La recherche de maïs plus tolérants au déficit hydrique est un enjeu fondamental pour la production agricole dans les prochaines décennies. Le but ce travail a été d'identifier et de caractériser des gènes impliqués dans la variation de caractères complexes affectés par le déficit hydrique chez le maïs.Nous avons tout d'abord identifié des transcrits et des protéines, dont la teneur variait entre deux mélanges de lignées recombinantes différant pour une région chromosomique influençant la croissance foliaire et la protandrie en condition de déficit hydrique. Parmi les huit gènes candidats cartographiés au niveau de la région d'intérêt, se trouvait le facteur de transcription ZmMYB31 impliqué dans la biosynthèse de la lignine. Nous avons montré que son expression était corrélée à celle de deux de ses cibles, à la teneur en lignine et à l'expression du gène ZmFatA impliqué dans la biosynthèse des acides gras, suggérant un rôle régulateur de la protéine ZmMYB31 via la synthèse de lignine et de dérivés lipidiques.Dans un second volet, nous avons montré que la sur-expression du gène candidat ZmASR1 (ZmASR1-OE) chez le maïs maintenait le rendement en condition de déficit hydrique. Des analyses transcriptomiques et protéomiques nous ont permis d'identifier 25 cibles de la protéine ZmASR1, dont sept gènes impliqués dans la biosynthèse des acides aminés branchés. Nous avons également montré qu'il existait une étroite corrélation entre 13 métabolites diminués par ZmASR1-OE, six étant connus pour être négativement corrélés à la biomasse. Enfin, des résidus phosphorylés ont été identifiés chez les protéines ZmASR1, ZmASR2 et ZmASR3, suggérant leur régulation par phosphorylation.

Synthèse de la carrière

Mitochondrial mutations and heteroplasmy have been associated with disease states that result from inadequate cellular energy production. As mitochondrial DNA (mtDNA) encodes many of the polypeptides involved in oxidative phosphorylation (OXPHOS), mtDNA mutations may lower energy production which is required for cell division and sustained ATP synthesis. In order to test the relationship between mtDNA mutations and the rate of cell division, a mammary epithelial cancer cell line, MCF-7, is used as a model. Nine proliferate single cell clones have been isolated from MCF-7. Population doubling times of six single cell clones and the MCF-7 stock have been determined. Clones with distinctly different growth rates were selected for mutational analysis. Growth rates of these clones appeared to be different from each other. Using polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing, three cases of heteroplasmy have been identified in the mitochondrial genes of the MCF-7 stock and four single cell clones (ATPase C9119T, ND6 T14300G, Cytb G15807A). Heteroplasmy present in the Cytb gene is differs between single cell clones. Differences between the growth rates may be indicative of metabolic variations in these single cell clones. The OXPHOS enzymes encoded by the mutated genes were quantified by standard enzymatic assays. The assays demonstrated significant differences in specific activity between the clones, but were not correlated with mitochondrial heteroplasmy. This thesis determines that the differences in specific activity observed between clones is of nuclear origin.

Le récepteur de l'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP[indice inférieur 3]R) est un canal calcique qui joue un rôle majeur dans la régulation du Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire. Il existe trois sous-types d'IP[indice inférieur 3]R. Peu d'information est disponible sur les propriétés de l'IP[indice inférieur 3]R-2 et de l'IP[indice inférieur 3]R-3. De plus, la régulation spécifique du mécanisme de signalisation calcique peut être accomplie par l'activation simultanée de plusieurs voies de signalisation. Les kinases intervenant lors de l'activation concomitante de la voie de production de l'AMPc et des voies prolifératives sont susceptibles de réguler les IP[indice inférieur 3]R. Ainsi, l'objectif de ma thèse fut de caractériser l'effet de la protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA) et de la cible mammalienne de la rapamycine (mTOR) sur l'activité de l'IP[indice inférieur 3]R-2. La première partie de ma thèse consista à étudier l'effet possible de la PKA sur l'activité de l'IP[indice inférieur 3]R-2 dans les cellules AR4-2J, une lignée cellulaire exprimant principalement l'IP[indice inférieur 3]R-2. Nous avons d'abord démontré que l'IP[indice inférieur 3]R-2 est un bon substrat de la PKA. Qui plus est, des essais calciques réalisés sur des cellules AR4-2J perméabilisées suggèrent que la PKA augmente l'affinité apparente de l'IP[indice inférieur 3]R-2. Enfin, la stimulation de la production d'AMPc entraîne une augmentation des relâches calciques dans les cellules AR4-2J intactes. Ces résultats suggèrent donc que la PKA augmente l'activité de l'IP[indice inférieur 3]R-2. Dans la seconde partie de cette thèse, nous démontrons que la kinase mTOR, point de convergence des voies prolifératives, phosphoryle l'IP[indice inférieur 3]R-2 dans les cellules AR4-2J. Les essais calciques réalisés sur des cellules AR4-2J perméabilisées suggèrent également que mTOR augmente l'affinité apparente de l'IP[indice inférieur 3]R-2. De surcroît, la rapamycine (un inhibiteur de mTOR) réduit les relâches calciques induites par le carbachol dans les cellules AR4-2J et dans les cellules HEK 293A exprimant presque exclusivement l'IP[indice inférieur 3]R-2. Ces résultats suggèrent donc que mTOR augmente l'activité de l'IP[indice inférieur 3]R-2. L'ensemble de ces travaux approfondit notre compréhension des mécanismes par lesquels les signaux calciques sont finement régulés dans les cellules.

