Les polyazacycloalcanes sont largement utilisés pour l’élaboration de radiopharmaceutiques destinés à la médecine nucléaire. Ces structures, et plus particulièrement celles dérivées du cyclam, permettent une complexation idéale du cuivre et ainsi une application en imagerie TEP, avec l’utilisation du 64Cu, ou en radiothérapie grâce à l’isotope 67Cu. Le cyclam doit, en plus d’être N-fonctionnalisé par des bras coordinants, disposer d’une fonction supplémentaire permettant la bioconjugaison à une biomolécule pour un ciblage spécifique des cellules cancéreuses. Une première partie de cette thèse a porté sur la synthèse du cyclam monopicolinate C-fonctionnalisé par une fonction de bioconjugaison de type benzyle isothiocyanate. Cette synthèse, basée sur des travaux antérieurs du laboratoire, a nécessité la mise au point d’une méthode d’alkylation régiospécifique du cyclam C-fonctionnalisé par le biais de protections sélectives des atomes d’azote du macrocycle. Le ligand a ensuite été étudié in vitro et in vivo, par nos collaborateurs nantais du CRCINA, pour l’imagerie immuno-TEP du myélome multiple.La seconde partie de ce travail s’est consacrée à l’élaboration d’un dérivé polyfonctionnel du cyclam possédant deux fonctions permettant le ciblage des cellules tumorales. Ce composé a été synthétisé au sein du laboratoire brestois puis étudié, in vitro et in vivo, dans les locaux de la NECSA en Afrique duSud pour l’imagerie TEP du cancer du sein.Ces deux projets ont permis d’obtenir une preuve de concept en imagerie TEP ce qui confirme le potentieldes ligands dérivés de cyclam C-fonctionnalisés pour l’élaboration de radiopharmaceutiques à base de cuivre pour la médecine nucléaire. / Polyazacycloalkanes are wildly used in the conception of radiopharmaceuticals for nuclear medicine. These structures, and especially cyclam derivatives, provide ideal complexation properties of copper, which can be applied in nuclear medicine applications with the 64Cu isotope for PET imaging or with 67Cu for radiotherapy purpose. Cyclams derivatives have to be N-functionalized with coordinative arms, and moreover include an additional function especially introduced for the bioconjugation of a biomolecule in the aim to preferentially target cancer cells.The first project treated in this manuscript consisted of the synthesis of a monopicolinate cyclam C-functionalized with a benzyl isothiocyanate function for the bioconjugation. Based on precedent results obtained in the Lab, a regiospecific alkylation method has been developed for the synthesis of this ligand.This method implies the selective protection and deprotection of the macrocycle nitrogen atoms. This ligand, once obtained, has been studied in vitro and in vivo, by our collaborators of the CRCINA in Nantes, for multiple myeloma immuno-PET imaging.The second project of this work is dedicated to the conception of a radiopharmaceutical based on apolyfunctionnal cyclam which bear two different moieties allowing the targeting of cancer cells. This ligand has been synthesized in our Lab in Brest and studied, in vitro and in vivo, in the South African NECSA company for breast cancer PET imaging.These two projects were elaborated in the aim to obtain a proof of principle in PET imaging and to confirm the high potential of C-funcitonnalized cyclam derivatives for nuclear medicine applications.

Coordination of transition metals to peptides, either through the incorporation of unnatural chelating groups or amino acid ligating side-chains, expands the utility of peptides for biological studies. The first part of this project describes induction of α-helical secondary structure in pentapeptides upon side-chain coordination of inert transition metal ions. The second part of this project describes the syntheses of biologically active peptide species that contain a macrobicyclic hexaamine ligand that can complex radioactive metal ions for diagnostic imaging purposes. / Short peptide sequences do not form thermodynamically stable α-helices in water. The capacity of two metal clips, cis-[Ru(NH3)4(solvent)2]2+ and cis [Pd(en)(solvent)2]2+ to induce α-helicity in peptides that are five amino acids long, Ac HARAH NH2 and Ac MARAM-NH2 has been explored. In all cases at pH < 5, the metal ions bind to the side-chains of amino acid residues at positions i, i+4 of the pentapeptides resulting in formation of bidentate macrocyclic species. Circular dichroism and 1H nuclear magnetic resonance data indicate that the metal complexes of Ac-MARAM-NH2 are highly α helical in water, and in the most spectacular case, coordination of Ac-MARAM-NH2 to cis-[Ru(NH3)4(solvent)2]2+ results in up to 80% α-helicity. In contrast, metal complexes of Ac-HARAH-NH2 exhibit significantly less α-helicity in water. / 64Cu-radiolabelled peptides have been investigated for their ability to target specific tissue or cell types. These peptides require a chelating group that binds copper ions strongly. Macrobicyclic hexaamine ligands, based on the compound commonly referred to as “sarcophagine”, have demonstrated extremely high stability under biological conditions. Here we describe the synthesis of diaminosarcophagine chelators with carboxylate groups for conjugation to peptides. These new chelators have been attached to the N-terminus or lysine side-chain of biologically-active peptides, including Tyr3 octreotate, Lys3-bombesin and an integrin targeting peptide. Spectroscopic and voltammetric studies of these species suggest that the conjugated sarcophagine group retains the high metal binding affinity and structural properties of the parent species, diaminosarcophagine. These are among the first sarcophagine-peptide compounds that have been properly characterised. The new sarcophagine-peptide conjugates can be easily radiolabelled with 64Cu2+ over a wide pH range at ambient temperature.

Ces travaux de thèse s'inscrivent dans le contexte de la prédiction de la récidive en radiothérapie du cancer de l'utérus. L'objectif était d'analyser les images de tomographie par émission de positons (TEP) au 18F-fluorodésoxyglucose (18F-FDG) en vue d'en extraire des paramètres quantitatifs statistiquement corrélés aux événements de récidive. Six études ont été réalisées afin de répondre aux différentes problématiques soulevées par l'analyse des images 18F-FDG TEP telles que la présence d'artefact, l'isolation du métabolisme tumoral ou l'évaluation du signal en cours de traitement. Les études statistiques ont porté sur l'analyse de paramètres reflétant l'intensité, la forme et la texture du métabolisme tumoral avant, et en cours de traitement. À l'issue de ces travaux, le volume métabolique tumoral pré-thérapeutique ainsi que la glycolyse totale de la lésion per-thérapeutique apparaissent comme les paramètres les plus prometteurs pour la prédiction de récidive de cancers du col de l'utérus. De plus, il apparaît que la combinaison de ces paramètres avec d'autres caractéristiques de texture ou de forme, à l'aide de modèles statistiques d'apprentissage supervisé ou de modèles de régression plus classiques, ont permis d'augmenter la prédiction des événements de récidive. / This thesis deals with the issue of predicting the recurrence within the context of cervical cancer radiotherapy. The objective was to analyze positron emission tomography (PET) with 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) to extract quantitative parameters that could show statistical correlation with tumor recurrence. Six study were performed to address 18F-FDG PET imaging issues such as the presence of bladder uptake artifacts, tumor segmentation impact, as well as the analysis of tumor evolution along the treatment. Statistical analyses were performed among parameters reflecting intensity, shape and texture of the tumor metabolism before, and during treatment. Results show that the pre-treatment metabolic tumor volume and the per-treatment total lesion glycolysis are the most promising parameters for cervical cancer recurrence prediction. In addition, combinations of these parameters with shape descriptors and texture features, using machine-learning methods or regression models, are able to increase the prediction capability.

