Cette thèse vise à démontrer l’importance de la PI 3-kinase dans la régulation hormonale de la réabsorption rénale du sodium. Ce contrôle extrêmement précis, notamment par l’aldostérone, s’effectue au niveau du néphron distal. Nous avons utilisé comme modèle l’épithélium de cellules A6, dérivées du tubule distal de Xenopus Laevis. Le transport unidirectionnel de sodium s’effectue en deux étapes: depuis, l’entrée à partir du milieu luminal par des canaux sodiques épithéliaux (ENaCs) insérés dans la membrane apicale, jusqu’à la sortie vers le liquide extracellulaire par des pompes Na+/K+-ATPases, situées dans la membrane basolatérale. L’insuline augmente ce transport de sodium et la PI 3-kinase semble assurer un rôle-clef. Nous avons étudié l’importance de chacun des 3-phosphoinositides produits par la PI 3-kinase, sur le transport du sodium en ajoutant au milieu cellulaire des formes «perméantes» de ces phospholipides. Parmi ceux-ci, le PIP3 et dans une moindre intensité le PI(3,4)P2 augmentent ce transport. En revanche, le PI3P, le PI(3,5)P2, ainsi que le PI(4,5)P2 n’ont pas d’effet sur lui. Nous avons démontré par la technique du Western blot que la 3-phosphatase PTEN est exprimée dans les cellules A6. Cette phosphatase déphosphoryle le PIP3 en PI(4,5)P2. Nous avons surexprimé PTEN dans les cellules A6. Ceci réduit l’augmentation du transport du sodium induite par l’insuline, ainsi que celle induite par addition de la forme «perméante» de PIP3. Nous avons ensuite vérifié si d’autres agents qui activent la PI 3-kinase, stimulent également le transport de sodium à travers cet épithélium. A cette fin, nous avons d’abord vérifié que l’EGF et le peroxyde d’hydrogène, connus pour stimuler la PI 3-kinase dans d’autres systèmes, activent également cette enzyme dans les cellules A6. Tous deux augmentent ce transport. L’importance de l’augmentation induite par H2O2 est comparable à celle de l’insuline, tandis que l’effet de l’EGF est plus transitoire. Un dosage d’activité de la PI 3-kinase, nous a permis de démontrer que l’intensité de l’activation de la PI 3-kinase est corrélée avec l’amplitude de l’augmentation du transport du sodium. Par comparaison avec l’effet de l’insuline et de l’H2O2, l’EGF augmente faiblement l’activité de la PI 3-kinase et induit une faible augmentation du transport. Nous avons également examiné si la voie des MAPK influence la stimulation du transport du sodium par ces différents agents. Cette voie ne semble pas impliquée dans l’effet de l’insuline ou du peroxyde d’hydrogène. Par contre, elle diminue la stimulation du transport de sodium par l’EGF. L’effet de l’EGF sur le transport semble résulter d’un compromis entre l’activation de la voie de la PI 3-kinase qui l’augmente et l’activation de la voie des MAPK qui le diminue. En conclusion, une augmentation de PIP3, soit par addition de PIP3 exogène, soit par augmentation endogène sous l’effet de l’insuline ou d’autres agents stimulant la PI 3-kinase, augmente le transport du sodium tandis qu’une diminution de PIP3 endogène (par surexpression de PTEN) le diminue. L’importance de l’activation de la PI 3-kinase est quantitativement corrélée avec l’importance de l’augmentation du transport du sodium. La PI 3-kinase est donc un médiateur-clef de la régulation rénale de ce transport.

Les membres de la famille des 5-phosphatases d’inositols polyphosphates et de phosphoinositides sont des enzymes caractérisées par la présence de deux domaines catalytiques conservés qui hydrolysent un phosphate en position 5 sur un noyau inositol. SKIP (Skeletal Muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase), également appelée Pps (Putative PI 5-phosphatase) est un des derniers membres de la famille des 5-phosphatases à avoir été découvert à ce jour. Cette enzyme hydrolyse majoritairement le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) et le phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3). Les phosphoinositides (PtdIns) représentent environ 10% des lipides membranaires et sont impliqués dans de nombreuses cascades de signalisation cellulaire conduisant, entre autres, à la prolifération, l’apoptose, la différenciation, la sécrétion, le trafic vésiculaire et la mobilité cellulaire. Des études de surexpression de SKIP en cellules tendent à montrer que cette protéine pourrait jouer un rôle de régulateur négatif dans la formation du cytosquelette d’actine et/ou dans la voie de signalisation de l’insuline. Afin d’étudier in vivo la fonction de la protéine SKIP chez la souris, nous avons décidé de générer des souris transgéniques surexprimant cette protéine de manière conditionnelle. Dans ce but, nous avons infecté des embryons murins par des lentivirus porteurs d’un transgène SKIP et avons obtenu, après réimplantation des embryons infectés dans des femelles pseudogestantes, deux lignées de souris transgéniques. Celles-ci ont ensuite été croisées avec des souris exprimant la recombinase Cre de manière ubiquitaire afin de pouvoir activer la transcription de SKIP dans l’ensemble des organes. Des expériences de Western blot, de dosage d’activité 5-phosphatase ainsi que des PCR en temps réel sont venus confirmer la présence de la protéine transgénique et de son activité catalytique. L’ensemble des expériences qui ont été menées du point de vue phénotypique tend à montrer que dans notre modèle, la surexpression de SKIP ne provoque aucune anomalie évidente du point de vue anatomique, glycémique ou immunologique. Toutefois, des expériences concernant la physiologie rénale ont été réalisées sur base des résultats d’immunohistochimie et nous ont permis de détecter une anomalie dans les mécanismes de réabsorption d’eau ainsi que dans l’expression et la phosphorylation des canaux hydriques AQP2.