L'endothélium constitue un véritable organe qui sécrète de nombreuses substances vasoactives régissant des fonctions cardiovasculaires vitales telles que le tonus et la croissance vasculaires. Ce tissu requiert la polyvalence de la signalisation calcique puisque plusieurs de ses fonctions dépendent de la modulation de la concentration intracellulaire de Ca[indice supérieur 2+].L'un des moyens utilisés par les cellules endothéliales pour assurer une réponse calcique efficace et spécifique est la propagation des signaux sous forme de vagues. Dans ce travail, nous avons décortiqué les mécanismes de mobilisation du Ca[indice supérieur 2+] intracellulaire menant à la propagation de vagues de Ca[indice supérieur 2+]. Nous avons recueilli des données qui aideront à mieux comprendre à la fois l'organisation et la propagation de vagues de Ca[indice supérieur 2+] dans les cellules endothéliales d'aorte de boeuf (BAEC). Nous montrons par vidéomicroscopie, que la stimulation des BAEC avec l'ATP ou avec la bradykinine (BIC) induit une réponse calcique oscillatoire finement régulée dans le temps et dans l'espace. En fait, le Ca[indice supérieur 2+] se propage d'une extrémité à l'autre de la cellule sous la forme d'une vague qui se produit en présence ou en absence de Ca[indice supérieur 2+] extracellulaire. Bien que les vagues de Ca[indice supérieur 2+] soient initiées à un endroit très précis près de la membrane plasmique, les cavéoles ne sont pas essentielles à leur propagation dans les BAEC, contrairement à ce qui a été observé dans certains autres types cellulaires. Toutefois, la dépolymérisation des microfilaments avec la latrunculine B et des microtubules avec la colchicine empêche la propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+]. Dans ces conditions, les BAEC présentent plutôt une augmentation calcique uniforme dans toute la cellule. Ces résultats suggèrent que, dans les BAEC, les cavéoles ne sont pas impliquées dans l'organisation de la réponse calcique sous forme de vague, mais que l'organisation du cytosquelette est essentielle. Nous montrons aussi que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] est constante d'un bout à l'autre d'une BAEC, ce qui est incompatible avec un mécanisme impliquant uniquement la diffusion de l'IP[indice inférieur 3] ou du Ca[indice supérieur 2+]. Nous montrons également que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] dépend de l'intensité de la stimulation et aussi de l'état fonctionnel de l'IP[indice inférieur 3]R qui peut être modulé par des kinases endogènes comme la PKA, la PKC et mTOR. Enfin, nous montrons que la vitesse de propagation de la vague de Ca[indice supérieur 2+] n'est pas directement reliée à l'amplitude de la relâche de Ca[indice supérieur 2+]. La vitesse de propagation des vagues de Ca[indice supérieur 2+] est un paramètre relativement nouveau dans le domaine de la signalisation calcique intracellulaire. Il reste à définir jusqu'à quel point ce paramètre peut être utile dans l'interprétation des différentes activités cellulaires.