Résumé : L’imagerie TEP est une modalité puissante qui permet de suivre d’infimes concentrations de traceurs marqués pour la détection de cancers et d’autres pathologies. Il y a actuellement un intérêt croissant pour le développement de peptides comme outils diagnostiques et de traitement en oncologie. Cet intérêt se justifie entre autres par le fait que les peptides sont tolérants à la présence de chélateurs bifonctionnels ou de groupements prosthétiques pour le marquage avec divers radiométaux (64Cu, T1/2 = 12,7 h, 68Ga, T1/2 = 68 min, etc.) ou le 18F (T1/2 = 109,8 min) sans perte de leur activité biologique. L’objectif des travaux rapportés dans ce document était de développer des outils moléculaires innovateurs et efficaces qui facilitent le marquage de peptides pour l’imagerie TEP. Il s’agit spécifiquement d’un chélateur bifonctionnel et d’une méthode de conjugaison rapide et sélective de groupe prosthétique. Sur un volet, un chélateur bifonctionnel analogue de la lysine avec des ligands méthylhydroxamates a été synthétisé en solution par double bisalkylation. Les résultats préliminaires indiquent une faible chélation avec le Cu(II), mais sont à poursuivre avec les 68Ga et 89Zr. Pour le second volet de radiomarquage au 18F, les procédures synthétiques ont été optimisées en deux étapes, soient le marquage du groupe prothétique et sa conjugaison au peptide. Tout d’abord, des conditions de marquage par une réaction de SNAr en présence de 18F- ont été développées pour donner le groupe prosthétique 18F-thioester nécessaire à la conjugaison. Par la suite, sa conjugaison au peptide par la réaction de ligation chémosélective, ce qui implique trois étapes 1) une transthioestérification favorisée entre les groupements thioester et thiol des segments de peptides; 2) un réarrangement irréversible de l’intermédiaire thioester en N-(oxyalkyl)amide, suivi; 3) du clivage de l’auxiliaire. Par les présents travaux, il a été prouvé que la nouvelle méthodologie en un seul pot réactionnel accélère la réaction et permet le marquage au 18F de peptides non protégés, limitant ainsi les réactions secondaires et le nombre d’étapes après le marquage des peptides. La conjugaison du groupe prothétique à un composé et un peptide modèle se produit en 26-55 min comparativement aux 48 h des conditions originales rapportées. La méthode proposée permet également le marquage de peptides non protégés. Dans le futur, le chélateur bifonctionnel et le groupe prothétique seront conjugués à différents dérivés peptidiques ciblant des récepteurs impliqués dans le cancer et des tests de compétition, de saturation, de biodistribution et d’imagerie µTEP seront effectués. / Abstract : PET is a powerful imaging modality that follows tiny labeled tracer concentrations for the detection of cancer and other pathologies. There currently is a growing interest for the development of peptides as diagnostic and treatment tools in oncology. This interest is justified by the fact that peptides are tolerant to the presence of bifunctionnal chelators or prosthetic groups for labeling with many radiometals (64Cu, T1/2 = 12,7 h, 68Ga, T1/2 = 68 min, etc.) or 18F (T1/2 = 109,8 min), without losing their biological activity. The objective of the work reported in this document was to develop innovative and efficient molecular tools that facilitate peptide labeling for PET imaging. Specifically, they are a bifunctionnal chelator and a fast and selective prosthetic group conjugation method. On the first aspect, a lysine analogue bifunctionnal chelator bearing methylhydroxamate ligands was synthesized in solution through a double bisalkylation. The preliminary results show a weak Cu(II) chelation, but they are to be pushed forward with 68Ga and 89Zr. On the second aspect of 18F radiolabeling, synthetic procedures were optimised for two steps, which are the prosthetic group’s labeling and its conjugation to the peptide. First, the labeling conditions for a SNAr reaction with 18F- were developed, to yield the necessary 18F-thioester prosthetic group. Then, its conjugation to the peptide by the chemical ligation reaction through its three steps 1) a favored transthioesterification between the thioester and thiol peptide segments; 2) an irreversible rearrangement of the thioester intermediate to a N-(oxyalkyl)amide, followed; 3) the auxiliary cleavage. By this work, it has been proven that the new one pot methodology accelerates the reaction and allows the 18F labeling of unprotected peptides, which limits secondary reactions and the number of post peptide labeling steps. The prosthetic group conjugation to both model compound and peptide takes place in 26-55 min, compared to the 48 h initially reported. The proposed method also allows the labeling of unprotected peptides. In the future, the bifunctionnal chelator and the prosthetic group will be conjugated to different peptide derivatives that target cancer implied receptors and competition, saturation, biodistribution and µPET imaging assays will be performed.

Au cours des 20 dernières années, de nombreux modèles animaux ont émergé, permettant le développement de nouvelles approches pour l'étude préclinique du cerveau sain et pathologique. Les rongeurs sont ainsi devenus des acteurs incontournables des avancées thérapeutiques. Dans ce contexte, l'imagerie radioisotopique, qui permet de quantifier des traceurs radioactifs avec une sensibilité excellente, constitue un outil de choix l'étude des processus cérébraux in vivo. Mais, jusqu'à présent, les techniques de radioimagerie les plus courantes imposent l'anesthésie ou l'immobilisation de l'animal. Or, les anesthésiants affectent les processus biologiques étudiés. De plus, il existe un vif intérêt pour l'étude simultanée du comportement de l'animal. L'acquisition d'une image dynamique des processus cérébraux concomitante à la mesure du comportement de l'animal éveillé et libre de ses mouvements est une information précieuse pour l'étude de l'addiction, de la mémoire, etc.À IMNC, nous avons abordé la neuroimagerie comportementale par une approche originale basée sur des sondes intracérébrales qui mesurent la concentration du traceur radioactif par détection directe des positons in situ. La sonde PIXSIC, basée sur un capteur pixelisé à diodes de silicium, a démontré leur pertinence dans le cadre d'études pharmacologiques chez l'animal totalement libre de ses mouvements. Toutefois, PIXSIC a montré quelques limitations pour son utilisation longitudinale : un niveau de bruit élevé dû aux perturbations électromagnétiques, une forte sensibilité au rayonnement gamma d'annihilation et une grande fragilité mécanique de l'implant aminci à 200 micromètres. En nous appuyant sur l'avènement des technologies CMOS pour la détection des particules chargées en physique des hautes énergies, nous avons pour ambition de concevoir MAPSSIC, une sonde qui réponde aux difficultés mises en avant par PIXSIC. Les capteurs CMOS permettent d'inclure l'amplification au niveau des pixels, limitant ainsi le bruit d'origine électromagnétique. Le volume sensible peut être réduit à une épaisseur de quelques dizaines de micromètres, réduisant ainsi fortement la sensibilité aux gammas et autorisant l'augmentation de son épaisseur totale pour assurer sa robustesse mécanique. Enfin, les capteurs CMOS nous permettent de concevoir un détecteur fortement pixelisé pour accéder à de nouvelles capacités d'imagerie. Cette thèse a eu pour objectif de développer une version optimisé de la sonde. Pour cela, nous avons imaginé un premier prototype de capteur CMOS et nous avons développé un modèle Monte Carlo pour estimer ses propriétés de détection. Nous avons pu démontrer que ses performances le qualifiait pour l'usage prévu. Notamment en terme de sensibilité, de volume d’isoefficacité et d’énergie déposée. Nous avons également pu explorer plusieurs paramètres d’optimisation, les dimensions des pixels et l’épaisseur de la zone sensible, qui nous permettent de considérer MAPSSIC au delà du premier prototype. Fort de ces bases théoriques nous avons conçu plusieurs exemplaires du capteur. Les développements qui ont été établis durant la thèse se sont ensuite focalisés sur un ensemble d'outils méthodologiques, logiciels et matériels afin de permettre la caractérisation physique du capteur à l'aide de sources radioactives. Nous avons pu établir l'uniformité de la réponse des pixels et la