlados pela ação de diversas enzimas da classe das peroxidases e catalases. Dentre as peroxidases, a família de proteínas GPX pode ser encontrada em praticamente todos os reinos e vem sendo cada vez mais estudada em plantas. Em arroz, essa família é composta de cinco genes, enquanto em Arabidopsis foram identificados oito genes. Este trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente as GPX mitocondriais e cloroplastídica de arroz e sete dos oito genes de Arabidopsis thaliana. Mutantes knockout de Arabidopsis para os genes AtGPX1, AtGPX2, AtGPX3, AtGPX4, AtGPX6, AtGPX7 e AtGPX8 foram obtidos.Nesta espécie, pelo menos AtGPX2, AtGPX3 e AtGPX6 são necessárias para a correta formação da arquitetura da raiz dependente dos hormônios ABA, auxina e SL. O sileciamento por RNAi em arroz para os genes OsGPX1, OsGPX3 e OsGPX4 gerou plantas com crescimento deficiente de raiz, parte área e formação de panículas. A redução em 80% da expressão gênica da isoforma cloroplastídica (OsGPX4) foi letal para o desenvolvimento de plântulas regeneradas a partir de calos de arroz, enquanto que a redução da expressão de 40% e 95% de OsGPX1 (GPX1s) e OsGPX3 (GPX3s), respectivamente, não impediu a regeneração de plantas. No entanto, plantas GPX1s apresentaram menor tamanho, menor número de panículas e menor produção de sementes em comparação com as plantas NT (não transformadas). Adicionalmente, plantas GPX3s apresentaram redução do comprimento tanto da parte aérea quanto das raízes, além de acúmulo de H2O2 cerca de vinte vezes maior do que a planta NT. Neste trabalho, foi demonstrada a participação das enzimas GPX durante o desenvolvimento vegetativo e reprodutivo de plantas de arroz e o estabelecimento da arquitetura da raiz dependente de hormônios em Arabidopsis. O conjunto de dados obtidos contribuempara o entendimento do papel dessas enzimas na homeostase redox, como também na interação com fitohormônios nos processos de desenvolvimento e defesa vegetais. / Reactive oxygen species (ROS) affect significantly cellular redox homeostasis. Hydrogen peroxide (H2O2), one of the most studied ROS, is considered a key regulator in a number of physiological processes dependent of its concentration in the cell: at low concentrations acts as a signaling molecule involved in plant acclimation to stress, triggering tolerance to biotic and abiotic stresses; on the other hand, at high concentrations can promote cell death. Gradients of ROS and phytohormones can influence the responses of local growth and consecutively can affect the cellular redox state. Several phytohormones affect redox signaling processes controlling cell growth and defense. The intracellular levels of H2O2 are controlled by the action of several enzymes like peroxidases and catalases. Among the peroxidases, the GPX family of proteins can be found in virtually all kingdoms and is being increasingly studied in plants. In rice, this family consists of five genes, while in Arabidopsis eight genes were identified. This study aimed to characterize functionally rice and Arabidopsis GPX genes. Arabidopsis thaliana nockout mutants for AtGPX1, AtGPX2, AtGPX3, AtGPX4, AtGPX6, and AtGPX7 AtGPX8 genes were obtained. In Arabidopsis, at least AtGPX2, AtGPX3 and AtGPX6 are necessary to hormone-dependent control of root achitecture formation. RNAi knockdown in rice of OsGPX1, and OsGPX3 OsGPX4 generated plants with shorter root and shoot lengths, and deficient panicle formation. An 80% gene expression reduction of the chloroplastic isoform (OsGPX4) was lethal, and impaired the regeneration of plants from rice calli, whereas the reduction of expression in 40% and 95% of OsGPX1 (GPX1s) and OsGPX3 (GPX3s), respectively, did not prevent plant regeneration. However, GPX1s plants were smaller and had fewer panicles and seed compared to NT (non-transformed) plants. Additionally, GPX3s plants showed reduced length of the shoot as roots and accumulation of H2O2 about twenty times greater than the plant NT. GPX participation during vegetative and reproductive development of rice plants and the hormone-dependent root arquitecture formation in Arabidopsis was demonstrated in this work. The data set obtained contributed to the understanding of the role of these enzymes in the redox homeostasis, as well as how the interaction with phytohormones in development processes and plant defense occurs.

Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima derivada de leucócitos que catalisa a formação de numerosas espécies reativas oxidantes. Além de integrantes da resposta imune inata, evidências têm comprovado a contribuição destes oxidantes para o dano tecidual durante inflamação. A MPO participa de atividades biológicas pró-aterogênicas relacionadas à evolução da doença cardiovascular, incluindo iniciação, propagação e as fases de complicação aguda do processo aterosclerótico. Desta forma, a MPO e sua cascata inflamatória representam um alvo atrativo para investigação prognóstica e terapêutica na doença aterosclerótica cardiovascular. Vários estudos apontam para o efeito independente dos níveis de MPO na evolução da doença e ocorrência de eventos em pacientes com síndrome coronariana aguda. Entretanto, ainda não é consistente o valor preditivo adicional da dosagem de MPO na estratificação de risco cardiovascular para incorporá-la à prática clínica como sinalizadora de vulnerabilidade de placa. Estudos adicionais são necessários para avaliar os níveis de MPO como preditor de risco cardiovascular em curto e longo prazo, bem como o potencial benefício em utilizá-la para definir estratégias terapêuticas, além da padronização do ensaio, ponto fundamental para a transição desse marcador do ambiente de pesquisa para uso na rotina clínica.

Doctor of Philosophy / Department of Chemistry / Ping Li / Dye-decolorizing peroxidases (DyPs) comprise a new family of heme peroxidases, which have received much attention due to their potential applications in degradation of lignin and anthraquinone dyes. In this research, studies of two types of DyPs are carried out and reported in the following three sections. The first section includes the identification and characterization of class-A TcDyP from Thermomonospora curvata, a thermophilic actinomycete found in composted manure. The TcDyP was found to be highly active toward a wide range of substrates including phenolic lignin model compounds. Transient- and steady state- kinetics involving wild-type (wt) and mutant TcDyPs revealed that Asp220 and Arg327 are essential for compound I formation and reduction of compound II to resting state is the rate-limiting step. Additionally, replacement of His312 and Arg327 shifted the redox potential (E°′) to a more negative value. In the second section, the residues involved in the radical generation and substrate oxidation were explored. TcDyP contains 7 tryptophans and 3 tyrosines, which are the likely candidates of protein radicals and substrate oxidation sites. Crystal structure of TcDyP solved at 1.75Å revealed Trp263, Trp376 and Tyr332 as surface-exposed protein radical sites. Further studies using site-directed mutagenesis, steady-state and stopped-flow kinetics determined that the Trp263 is also one of the surface-exposed substrate oxidation sites. The Trp376 was characterized as the residue essential for covalent crosslinking of the enzyme units and an off-pathway electron sink. The highly conserved Tyr332 was found to be unimportant for substrate oxidation due to its extremely narrow surface exposure. The final section involves mechanistic study of a class-B DyP from Enterobacter lignolyticus (ElDyP), a bacterium capable of growing on lignin anaerobically. The crystal structure of ElDyP revealed the presence of two heme access channels measuring at ~3.0 and 8.0 Å in diameter and a water molecule as the sixth ligand to the heme center. Bisubstrate Ping-Pong mechanism was found operational in the catalytic cycle of ElDyP, in which conformational change of the enzyme resting state was proposed as the final step and the rate limiting step in the presence of ABTS. Microscopic events leading to Compound I formation was analyzed using D₂O₂. A kinetic isotope effect (KIE) of 2.4 at pD 3.5 suggested that Compound 0 is formed initially with protonation/deprotonation as the rate-limiting step. Compound I was directly reduced to the enzyme resting state via a 2-electron process, for which the rate increases as the pH decreases. Based on viscosity effect and solvent KIE (sKIE) with the reducing substrate, aquo release was found to be mechanistically important. Distal aspartate was proposed as the key residue that modulates the acidic pH optimum in Compound I reduction. These findings will pave the way for engineering DyPs for their applications in the degradation of lignin and synthetic dyes.