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Phospholipid scramblase 4 (PLSCR4) is a member of a conserved enzyme family with high relevance for the remodeling of phospholipid distribution in the plasma membrane and the regulation of cellular signaling. While PLSCR1 and -3 are involved in the regulation of adipose-tissue expansion, the role of PLSCR4 is so far unknown. PLSCR4 is significantly downregulated in an adipose-progenitor-cell model of deficiency for phosphatase and tensin homolog (PTEN). PTEN acts as a tumor suppressor and antagonist of the growth and survival signaling phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/AKT cascade by dephosphorylating phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PIP3). Patients with PTEN germline deletion frequently develop lipomas. The underlying mechanism for this aberrant adipose-tissue growth is incompletely understood. PLSCR4 is most highly expressed in human adipose tissue, compared with other phospholipid scramblases, suggesting a specific role of PLSCR4 in adipose-tissue biology. In cell and mouse models of lipid accumulation, we found PLSCR4 to be downregulated. We observed increased adipogenesis in PLSCR4-knockdown adipose progenitor cells, while PLSCR4 overexpression attenuated lipid accumulation. PLSCR4 knockdown was associated with increased PIP3 levels and the activation of AKT. Our results indicated that PLSCR4 is a regulator of PI3K/AKT signaling and adipogenesis and may play a role in PTENassociated adipose-tissue overgrowth and lipoma formation.

cAMP and Ca2+ are key regulators of exocytosis in many cells, including insulin-secreting pancreatic β-cells. Glucose-stimulated insulin secretion from β-cells is pulsatile and driven by oscillations of the cytoplasmic Ca2+ concentration ([Ca2+]i), but little is known about the kinetics of cAMP signaling and the mechanisms of cAMP action. Evanescent wave microscopy and fluorescent translocation biosensors were used to monitor plasma membrane-related signaling events in single MIN6-cells and primary mouse β-cells. Glucose stimulation of insulin secretion resulted in pronounced oscillations of the membrane phospholipid PIP3 caused by autocrine activation of insulin receptors. Glucose also triggered oscillations of the sub-plasma membrane cAMP concentration ([cAMP]pm). These oscillations were preceded and enhanced by elevations of [Ca2+]i, but conditions raising cytoplasmic ATP triggered [cAMP]pm elevations without accompanying changes in [Ca2+]i. The [cAMP]pm oscillations were also synchronized with PIP3 oscillations and both signals were suppressed after inhibition of adenylyl cyclases. Protein kinase A (PKA) was important for promoting concomitant initial elevations of [cAMP]pm and [Ca2+]i, and PKA inhibitors diminished the PIP3 response when applied before glucose stimulation, but did not affect already manifested PIP3 oscillations. The glucose-induced PIP3 oscillations were markedly suppressed in cells treated with siRNA against the cAMP-dependent guanine nucleotide exchange factor Epac2. Pharmacological activation of Epac restored PIP3 responses after adenylyl cyclase or PKA inhibition. Glucose and other cAMP-elevating stimuli induced redistribution of fluorescence-tagged Epac2 from the cytoplasm to the plasma membrane. This translocation was modulated by [Ca2+]i and depended on intact cyclic nucleotide-binding and Ras-association domains. In conclusion, glucose generates cAMP oscillations in β-cells via a concerted action of Ca2+ and metabolically generated ATP. The oscillations are important for the magnitude and kinetics of insulin secretion. While both protein kinase A and Epac is required for initiation of insulin secretion the cAMP-dependence of established pulsatility is mediated by Epac2.