plage de taux d’évènements assurant la linéarité du taux de comptage. Ces éléments nous ont permis de conclure sur la pertinence de ce capteur pour la conception d'un dispositif autonome d'imagerie. Celui-ci est constitué d'un implant fait de deux capteurs dos-à-dos, d'un système électronique assurant le contrôle des capteurs, la lecture du signal et la communication sans fil et d'une station d'acquisition. Dans le cadre de la thèse, nous avons montré son adéquation pour l'évaluation des variations de l'activité d'une source radioactive bêta+ liquide dans laquelle l'implant a été plongé. / Over the last 20 years, many animal models have emerged, allowing the development of new approaches for the preclinical study of the healthy and pathological brain. Rodents have become key players in therapeutic advances. In this context, radioisotope imaging, which quantifies radioactive tracers with excellent sensitivity, is a prime tool for the study of brain processes in vivo. But so far, the most common radioimaging techniques require anesthesia or immobilization of the animal. However, anesthetics affect the biological processes studied. In addition, there is a keen interest in the simultaneous study of the behavior of the animal. The acquisition of a dynamic image of brain processes concomitant with the behavior of the awake and freely moving animal is valuable information for the study of addiction, memory, etc.At IMNC lab, we have approached behavioral neuroimaging with an original method based on intracerebral probes that measure the concentration of the radioactive tracer by direct detection of positrons in situ. The PIXSIC probe, based on a pixelized sensor with silicon diodes, demonstrated their relevance in the context of pharmacological studies with completely freely moving animals. However, PIXSIC has shown some limitations for its longitudinal use: a high level of noise due to electromagnetic perturbations, a high sensitivity to annihilation gamma radiation and a high mechanical fragility of the implant thinned to 200 microns.Based on the advent of CMOS technologies for the detection of charged particles in high energy physics, our ambition is to design MAPSSIC, a probe that responds to the difficulties highlighted by PIXSIC. CMOS sensors allows amplification at the pixel level, thus limiting electromagnetic noise. The sensitive volume can be reduced to a thickness of a few tens of microns, thus greatly reducing the sensitivity to gammas and allowing the increase of its total thickness to ensure its mechanical robustness. Finally, CMOS sensors allows us to design a highly pixelated detector to reach new imaging capabilities. This thesis aims to develop an optimized version of the probe. We imagined a first prototype CMOS sensor and we developed a Monte Carlo model to estimate its detection properties. We were able to show that his performances qualified it for the intended use, in terms of sensitivity, isoefficiency volume and deposited energy. We have also been able to explore several optimization parameters, the pixel dimensions and the thickness of the sensitive area, which allow us to consider MAPSSIC beyond the first prototype. With these theoretical bases we have produced several copies of the sensor. The developments that were established during the thesis then focused on a set of methodological tools, software and hardware to allow the physical characterization of the sensor using radioactive sources. We have been able to establish the uniformity of the pixel response and the event rate range ensuring the linearity of the count rate.These elements allowed us to conclude on the relevance of this sensor for the design of an autonomous imaging device. This consists of an implant made of two back-to-back sensors, an electronic system providing sensor control, signal reading and wireless communication and an acquisition station. In the context of the thesis, we have shown its suitability for the evaluation of the variations of the activity of a liquid beta+ radioactive source in which the implant has been immersed.

Losartan is a selective antagonist of the angiotensin II type 1 receptor (AT1R). Several reports have highlighted the AT1R expression in several cancers enhancing tumor development and cancer progression. The aim of this thesis is the synthesis and evaluation of [18F]fluoroethyl-losartan ([18F]FEtLos) and [18F]ammoniomethyltrifluoroborate-losartan ([18F]AMBF3Los) as two novel losartan analogs to image AT1R-positive tumors using the positron emission tomography (PET). Initially, the cold compounds FEtLos and AMBF3Los were synthetized by alkylation and click chemistry reactions respectively, and characterized by spectroscopic techniques. Then, radiosynthesis of 2-[18F]fluoroethyl-tosylate was optimized from a radiation safety point of view. Next, [18F]FEtLos was manually synthetized by [18F]fluoroethylation of losartan with low molar activity and greater than 99% radiochemical purity. [18F]AMBF3Los was easily synthetized with greater than 97% radiochemical purity by one step 18F-19F isotopic exchange approach using low and high activities of [18F]fluoride that afforded molar activities ranging from 2 to 139 GBq/&mu;mol. In vitro competition binding assays showed that FEtLos and AMBF3Los have low and high binding affinity to human AT1R, respectively. AT1R expression was confirmed in breast, ovarian and gastric derived-tumors implanted on Nude mice. In spite of the low affinity, [18F]FEtLos was specific for renal AT1R. However, [18F]FEtLos did not showed specificity for tumor AT1R binding. &mu;PET imaging, autoradiography and ex vivo biodistribution studies showed the specificity of [18F]AMBF3Los for both kidney and tumor AT1R binding. However, [18F]AMBF3Los was not able to reach the tumor site once injected intravenously probably because of its rapid metabolism and very fast clearance. Nonetheless our results demonstrate that 18F-Angiotensin II Receptor Blockers (ARBs) derivatives could be suitable tracers to cancer imaging AT1R-expressing tumor microenvironment, however, radiolabeled ARBs that possess better pharmacokinetics profile may be required. / O losartan é um antagonista seletivo do receptor tipo 1 de angiotensina II (AT1R). Vários reportes têm destacado a expressão do AT1R em vários cânceres favorecendo o desenvolvimento tumoral e progressão do câncer. O objetivo desta tese é a síntese e avaliação do [18F]fluoroetil-losartan ([18F]FEtLos) e [18F]amoniometiltrifluoroborato-losartan ([18F]AMBF3Los) como dois novos análogos do losartan para imagem de tumores AT1R-positivos usando a tomografia por emissão de pósitrons (PET). Inicialmente, os compostos padrões FEtLos e AMBF3Los foram sintetizados por reações de alquilação e química click respetivamente, e caraterizados por técnicas espectroscópicas. A seguir, a radiosíntese do 2-[18F]fluoroetil-tosilato foi otimizada do ponto de vista de seguridade radiológica. O [18F]FEtLos foi depois sintetizado por alquilação do losartan utilizando o grupo prostético 2-[18F]fluoroetil-tosilato, com baixa atividade molar, e pureza radioquímica maior do 99%. [18F]AMBF3Los foi facilmente sintetizado com pureza radioquímica maior do 97% por troca isotópica 18F-19F usando baixas e altas atividades de [18F]fluoreto o que providenciou atividades molares entre 2 e 139 GBq/&mu;mol. Ensaios de ligação por competição in vitro mostraram que FEtLos e AMBF3Los têm baixa e alta afinidade de ligação ao AT1R humano respetivamente. A expressão do AT1R foi confirmada em tumores de mama, ovário e gástrico, implantados em camundongos Nude. A pesar da baixa afinidade, o [18F]FEtLos foi específico pelo AT1R renal. Não entanto, [18F]FEtLos não mostrou especificidade pela ligação ao AT1R no tumor. A imagem &mu;PET, autoradiografia, e os estudos de biodistribuição ex vivo mostraram a especificidade do [18F]AMBF3Los pela ligação ao AT1R nos rins e no tumor. O radiotraçador [18F]AMBF3Los não foi capaz de ligar no tumor quando injetado intravenosamente, provavelmente devido ao seu rápido metabolismo e rápida depuração sanguínea. Apesar disso, nossos dados demonstram que os derivados de Bloqueadores do Receptor de Angiotensina II (ARBs) radiomarcados com 18F podem ser potenciais radiofármacos para o imageamento do microambiente tumoral positivo para AT1R, no entanto o perfil farmacocinético dos ARBs radiomarcados ainda precisa ser melhorado.