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le mauvais pronostic du cancer pancréatique est en partie dû à l’acquisition extrêmement rapide de propriétés invasives et métastatiques par les cellules tumorales pancréatiques et à la faible efficacité des thérapies actuelles. Il est donc essentiel d’identifier de nouvelles cibles utiles au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos travaux impliquent directement la diminution de l'expression d'ArgBP2 dans le processus de dérivation ma ligne du pancréas. ArgBP2 est une protéine adaptatrice régulant la dynamique du cytosquelette d’actine et la transduction des signaux. Nous avons montré que l’activité anti-tumoraled’ArgBP2 in vivo est corrélée à une diminution de l’adhésion, de l’étalement et de la migration des cellules cancéreuses pancréatiques in vitro. Dans le but d’identifier les fonctions associées à son rôle anti-tumoral, nous avons recherché de nouveaux partenaires moléculaires d’ArgBP2 et mis en évidence son interaction avec les protéines WAVE (facteurfavorisant la polymérisation de l’actine), la phosphatase PTP-PEST et la protéine adaptatriceCIP4 qui elles-mêmes sont connues pour réguler le cytosquelette d’actine et la motilité cellulaire. De manière intéressante, nous avons montré que PTP-PEST est indispensable à l’inhibition de la migration cellulaire par ArgBP2. Par ailleurs, nos résultats montrentqu’ArgBP2 régule la fonction de WAVE1 en contrôlant sa phosphorylation par la kinase c-Abl et sa déphosphorylation par PTP-PEST. Nous avons en outre montré que CIP4 est aussi un partenaire de WAVE1, phosphorylé par c-Abl, et qu’elle participe à cette régulation. Enfin,nos résultats mettent en évidence un rôle essentiel de la phosphorylation et de la dimérisationd’ArgBP2 dans la régulation de ses interactions avec ses partenaires et de ses fonctions. / The poor prognosis of pancreatic cancer is partly due to the early acquisition of invasive andmetastatic properties by pancreatic tumoral cells and to the limited efficacy of actualtherapies. Thus, the identification of new targets for novel therapeutic strategies is animportant challenge. Our works directly implicate the decrease of ArgBP2 expression in thetumorigenic process of pancreatic cancer. ArgBP2 is an adaptor protein regulating actincytoskeleton dynamics and cell signaling. We found that the anti-tumoral activity of ArgBP2is correlated with the inhibition of the adhesion, spreading and migration of pancreaticcancerous cells. In order to better understand its anti-tumoral function, we searched newpartners for ArgBP2 and identified, among them, WAVE1 (a nucleation promoting factor),the phosphatase PTP-PEST and the adaptor protein CIP4, which are known to regulate actincytoskeleton and cellular motility. Interestingly, we found that PTP-PEST is necessary toArgBP2 mediated inhibition of cell migration. Additionally, we showed that ArgBP2regulates WAVE1 function by controlling its phosphorylation by c-Abl kinase and itsdephosphorylation by PTP-PEST. Moreover we found that CIP4 is also a WAVE1 interactingprotein, phosphorylated by c-Abl, and that CIP4 participates to the ArgBP2 dependent controlof WAVE1. Finally, our results highlight a primordial role of ArgBP2 phosphorylation anddimerization in the control of its interactions with its partners and in the regulation of itsfunctions

Viruses are infectious agents that must infect the cells of living organisms in order to reproduce. They have relatively simple genomes which encode few proteins but can compensate for their simplicity by hijacking components of their cellular hosts. Arenaviruses, a family of zoonotic viruses carried by rodents, encode only 4 proteins. One of these proteins, Z, is responsible for several functions during the virus life cycle including driving the formation and release of new virus particles at the plasma membrane of infected cells. Relatively little is known about how this viral protein is regulated or the complement of host proteins it engages in order to produce new virus particles or augment Z's other functions. To address this gap in knowledge, mass spectrometry was used to identify phosphorylation sites in the Old World arenavirus, lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) Z protein. Phosphorylation sites were identified at serine 41 (S41) and tyrosine 88 (Y88). Functional studies using recombinant (r)LCMV containing mutations at these phosphorylation sites revealed that both were important for the production of defective interfering (DI) particles. DI particles are replication-incompetent virus particles that interfere with the production of infectious virus and mitigate its cytopathic effect. While a mutation that mimics phosphorylation at S41 reduced LCMV's ability to produce both infectious and DI particles, this mutation had a much stronger impact on DI particles. Production of DI particles in Y88-mutant rLCMV was drastically reduced while the impact on infectious virus was minimal. Y88 lies within a type of viral late domain (PPXY) also found in matrix proteins of several disparate virus families where it has been shown to drive infectious virus release by recruiting the membrane scission machinery of the cellular endosomal sorting complex required for transport (ESCRT). Inhibition of the ESCRT pathway drastically reduced LCMV DI particle but not infectious virus release indicating that Z's PPXY late domain and the cellular ESCRT complex are required specifically for the production of DI particles. Mass spectrometry was also used to identify host protein partners of Z as well as the host proteins recruited into virus particles for the New World arenavirus, Junin (JUNV). ESCRT complex proteins were enriched in JUNV virus-like particles (VLPs) and bona fide virions. In contrast to LCMV, inhibition of the ESCRT complex resulted in significantly less infectious JUNV release. This indicates that the ultimate role of ESCRT engagement by the Old World arenavirus, LCMV, differs from that of New World, JUNV. This work represents the first demonstration that a viral protein motif and the host machinery it engages selectively drive DI particle production independently of infectious virus. It also suggests that host cell kinases can dynamically regulate the production of DI particles through phosphorylation of Z. Finally, the late domain-mutant rLCMV generated in these studies represents the first LCMV strain known to produce undetectable levels of DI particles which provides the opportunity to assess the impact that a loss of DI particles has on the ability of LCMV to establish or maintain a persistent infection.

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