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-21Bitstream added on 2014-06-13T20:59:10Z : No. of bitstreams: 1 inocencio_jem_me_araiq.pdf: 814478 bytes, checksum: 5da0e971367542f1455230a7886413ce (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os biossensores são dispositivos no qual o material de origem biológica é imobilizado junto a um transdutor, ou seja, um dispositivo que combina a especificidade de um elemento biológico ativo para o analíto de interesse com a sensibilidade de um transdutor para converter um sinal proporcional à concentração do analíto. Para a construção do biossensor é necessário fixar a biomolécula em um transdutor. Neste trabalho foi utilizado como transdutor um eletrodo de grafite recoberto por um filme polimérico de titânio a partir de uma suspensão. A modificação do eletrodo de trabalho (grafite de lapiseira 0,9 mm) foi efetuada empregando o método dip-coating em 5 diferentes marcas de grafites comerciais. Para os testes foram utilizados grafites na ausência e presença do filme de titânio e outros eletrodos com a enzima imobilizada por oclusão ou por adsorção. As voltametrias cíclicas foram efetuada em uma célula contendo 10 mL de solução tampão Br com o sistema H2O2/I- como eletrólito. Nos testes envolvendo somente os eletrodos com filme, observa-se a formação de um pico de oxidação no potencial de -0,8V (Pico 4). A resposta encontrada nas voltametrias deve-se a oxidação do H2 produzido pela redução. O biossensor foi construído através do método de adsorção, onde observado um pico referente à catálise enzimática em torno de -0,75 V (Pico 12). Portanto, neste presente trabalho, foi observado a construção de um biossensor com a modificação de sua superfície sem a necessidade de calcinação e com a observação da imobilização eficiente, observada através da catálise enzimática medida.

Orientador: Valdir Augusto Neves / Banca: Edwil Aparecida de Lucca Gattás / Banca: Eduardo Purgatto / Resumo: Os frutos e vegetais apresentam-se fisiologicamente ativos após a colheita, dessa forma as perdas pós-colheita ocorrem pela influência de diferentes fatores onde se destacam a respiração, a temperatura, a umidade, a concentração de oxigênio e gás carbônico, a produção de etileno e a ação de enzimas endógenas associadas com processos de deterioração. As raízes de yacon têm sido cada vez mais consumidas devido à revelação de qualidades medicinais. A manutenção de sua qualidade in natura é um sério problema nos processos pós-colheita devido a inúmeras reações metabólicas. A peroxidase (POD, E.C.1.11.1.7) é largamente encontrada nos vegetais apresentando importante papel fisiológico/bioquímico embora uma precisa função não tenha ainda sido estabelecida. Sua importância para ciência dos alimentos evidencia-se pelas relações com alterações indesejáveis na qualidade e resistência dos vegetais, tornando interessante sua supressão parcial ou total no pós-colheita. Os objetivos desse trabalho foram isolar, purificar e caracterizar a peroxidase de raízes de yacon. Condições de extração para a POD de yacon foram estabelecidas e a enzima foi isolada por precipitação com sulfato de amônio, eluição em Sephadex G-25 e DEAE-celulose. Somente um pico de atividade foi eluído no processo de purificação com um fator de purificação de 222,33. O peso molecular determinado foi 34.8 kDa com valores de pH e temperatura ótima de 5,5 e 35°C, respectivamente. As constantes Km e Vmax foram de 14,227 mM e 17409 UA/mL, para s-dianisidina, e de 14,434 mM e 14830 UA/mL, para H2O2. Foram testados os efeitos inibidores de sais, quelantes, compostos sulfidrila, ácidos fenólicos e outros. Estudos de inativação térmica da POD foram realizados, nos quais se verificou o efeito protetor da sacarose na inativação enzimática e o efeito promotor de inativação pela ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The fruits and vegetables