L’objectif de la thèse: À ce jour, il est admis que la TSPO joue un rôle important dans le processus inflammatoire, et qu’il est possible de suivre sa présence à l’aide d’une variété de radiotraceurs adaptés. Les impacts de l’inflammation touchent un grand nombre de personnes à travers le monde pour diverses raisons ; c’est pourquoi, quoique le [ ¹ ⁸F]DPA-714 est très prometteur, il est nécessaire d’aller plus loin pour explorer ses capacités et ses applications possibles. L’inflammation a une forte incidence sur différentes maladies, par conséquent, à impact social élevé (comme la maladie inflammatoire de l’intestin (IBD), la neuroinflammation, et le choc septique). Dans ces modèles nous analyserons et quantifierons les niveaux de d’expression de TSPO 18kDa par imagerie TEP que nous comparerons au niveau exprimé trouvés chez des sujets contrôles. L’objectif étant de déterminer si la TSPO peut constituer une cible biologique d’intérêt pour l’évaluation et la quantification d’un état inflammatoire chez l’individu en utilisant l’imagerie TEP avec le radioligand [ ¹ ⁸F]DPA-714.Aperçu sur le travail de recherche : L’étude entreprise dans cette thèse a fourni des informations conduisant à la conclusion suivante : la TSPO 18kDa peut en effet être utile comme biomarqueur pour l’évaluation d’un état inflammatoire dans plusieurs maladies. Nous avons pu illustrer par l’intermédiaire de deux modèles de la maladie inflammatoire de l’intestin, un modèle de la neuroinflammation et un modèle de choc septique, que la TSPO est un indicateur du niveau de l’inflammation dans la zone affectée. De plus, nous avons pu suivre, mesurer et quantifier l’évolution d’une zone inflammée en fonction du temps.Bien que le [ ¹ ⁸F]DPA-714 est le traceur utilisé pour déterminer la présence et le niveau de l’inflammation, d’autres traceurs sont constamment en cours de développement. Cela est démontré par le travail de collaboration effectuée avec l’équipe de radiochimie, dans lequel nous avons illustré le potentiel d’un nouveau radioligand de TSPO, le [ ¹ ⁸F]DPA-C5yne. / Purpose : The purpose of this study was to determine the in vivo potential of the TSPO 18 kDa as a biomarker of inflammation, with the use of its radioligand [ ¹ ⁸F]DPA-714, to non-invasively quantify the inflammatory state within the scope of various pathologies. Procedure : Multiple animal models of various inflammatory diseases, to include : inflammatory bowel disease, neuroinflammation, and septic shock, were developed and put in place by adapted measures. The animals well-being and the subsequent inflammation was evaluated. The inflammatory state was measured using quantitative PET imaging with the TSPO radioligand [ ¹ ⁸F]DPA-714 and correlated to the expression of conventional inflammatory markers using microscopy. Results : Based on the observed data, we were able to distinguish control groups from treated groups when using [ ¹ ⁸F]DPA-714. This TSPO radioligand permitted us to quantify the inflammatory level and to observe evolutionary changes in the inflammatory state of the disease in multiple models. The PET results, using the [ ¹ ⁸F]DPA-714 signal was correlated with an increased TSPO expression at cellular level. Conclusion : Results indicate that [ ¹ ⁸F]DPA-714 is a suitable tracer for studying inflammation of multiple diseases.[ ¹ ⁸F]DPA-714 could be a good molecular probe to non-invasively evaluate the level and localization of inflammation. Moreover, in vivo imaging using this TSPO ligand is potentially a powerful tool to stage and certainly to follow the evolution and therapeutic efficiency at molecular level in inflammatory diseases.

Cette thèse traite du problème de séparation aveugle de sources non-négatives (c'est à dire des grandeurs positives ou nulles). La situation de séparation de mélanges linéaires instantanés de sources non-négatives se rencontre dans de nombreux problèmes de traitement de signal et d'images, comme la décomposition de signaux mesurés par un spectromètre (spectres de masse, spectres Raman, spectres infrarouges), la décomposition d'images (médicales, multi-spectrale ou hyperspectrales) ou encore l'estimation de l'activité d'un radionucléide. Dans ces problèmes, les grandeurs sont intrinsèquement non-négatives et cette propriété doit être préservée lors de leur estimation, car c'est elle qui donne un sens physique aux composantes estimées. La plupart des méthodes existantes de séparation de sources non-négatives requièrent de ``fortes" hypothèses sur les sources (comme l'indépendance mutuelle, la dominance locale ou encore l'additivité totale des sources), qui ne sont pas toujours vérifiées en pratique. Dans ce travail, nous proposons une nouvelle méthode de séparation de sources non-négatives fondée sur la répartition géométrique du nuage des observations. Les coefficients de mélange et les sources sont estimées en cherchant le cône simplicial d'ouverture minimale contenant le nuage des observations. Cette méthode ne nécessite pas l'indépendance mutuelle des sources, ni même leur décorrélation; elle ne requiert pas non plus la dominance locale des sources, ni leur additivité totale. Une seule condition est nécessaire et suffisante: l'orthant positif doit être l'unique cône simplicial d'ouverture minimale contenant le nuage de points des signaux sources. L'algorithme proposé est évalué avec succès dans deux situations de séparation de sources non-négatives de nature très différentes. Dans la première situation, nous effectuons la séparation de spectres de masse mesurés à la sortie d'un chromatographe liquide haute précision, afin d'identifier et quantifier les différents métabolites (petites molécules) présents dans l'urine d'un rat traité au phénobarbital. Dans la deuxième situation, nous estimons les différents compartiments pharmacocinétiques du radio-traceur FluoroDeoxyGlucose marqué au fluor 18 ([18F]-FDG) dans le cerveau d'un patient humain, à partir d'une série d'images 3D TEP de cet organe. Parmi ces pharmacocinétiques, la fonction d'entrée artérielle présente un grand intérêt pour l'évaluation de l'efficacité d'un traitement anti-cancéreux en oncologie. / This thesis addresses the problem of non-negative blind source separation (i.e. positive or zero quantities). The situation of linear instantaneous mixtures of non-negative sources occurs in many problems of signal and image processing, such as decompositions of signals measured by a spectrometer (mass spectra, Raman spectra, infrared spectra), decomposition of images (medical, multi-spectral and hyperspectral) or estimating of the activity of a radionuclide. In these problems, the sources are inherently non-negative and this property should be preserved during their estimation, in order to get physical meaning components. Most of existing non-negative blind source separation methods require ``strong" assumptions on sources (such as mutual independence, local dominance or total additivity), which are not always satisfied in practice. In this work, we propose a new geometrical method for separating non-negative sources. The mixing matrix and the sources are estimated by finding the minimum aperture simplicial cone containing the scatter plot of mixed data. The proposed method does not require the mutual independence of the sources, neither their decorrelation, nor their local dominance, or their total additivity. One condition is necessary and sufficient: the positive orthant must be the unique minimum aperture simplicial cone cone containing the scatter plot of the sources. The proposed algorithm is successfully evaluated in two different problems of non-negative sources separation. In the first situation, we perform the separation of mass spectra measured at the output of a liquid chromatograph to identify and quantify the different metabolites (small molecules) present in the urine of rats treated with phenobarbital . In the second situation, we estimate the different pharmacokinetics compartments of the radiotracer [18F]-FDG in human brain, from a set of 3D PET images of this organ, without blood sampling. Among these pharmacokinetics, arterial input function is of great interest to evaluate the effectiveness of anti-cancer treatment in oncology.

Zur Behandlung von Tumorerkrankungen sind radioaktiv markierte Antikörper als hochaffine und selektive Radioimmuntherapeutika von zunehmender Bedeutung. Allerdings ist der Einsatz solcher radioaktiv markierter Antikörper bei der Behandlung strahlenresistenter solider Tumore limitiert, weil infolge ihrer hohen Blutverweildauer und nur langsamen Anreicherung im Zielgewebe, bedingt durch ihre Molekülgröße, der gesamte Organismus einer hohen Strahlenbelastung ausgesetzt wird. Eine Alternative dazu stellt die Strategie des Pretargeting von Tumoren dar. Die Intention dieses Prinzips besteht darin, mittels einer mehrstufigen Applikationsfolge die Injektion eines targetspezifischen Antikörper-Konjugates und einer kleinen radioaktiv markierten Verbindung zu trennen, welche zueinander ein komplementäres System bilden. Eine Substanzklasse die erstmals von Wissenschaftlern des Helmholtz-Zentrums Dresden-Rossendorf (HZDR) als potentielles komplementäres System für Tumor-Pretargeting-Anwendungen untersucht wurden ist, sind spiegelbildliche bzw. L konfigurierte Oligonukleotide. Aufgrund ihrer hohen metabolischen Stabilität, geringen Immunogenität und sehr geringen Spezifität zu natürlich vorkommenden potentiellen Bindungspartnern sind L-Oligonukleotide, im speziellen L-DNA-Derivate, das ideale System bzgl. der In-vivo-Hybridisierung zwischen einem tumorspezifischen Antikörper und der radioaktiv markierten Chelateinheit. Das verwendete Pretargeting-System besteht aus den Radionuklid markierbaren Komponenten NOTA-L-DNA-(0-20kDa)-PEG 6a-e sowie DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d und aus der targetspezifischen Antikörper-Einheit, deren Entwicklung eines der Aufgabengebiete der vorliegenden Arbeit darstellte. Als Antikörper wurde dabei der klinisch zugelassene chimäre monoklonale Antikörper Cetuximab (Handelsname Erbitux®, C225) verwendet, welcher mit sehr hoher Affinität an das Oberflächenprotein „Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor“ (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) bindet. Die Zielstellung dieser Arbeit beinhaltete vor allem die In-vitro- und In-vivo-Charakterisierung des L-DNA basierenden Pretargeting-Systems im Hinblick darauf, ob das Internalisierungsverhalten von Cetuximab einen limitierenden Faktor für seine Anwendung in Pretargeting-Experimenten darstellt. Es konnten zwei mit der komplementären L-DNA (c-L-DNA) modifizierte Cetuximab-Derivate mit einem niedrigen (n = 1,5) und einem hohen (n = 5) Konjugationsgrad an c-L-DNA hergestellt werden. Zur radiopharmakologischen Charakterisierung wurden beide Konjugate zusätzlich mit NOTA funktionalisiert und entsprechende Verfahren zur Markierung mit dem Radiometallnuklid 64Cu erarbeitet. Die Reaktionsparameter sowohl bei der Synthese als auch bei der Radiomarkierung wurden hinsichtlich des pH-Wertes, der Temperatur und der mechanischen Beanspruchung so gewählt, dass einerseits der Affinitätsverlust in Bezug zum nativen Cetuximab möglichst gering gehalten wird und andererseits die erarbeiteten Protokolle sich perspektivisch auch auf andere Antikörper übertragen lassen. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit bestand darin, die Internalisierungsgeschwindigkeit der beiden Cetuximab-Konjugate NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 im Hinblick auf deren Eignung für In vivo-Pretargeting-Experimente zu bewerten. Dabei wurde festgestellt, dass bereits nach 24 h an A431- und FaDu-Zellen 50 - 70% des auf der Zelloberfläche gebundenen Antikörpers nicht mehr für die Bindung der radioaktiv markierten Komponente zur Verfügung stand. 72 h nach der Antikörperapplikation waren sogar 80 - 90% des extrazellulär gebundenen Antikörpers internalisiert. Besonders diese hohe Internalisierungsrate könnte im Hinblick auf In-vivo-Anwendungen problematisch sein und eine geringe Tumorakkumulation der radioaktiv markierten Komponente bewirken. Infolge der Konjugation von Cetuximab mit p-SCN-Bn-NOTA 3, GMBS 9 und 17mer-c-L-DNA 2 war eine Änderung der pharmakologischen Eigenschaften von Cetuximab nachweisbar. Insbesondere dadurch, dass die Antikörpermodifikation vorrangig an den Aminogruppen der Lysin-Einheiten erfolgte und durch das 17fach negativ geladene Phosphatrückgrat des Oligonukleotids, wurde eine starke Anionisierung der Oberflächenladung und damit eine Verringerung des isoelektrischen Punktes festgestellt. Dennoch bestätigten Kompetitionsbindungsstudien an A431- und FaDu-Gesamtzellhomogenat für alle untersuchten Antikörper-Derivate unabhängig vom Konjugationsgrad deren sehr hohe Affinität zum EGFR. Auch die an intakten Zellen berechneten KD-Werte unterstreichen dies. Einzig die Bindungskapazität weist dabei eine Abhängigkeit zum Konjugationsgrad auf, sodass trotz sehr guter Ki- und KD-Werte auf eine Verringerung der Affinität infolge der Antikörpermodifikation zu schließen ist. Interessant ist auch, dass nach einem Zeitraum > 4 h eine zweite Bindungsphase auftritt, welche möglicherweise durch eine Reexpression des EGFR aus intrazellulären Kompartimenten, infolge der Internalisierung des Rezeptor-Antikörperkomplexes, hervorgerufen wird. Außerdem wurde untersucht, inwieweit die unterschiedlichen und sterisch sehr anspruchsvollen PEG-Substituenten der 17mer-L-DNA die Hybridisierung am Antikörper sowie am Rezeptor-Antikörper-Komplex an A431- und FaDu-Zellen beeinflussen. Dabei stellte sich heraus, dass die Hybridisierung am Immunkomplex in Abhängigkeit des PEGylierungsgrades vom nicht PEGylierten Konjugat [64Cu]Cu6a zum 20kDa-PEG-Derivat [64Cu]Cu6e sukzessive abnimmt. Hingegen scheint der PEGylierungsgrad bei der Hybridisierung am im Phosphatpuffer und im humanen Vollblut inkubierten Antikörper keinen Einfluss zu haben. Weiterhin wurde im Zellversuch gezeigt, dass am hoch modifizierten Cetuximab-Konjugat NOTA3-C225-(c L-DNA)5 in Abhängigkeit des Konjugationsgradunterschiedes zum niedrig modifizierten Derivat NOTA3-C225-(c L-DNA)1,5 ca. dreimal mehr Ligand hybridisiert. Erste In-vivo-Pretargeting-Untersuchungen bestätigten, dass NOTA-L-DNA-10kDa-PEG 6d der ideale „Kandidat“ für das Pretargeting-Konzept basierend