still continue physiologically active after the crop, in that way the postharvest losses occurs by the influence of different factors, like the respiration, temperature, humidity, concentration of oxygen and carbonic gas, ethylene production and the action of endogenous enzymes associated with deterioration processes. Yacon (Smallanthus sonchifolius) roots has been more and more consumed by the revelation of prebiotic and medicinal properties. The maintenance of its quality in the postharvest is a serious problem due to several metabolic reactions. Peroxidase (POD, E.C.1.11.1.7) is widely found in plants, having physiological/biochemical importance, although a precise function has not still been established. The POD importance for food science is due to its relationships with alteration of the quality and resistance of the vegetables to the postharvest factors. Its total or partial suppression by thermal inactivation or inhibitor compounds may be interesting for postharvest interests. The objectives of this work were to isolate, purify and characterize the POD from yacon roots. Extraction conditions for yacon POD were determined and the enzyme was isolated by precipitation with ammonium sulfate, elution on Sephadex G-25 and DEAE-cellulose. Only one peak of enzyme activity was eluted on the purification process with a 222.33 fold purification factor. The determined molecular weight was 34.8 kDa. The optimum pH and temperature values were pH 5.5 and 35°C, respectively. Km and Vmax for ï-dianisidine was 14.227 mM and 17409 UA/mL, and 14.434 mM and 14830 UA/mL for H2O2, respectively. The effects of metals, chelating agents, sulphidryl, phenolic acids and other compounds as POD inhibitors were evaluated... (Complete abstract, click electronic address below). / Mestre

As espécies reativas de oxigênio (ERO) afetam significativamente a homeostase redox celular. No entanto, o peróxido de hidrogênio (H2O2), uma das ERO mais estudadas, é considerado regulador chave em uma série de processos fisiológicos, dependendo de sua concentração na célula: em baixas concentrações atua como molécula sinalizadora envolvida na aclimatação da planta a estresses, desencadeando tolerância a estresses bióticos e abióticos; por outro lado, em altas concentrações o H2O2 pode levar à morte celular. Gradientes de ERO e fitohormônios têm influência nas respostas de crescimento local e consecutivamente afetam o estado redox celular. Diversos fitohormônios afetam a sinalização redox celular controlando processos de crescimento e defesa. Os níveis de H2O2 intracelulares são controlados pela ação de diversas enzimas da classe das peroxidases e catalases. Dentre as peroxidases, a família de proteínas GPX pode ser encontrada em praticamente todos os reinos e vem sendo cada vez mais estudada em plantas. Em arroz, essa família é composta de cinco genes, enquanto em Arabidopsis foram identificados oito genes. Este trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente as GPX mitocondriais e cloroplastídica de arroz e sete dos oito genes de Arabidopsis thaliana. Mutantes knockout de Arabidopsis para os genes AtGPX1, AtGPX2, AtGPX3, AtGPX4, AtGPX6, AtGPX7 e AtGPX8 foram obtidos.Nesta espécie, pelo menos AtGPX2, AtGPX3 e AtGPX6 são necessárias para a correta formação da arquitetura da raiz dependente dos hormônios ABA, auxina e SL. O sileciamento por RNAi em arroz para os genes OsGPX1, OsGPX3 e OsGPX4 gerou plantas com crescimento deficiente de raiz, parte área e formação de panículas. A redução em 80% da expressão gênica da isoforma cloroplastídica (OsGPX4) foi letal para o desenvolvimento de plântulas regeneradas a partir de calos de arroz, enquanto que a redução da expressão de 40% e 95% de OsGPX1 (GPX1s) e OsGPX3 (GPX3s), respectivamente, não impediu a regeneração de plantas. No entanto, plantas GPX1s apresentaram menor tamanho, menor número de panículas e menor produção de sementes em comparação com as plantas NT (não transformadas). Adicionalmente, plantas GPX3s apresentaram redução do comprimento tanto da parte aérea quanto das raízes, além de acúmulo de H2O2 cerca de vinte vezes maior do que a planta NT. Neste trabalho, foi