auf L-konfigurierten Oligonukleotiden ist. Besonders die wesentlich höhere Tumorakkumulation von [68Ga]Ga6d (10kDa-PEG) im Vergleich zu den anderen untersuchten L-DNA-Konjugaten [68Ga]Ga 6a-c (0, 2, 5kDa PEG) und [68Ga]Ga6e (20kDa-PEG) ist dabei von besonderer Bedeutung. Zukünftige Pretargeting-Studien sollten demnach ausschließlich mit der 10kDa-PEG modifizierten 17mer-L-DNA durchgeführt werden. Die Substitution des bifunktionalen Chelators p-SCN-Bn-NOTA 3 durch DOTA-GA-Mal 7 ermöglicht den Einsatz eines breiten Spektrums therapeutisch relevanter Radionuklide wie beispielsweise 90Y, 177Lu oder auch 67Cu. Dies konnte anhand eines ersten Pretargeting-Experimentes mit NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG [177Lu]Lu8d bestätigt werden. Zusammenfassend muss aber festgestellt werden, dass Cetuximab als Antikörper für das Pretargeting aufgrund seiner Internalisierungscharakteristik nicht geeignet ist. Es zeigte sich zwar, dass nach 24 h mittels Pretargeting eine verringerte Leberakkumulation im Vergleich zum direkt markierten Cetuximab-Derivat [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 erzielt werden kann, allerdings fällt die Tumorakkumulation ebenfalls um ca. 40 – 70% niedriger aus und demnach wird eine deutlich geringere Dosis im Tumor angereichert. Dies lässt den Rückschluss zu, dass in vivo eine ähnlich hohe Internalisierung auftritt wie im In-vitro-Zellversuch ermittelt. Das Pretargeting-Intervall musste demnach auf 24 h festgesetzt werden, auch wenn zum Zeitpunkt der Applikation der radioaktiv markierten Komponente der Antikörper immer noch im vaskulären System zirkulierte. Kleintier-PET-Aufnahmen lassen allerdings vermuten, dass eine Applikation der radioaktiv markierten Komponente 48 h nach der Antikörper-Gabe bessere Verteilungsverhältnisse ergeben hätte. Der eigentliche Vorteil des Pretargetings, innerhalb weniger Stunden eine ähnlich hohe Tumorakkumulation zu erzielen, wie sie direkt markierte Antikörper erst nach mehreren Tagen aufweisen, konnte mit Cetuximab nicht verwirklicht werden.

Zur Behandlung von Tumorerkrankungen sind radioaktiv markierte Antikörper als hochaffine und selektive Radioimmuntherapeutika von zunehmender Bedeutung. Allerdings ist der Einsatz solcher radioaktiv markierter Antikörper bei der Behandlung strahlenresistenter solider Tumore limitiert, weil infolge ihrer hohen Blutverweildauer und nur langsamen Anreicherung im Zielgewebe, bedingt durch ihre Molekülgröße, der gesamte Organismus einer hohen Strahlenbelastung ausgesetzt wird. Eine Alternative dazu stellt die Strategie des Pretargeting von Tumoren dar. Die Intention dieses Prinzips besteht darin, mittels einer mehrstufigen Applikationsfolge die Injektion eines targetspezifischen Antikörper-Konjugates und einer kleinen radioaktiv markierten Verbindung zu trennen, welche zueinander ein komplementäres System bilden. Eine Substanzklasse die erstmals von Wissenschaftlern des Helmholtz-Zentrums Dresden-Rossendorf (HZDR) als potentielles komplementäres System für Tumor-Pretargeting-Anwendungen untersucht wurden ist, sind spiegelbildliche bzw. L konfigurierte Oligonukleotide. Aufgrund ihrer hohen metabolischen Stabilität, geringen Immunogenität und sehr geringen Spezifität zu natürlich vorkommenden potentiellen Bindungspartnern sind L-Oligonukleotide, im speziellen L-DNA-Derivate, das ideale System bzgl. der In-vivo-Hybridisierung zwischen einem tumorspezifischen Antikörper und der radioaktiv markierten Chelateinheit. Das verwendete Pretargeting-System besteht aus den Radionuklid markierbaren Komponenten NOTA-L-DNA-(0-20kDa)-PEG 6a-e sowie DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d und aus der targetspezifischen Antikörper-Einheit, deren Entwicklung eines der Aufgabengebiete der vorliegenden Arbeit darstellte. Als Antikörper wurde dabei der klinisch zugelassene chimäre monoklonale Antikörper Cetuximab (Handelsname Erbitux®, C225) verwendet, welcher mit sehr hoher Affinität an das Oberflächenprotein „Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor“ (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) bindet. Die Zielstellung dieser Arbeit beinhaltete vor allem die In-vitro- und In-vivo-Charakterisierung des L-DNA basierenden Pretargeting-Systems im Hinblick darauf, ob das Internalisierungsverhalten von Cetuximab einen limitierenden Faktor für seine Anwendung in Pretargeting-Experimenten darstellt. Es konnten zwei mit der komplementären L-DNA (c-L-DNA) modifizierte Cetuximab-Derivate mit einem niedrigen (n = 1,5) und einem hohen (n = 5) Konjugationsgrad an c-L-DNA hergestellt werden. Zur radiopharmakologischen Charakterisierung wurden beide Konjugate zusätzlich mit NOTA funktionalisiert und entsprechende Verfahren zur Markierung mit dem Radiometallnuklid 64Cu erarbeitet. Die Reaktionsparameter sowohl bei der Synthese als auch bei der Radiomarkierung wurden hinsichtlich des pH-Wertes, der Temperatur und der mechanischen Beanspruchung so gewählt, dass einerseits der Affinitätsverlust in Bezug zum nativen Cetuximab möglichst gering gehalten wird und andererseits die erarbeiteten Protokolle sich perspektivisch auch auf andere Antikörper übertragen lassen. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit bestand darin, die Internalisierungsgeschwindigkeit der beiden Cetuximab-Konjugate NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 im Hinblick auf deren Eignung für In vivo-Pretargeting-Experimente zu bewerten. Dabei wurde festgestellt, dass bereits nach 24 h an A431- und FaDu-Zellen 50 - 70% des auf der Zelloberfläche gebundenen Antikörpers nicht mehr für die Bindung der radioaktiv markierten Komponente zur Verfügung stand. 72 h nach der Antikörperapplikation waren sogar 80 - 90% des extrazellulär gebundenen Antikörpers internalisiert. Besonders diese hohe Internalisierungsrate könnte im Hinblick auf In-vivo-Anwendungen problematisch sein und eine geringe Tumorakkumulation der radioaktiv markierten Komponente bewirken. Infolge der Konjugation von Cetuximab mit p-SCN-Bn-NOTA 3, GMBS 9 und 17mer-c-L-DNA 2 war eine Änderung der pharmakologischen Eigenschaften von Cetuximab nachweisbar. Insbesondere dadurch, dass die Antikörpermodifikation vorrangig an den Aminogruppen der Lysin-Einheiten erfolgte und durch das 17fach negativ geladene Phosphatrückgrat des Oligonukleotids, wurde eine starke Anionisierung der Oberflächenladung und damit eine Verringerung des isoelektrischen Punktes festgestellt. Dennoch bestätigten Kompetitionsbindungsstudien an A431- und FaDu-Gesamtzellhomogenat für alle untersuchten Antikörper-Derivate unabhängig vom Konjugationsgrad deren sehr hohe Affinität zum EGFR. Auch die an intakten Zellen berechneten KD-Werte unterstreichen dies. Einzig die Bindungskapazität weist dabei eine Abhängigkeit zum Konjugationsgrad auf, sodass trotz sehr guter Ki- und KD-Werte auf eine Verringerung der Affinität infolge der Antikörpermodifikation zu schließen ist. Interessant ist auch, dass nach einem Zeitraum > 4 h eine zweite Bindungsphase auftritt, welche möglicherweise durch eine Reexpression des EGFR aus intrazellulären Kompartimenten, infolge der Internalisierung des Rezeptor-Antikörperkomplexes, hervorgerufen wird. Außerdem wurde untersucht, inwieweit die unterschiedlichen und sterisch sehr anspruchsvollen PEG-Substituenten der 17mer-L-DNA die Hybridisierung am Antikörper sowie am Rezeptor-Antikörper-Komplex an A431- und FaDu-Zellen beeinflussen. Dabei stellte sich heraus, dass die Hybridisierung am Immunkomplex in Abhängigkeit des PEGylierungsgrades vom nicht PEGylierten Konjugat [64Cu]Cu6a zum 20kDa-PEG-Derivat [64Cu]Cu6e sukzessive abnimmt. Hingegen scheint der PEGylierungsgrad bei der Hybridisierung am im Phosphatpuffer und im humanen Vollblut inkubierten Antikörper keinen Einfluss zu haben. Weiterhin wurde im Zellversuch gezeigt, dass am hoch modifizierten Cetuximab-Konjugat NOTA3-C225-(c L-DNA)5 in Abhängigkeit des Konjugationsgradunterschiedes zum niedrig modifizierten Derivat NOTA3-C225-(c L-DNA)1,5 ca. dreimal mehr Ligand hybridisiert. Erste In-vivo-Pretargeting-Untersuchungen bestätigten, dass NOTA-L-DNA-10kDa-PEG 6d der ideale „Kandidat“ für das Pretargeting-Konzept basierend auf L-konfigurierten Oligonukleotiden ist. Besonders die wesentlich höhere Tumorakkumulation von [68Ga]Ga6d (10kDa-PEG) im Vergleich zu den anderen untersuchten L-DNA-Konjugaten [68Ga]Ga 6a-c (0, 2, 5kDa PEG) und [68Ga]Ga6e (20kDa-PEG) ist dabei von besonderer Bedeutung. Zukünftige Pretargeting-Studien sollten demnach ausschließlich mit der 10kDa-PEG modifizierten 17mer-L-DNA durchgeführt werden. Die Substitution des bifunktionalen Chelators p-SCN-Bn-NOTA 3 durch DOTA-GA-Mal 7 ermöglicht den Einsatz eines breiten Spektrums therapeutisch relevanter Radionuklide wie beispielsweise 90Y, 177Lu oder auch 67Cu. Dies konnte anhand eines ersten Pretargeting-Experimentes mit NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG [177Lu]Lu8d bestätigt werden. Zusammenfassend muss aber festgestellt werden, dass Cetuximab als Antikörper für das Pretargeting aufgrund seiner Internalisierungscharakteristik nicht geeignet ist. Es zeigte sich zwar, dass nach 24 h mittels Pretargeting eine verringerte Leberakkumulation im Vergleich zum direkt markierten Cetuximab-Derivat [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 erzielt werden kann, allerdings fällt die Tumorakkumulation ebenfalls um ca. 40 – 70% niedriger aus und demnach wird eine deutlich geringere Dosis im Tumor angereichert. Dies lässt den Rückschluss zu, dass in vivo eine ähnlich hohe Internalisierung auftritt wie im In-vitro-Zellversuch ermittelt. Das Pretargeting-Intervall musste demnach auf 24 h festgesetzt werden, auch wenn zum Zeitpunkt der Applikation der radioaktiv markierten Komponente der Antikörper immer noch im vaskulären System zirkulierte. Kleintier-PET-Aufnahmen lassen allerdings vermuten, dass eine Applikation der radioaktiv markierten Komponente 48 h nach der Antikörper-Gabe bessere Verteilungsverhältnisse ergeben hätte. Der eigentliche Vorteil des Pretargetings, innerhalb weniger Stunden eine ähnlich hohe Tumorakkumulation zu erzielen, wie sie direkt markierte Antikörper erst nach mehreren Tagen aufweisen, konnte mit Cetuximab nicht verwirklicht werden.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Zielstellung 7 3 Theoretischer Teil 9 3.1 Monoklonale Antikörper 9 3.2 Endoradionuklidtherapie mit Hilfe radiomarkierter Antikörper 11 3.3 Pretargeting-Konzepte zur Anwendung in der Radioimmuntherapie 12 3.3.1 Kennzeichen des Tumor-Pretargeting 12 3.3.2 Pretargeting unter Nutzung bispezifischer monoklonaler Antikörper 13 3.3.3 Das (Strept)avidin/Biotin-System 16 3.3.4 Komplementäre Oligonukleotide 20 3.3.4.1 D-Konfigurierte Oligonukleotid-Derivate als komplementäres System für Pretargeting-Anwendungen 20 3.3.4.2 L-Konfigurierte Oligonukleotid-Derivate als potentielle und stabile Komponenten für das Pretargeting von Tumoren 23 3.3.4.3 Pretargeting-Konzept mit L-konfigurierten Oligonukleotiden – Bisherige Arbeiten im HZDR 24 3.4 Der epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) als potentielles Target für Pretargeting-Anwendungen 28 3.4.1 Die Biologie des EGFR und dessen Funktion in der Onkogenese 28 3.4.2 Der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab 30 3.4.3 Antikörper vermittelte Rezeptorinternalisierung - ein Ausschlusskriterium für das Pretargeting? 