demonstrada a participação das enzimas GPX durante o desenvolvimento vegetativo e reprodutivo de plantas de arroz e o estabelecimento da arquitetura da raiz dependente de hormônios em Arabidopsis. O conjunto de dados obtidos contribuempara o entendimento do papel dessas enzimas na homeostase redox, como também na interação com fitohormônios nos processos de desenvolvimento e defesa vegetais. / Reactive oxygen species (ROS) affect significantly cellular redox homeostasis. Hydrogen peroxide (H2O2), one of the most studied ROS, is considered a key regulator in a number of physiological processes dependent of its concentration in the cell: at low concentrations acts as a signaling molecule involved in plant acclimation to stress, triggering tolerance to biotic and abiotic stresses; on the other hand, at high concentrations can promote cell death. Gradients of ROS and phytohormones can influence the responses of local growth and consecutively can affect the cellular redox state. Several phytohormones affect redox signaling processes controlling cell growth and defense. The intracellular levels of H2O2 are controlled by the action of several enzymes like peroxidases and catalases. Among the peroxidases, the GPX family of proteins can be found in virtually all kingdoms and is being increasingly studied in plants. In rice, this family consists of five genes, while in Arabidopsis eight genes were identified. This study aimed to characterize functionally rice and Arabidopsis GPX genes. Arabidopsis thaliana nockout mutants for AtGPX1, AtGPX2, AtGPX3, AtGPX4, AtGPX6, and AtGPX7 AtGPX8 genes were obtained. In Arabidopsis, at least AtGPX2, AtGPX3 and AtGPX6 are necessary to hormone-dependent control of root achitecture formation. RNAi knockdown in rice of OsGPX1, and OsGPX3 OsGPX4 generated plants with shorter root and shoot lengths, and deficient panicle formation. An 80% gene expression reduction of the chloroplastic isoform (OsGPX4) was lethal, and impaired the regeneration of plants from rice calli, whereas the reduction of expression in 40% and 95% of OsGPX1 (GPX1s) and OsGPX3 (GPX3s), respectively, did not prevent plant regeneration. However, GPX1s plants were smaller and had fewer panicles and seed compared to NT (non-transformed) plants. Additionally, GPX3s plants showed reduced length of the shoot as roots and accumulation of H2O2 about twenty times greater than the plant NT. GPX participation during vegetative and reproductive development of rice plants and the hormone-dependent root arquitecture formation in Arabidopsis was demonstrated in this work. The data set obtained contributed to the understanding of the role of these enzymes in the redox homeostasis, as well as how the interaction with phytohormones in development processes and plant defense occurs.

Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima derivada de leucócitos que catalisa a formação de numerosas espécies reativas oxidantes. Além de integrantes da resposta imune inata, evidências têm comprovado a contribuição destes oxidantes para o dano tecidual durante inflamação. A MPO participa de atividades biológicas pró-aterogênicas relacionadas à evolução da doença cardiovascular, incluindo iniciação, propagação e as fases de complicação aguda do processo aterosclerótico. Desta forma, a MPO e sua cascata inflamatória representam um alvo atrativo para investigação prognóstica e terapêutica na doença aterosclerótica cardiovascular. Vários estudos apontam para o efeito independente dos níveis de MPO na evolução da doença e ocorrência de eventos em pacientes com síndrome coronariana aguda. Entretanto, ainda não é consistente o valor preditivo adicional da dosagem de MPO na estratificação de risco cardiovascular para incorporá-la à prática clínica como sinalizadora de vulnerabilidade de placa. Estudos adicionais são necessários para avaliar os níveis de MPO como preditor de risco cardiovascular em curto e longo prazo, bem como o potencial benefício em utilizá-la para definir estratégias terapêuticas, além da padronização do ensaio, ponto fundamental para a transição desse marcador do ambiente de pesquisa para uso na rotina clínica.