32 4 Ergebnisse und Diskussion 35 4.1 Verwendete komplementäre L-DNA-Leitstruktur, Chelatoren und Radionuklide 35 4.2 Darstellung der Radionuklid markierbaren Komponente des Pretargeting Systems 39 4.2.1 Synthese von NOTA-Bn-thioharnstoff-ethylmaleinimid 5 39 4.2.2 Konjugation von 17mer-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 1a-e mit NOTA-Bn-thioharnstoff-ethyl-maleinimid 5 und DOTA-GA-Mal 7 41 4.3 Darstellung der targetspezifischen Komponente – Funktionalisierung von Cetuximab mit komplementärer L-DNA 44 4.3.1 Synthesestrategie 44 4.3.2 NOTA-Funktionalisierung von Cetuximab 46 4.3.2.1 Syntheseplanung und Durchführung 46 4.3.2.2 Analytische Charakterisierung des Derivates 47 4.3.3 Maleinimid-Funktionalisierung von NOTA3-C225 51 4.3.3.1 Syntheseplanung und Durchführung 51 4.3.3.2 Analytische Charakterisierung der Derivate 53 4.3.4 Konjugation von NOTA3-C225-Malk mit komplementärer 17mer-L-DNA 2 55 4.3.4.1 Syntheseplanung und Durchführung 55 4.3.4.2 Analytische Charakterisierung der Derivate 56 4.4 Radiochemische Synthesen 61 4.4.1 68Ga-Markierung von NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 6a-e 61 4.4.2 64Cu-Markierung von NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 6a-e 63 4.4.3 64Cu-Markierung NOTA funktionalisierter Cetuximab-Derivate 65 4.4.3.1 Entwicklung einer Methode zur schonenden Radiomarkierung von Antikörpern mit 64Cu 65 4.4.3.2 Analytische Charakterisierung der 64Cu-markierten Cetuximab-Derivate mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 67 4.4.4 177Lu-Markierung von DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d 70 4.5 In-vitro-Charakterisierung und Bewertung des Pretargeting-Systems auf dessen Eignung für In-vivo-Anwendungen 72 4.5.1 Vorüberlegungen 72 4.5.2 Untersuchungen zur Oberflächenladung modifizierter Cetuximab- Derivate 74 4.5.3 Schmelzpunktbestimmung zur Bewertung der Hybridstabilität 77 4.5.3.1 Die Schmelztemperatur der L-DNA-(0-20)kDa-PEG/c-L-DNA- Hybride 77 4.5.3.2 Die Schmelztemperatur der L-DNA-(0-20)kDa-PEG/NOTA3-C225-(c L DNA)n-Hybride 77 4.5.3.3 Die Schmelztemperatur der NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG/NOTA3-C225-(c L DNA)n-Hybride 78 4.5.4 Untersuchungen zur Bestimmung der Abhängigkeit von PEG-Substituenten unterschiedlicher Größe auf das Hybridisierungs- verhalten 79 4.5.4.1 Vorbetrachtung 79 4.5.4.2 Hybridisierungsuntersuchungen in Phosphatpuffer 79 4.5.4.3 Hybridisierungsuntersuchungen in humanem Vollblut 81 4.5.5 Kompetitionsbindungsstudien zur Bestimmung der Affinität von konjugierten Cetuximab-Derivaten 82 4.5.5.1 Vorbetrachtung 82 4.5.5.2 Kompetitionsbindungsstudien an A431-Zellhomogenaten 83 4.5.5.3 Kompetitionsbindungsstudien an FaDu-Zellhomogenaten 84 4.5.5.4 Schlussfolgerungen 85 4.5.6 Sättigungsbindungsstudien konjugierter Cetuximab-Derivate 87 4.5.6.1 Vorbetrachtung 87 4.5.6.2 Sättigungsbindungsstudien an A431-Zellen 88 4.5.6.3 Sättigungsbindungsstudien an FaDu-Zellen 91 4.5.6.4 Schlussfolgerungen 95 4.5.7 Pretargeting-Bindungsstudien von NOTA3-C225-(c-L-DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 mit [64Cu]Cu6a-e an A431- und FaDu-Zellen 98 4.5.7.1 Vorbetrachtung 98 4.5.7.2 Pretargeting-Bindungsstudien an A431-Zellen 99 4.5.7.3 Pretargeting-Bindungsstudien an FaDu-Zellen 101 4.5.7.4 Schlussfolgerungen 103 4.5.8 Internalisierungs-Bindungsstudien konjugierter Cetuximab-Derivate 103 4.5.8.1 Entwicklung eines geeigneten Internalisierungsassays basierend auf dem Pretargeting-Konzept 103 4.5.8.2 Pretargeting-Bindungsstudien an A431-Zellen 106 4.5.8.3 Pretargeting-Bindungsstudien an FaDu-Zellen 113 4.5.8.4 Schlussfolgerungen 119 4.6 In-vivo-Pretargeting-Studien 121 4.6.1 Untersuchung der In-vivo-Stabilität und Bluteliminierung von [64Cu]Cu-NOTA-L-DNA-10kDa-PEG ([64Cu]Cu6d) 121 4.6.2 Kleintier-PET-Untersuchung von [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 zur Ermittlung der Pretargeting-Wartezeit 123 4.6.3 Pretargeting-Kleintier-PET-Untersuchungen von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [68Ga]Ga-NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG ([68Ga]Ga6a-e) in Mäusen 125 4.6.4 Pretargeting-Studien von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [64Cu]Cu-NOTA-L DNA-10kDa-PEG ([64Cu]Cu6d) in Mäusen 129 4.6.4.1 Kleintier-PET-Untersuchungen an FaDu tumortragenden NMRI nu/nu Mäusen 129 4.6.4.2 Bioverteilung nach Pretargeting-Experimenten an A431 tumortragenden NMRI nu/nu Mäusen 132 4.6.5 Pretargeting-SPECT-Untersuchungen von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG ([177Lu]Lu8d) 134 4.7 Abschließende Bewertung von Cetuximab auf dessen Eignung als Antikörper für das Tumor-Pretargeting 135 5 Zusammenfassung und Ausblick 137 6 Experimenteller Teil 141 6.1 Material 141 6.1.1 Chemikalien 141 6.1.2 Puffergemische und Lösungen 143 6.1.3 Synthetische L-Oligonukleotide 146 6.1.4 Radionuklide 146 6.1.5 Zellkulturen 146 6.1.5.1 A431-Zelllinie 146 6.1.5.2 FaDu-Zelllinie 147 6.1.6 Tiermodelle 147 6.1.7 Geräte 148 6.2 Analytische Methoden 149 6.2.1 NMR-Spektroskopie 149 6.2.2 Massenspektrometrie 149 6.2.2.1 ESI-MS 149 6.2.2.2 Maldi-TOF 150 6.2.3 UV/Vis-Spektroskopie 150 6.2.4 Chromatographie 151 6.2.4.1 Dünnschichtchromatographie (DC) 151 6.2.4.2 Hochleistungsflüssigchromatographie 151 6.3 Synthesevorschriften und analytische Daten 153 6.3.1 Synthese von NOTA-Bn-thioharnstoff-ethylmaleinimid 5 153 6.3.2 Synthese der NOTA und DOTA funktionalisierten 17mer-L-DNA- Verbindungen 154 6.3.3 Synthese konjugierter Cetuximab-Derivate 157 6.3.4 Radiochemische Synthesen 161 6.3.4.1 68Ga-Radiomarkierungen 161 6.3.4.2 64Cu-Radiomarkierungen 163 6.3.4.3 177Lu-Radiomarkierungen 167 6.4 Biologisch-chemische Methoden 168 6.4.1 Schmelzpunkt-Bestimmung Fehler! Textmarke nicht definiert. 6.4.2 Gelelektrophorese 168 6.4.2.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese 168 6.4.2.2 Agarosegelelektrophorese 169 6.4.2.3 Isoelektrische Fokussierung (IEF) 170 6.4.3 Zellkultur 170 6.4.3.1 Auftauen und Anzüchten von kryokonservierten Zellen 170 6.4.3.2 Kryokonservierung von Zelllinien 170 6.4.3.3 Subkultivierung 171 6.4.3.4 Zellzahlbestimmung 171 6.4.3.5 Herstellung von Zellhomogenat 172 6.4.4 Hybridisierungs- und Bindungsassays 172 6.4.4.1 In-vitro-Hybridisierungsuntersuchungen 172 6.4.4.2 Kompetitionsassay an Zellhomogenat 173 6.4.4.3 Sättigungsbindungsstudien an intakten Zellen 174 6.4.4.4 Pretargeting-Bindungsstudien 175 6.4.4.5 Internalisierungs-Bindungsstudien 176 6.4.4.6 Bicinchoninsäure-Assay (BCA) zur Proteinbestimmung 177 6.4.4.7 Gammacounter 177 6.4.5 Metabolitenanalytik 178 6.4.6 Bioverteilungsuntersuchungen 178 6.4.7 Positronen-Emissions-Tomographie (PET) 179 6.4.8 Single-Photonen-Emissions-Tomographie (SPECT) 179 7 Anhang 180 7.1 Originaldaten 180 7.1.1 Schmelzkurven 180 7.1.2 Gelelektrophorese und Autoradiographie 181 7.1.3 Bioverteilungsdaten 186 7.2 Übersicht der Substanzen 188 7.3 Abkürzungsverzeichnis 191 7.4 Literaturverzeichnis 194 7.5 Pubblikationen, Poster und Vorträge 209 7.6 Danksagung 212