PIP3 dynamics observed in membranes are responsible for the protruding edge formation in cancer and amoeboid cells. The mechanisms that maintain those PIP3 domains in three-dimensional space remain elusive, due to limitations in observation and analysis techniques. Recently, a strong relation between the cell geometry, the spatial confinement of the membrane, and the excitable signal transduction system has been revealed by Hörning and Shibata (2019) using a novel 3D spatiotemporal analysis methodology that enables the study of membrane signaling on the entire membrane (Hörning and Shibata, 2019). Here, using 3D spatial fluctuation and phase map analysis on actin polymerization inhibited Dictyostelium cells, we reveal a spatial asymmetry of PIP3 signaling on the membrane that is mediated by the contact perimeter of the plasma membrane—the spatial boundary around the cell-substrate adhered area on the plasma membrane. We show that the contact perimeter guides PIP3 waves and acts as a pinning site of PIP3 phase singularities, that is, the center point of spiral waves. The contact perimeter serves as a diffusion influencing boundary that is regulated by a cell size- and shape-dependent curvature. Our findings suggest an underlying mechanism that explains how local curvature can favor actin polymerization when PIP3 domains get pinned at the curved protrusive membrane edges in amoeboid cells.

Name: Anna Jadwiga Kielkowska Dissertation title: The role of PTEN as a PI(3,4)P2 lipid phosphatase in Class I phosphoinositide 3-kinase signalling Abstract Class I phosphoinositide 3-kinases (Class I PI3Ks) are essential players involved in the signalling events in the cell and are critical promoters of cellular growth, survival and metabolism. Once activated by environmental stimuli such as growth factors, cytokines or antigens, they exert their catalytic activity by phosphorylating phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PI(4,5)P2) to yield a second messenger - PI(3,4,5)P3. Unrestrained PI(3,4,5)P3 signalling has been classically associated with hyperactivation of the Class I PI3K/AKT pathway and has been shown to be a molecular trigger of many pathophysiologies in humans, including autoimmune disorders, respiratory diseases and cancer. To date, two classes of lipid phosphatases SHIP1/2 and PTEN have been reported, which dephosphorylate PI(3,4,5)P3 on positions 5’ and 3’ of the inositol ring to generate PI(3,4)P2 and PI(4,5)P2 respectively, and thus quench Class I PI3K signalling. Moreover, PI(3,4)P2 levels in the cell are regulated by two important lipid 4-phosphatases - INPP4A/B. While the role of PTEN as a tumour suppressor is well established, functions of SHIP1/2 and INPP4A/B are just starting to emerge. A major barrier to progress in this field has been the lack of high quality measurements of PI(3,4)P2, to assess the impact it may have on shaping cellular behaviour. This dissertation summarises the work performed to develop a novel, HPLC-ESI MS/MS based method, in order to measure the product of PI(3,4,5)P3 5-dephosphorylation, PI(3,4)P2, separated from its more abundant regioisomer in cells - PI(4,5)P2. This and an existing HPLC-ESI MS/MS method for measuring PI(3,4,5)P3, have enabled us to describe the fluxes through Class I PI3K-controlled PI(3,4,5)P3 generation and its subsequent 3- and 5- dephosphorylation pathways in human mammary epithelial cells (Mcf10a) stimulated with epidermal growth factor (EGF). By means of genetic suppression of PTEN and INPP4B, we revealed an unexpectedly high level of PI(3,4)P2 that accumulates in EGF-stimulated PTEN-INPP4B-KO Mcf10a cells. Further, an in vitro biochemical assay suggested a novel role for PTEN as a direct PI(3,4)P2 3-phosphatase in Mcf10a cells. This important observation was supported by in sillico phosphatidylinositol lipid modelling of the relevant pathways. In an effort to understand its potential physiological significance, we demonstrated that PI(3,4)P2 accumulation correlates with the ability of genetically modified Mcf10a cells to form gelatin-degrading invadopodia. Finally, we used a mouse prostate cancer model to show PTEN’s importance in controlling PI(3,4)P2 levels in vivo, pointing to a potential role for PI(3,4)P2 in PTEN-dependent tumourigenesis. I hope that the work described in this dissertation will contribute to the current knowledge of phosphatidylinositol lipid biology in the context of Class I PI3K signalling and will simulate future efforts to gain an in-depth understanding of the roles of PTEN and PI(3,4)P2 in cellular physiology.

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Les membres de la famille des 5-phosphatases d’inositols polyphosphates et de phosphoinositides sont des enzymes caractérisées par la présence de deux domaines catalytiques conservés qui hydrolysent un phosphate en position 5 sur un noyau inositol. SKIP (Skeletal Muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase), également appelée Pps (Putative PI 5-phosphatase) est un des derniers membres de la famille des 5-phosphatases à avoir été découvert à ce jour. Cette enzyme hydrolyse majoritairement le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) et le phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3). Les phosphoinositides (PtdIns) représentent environ 10% des lipides membranaires et sont impliqués dans de nombreuses cascades de signalisation cellulaire conduisant, entre autres, à la prolifération, l’apoptose, la différenciation, la sécrétion, le trafic vésiculaire et la mobilité cellulaire.<p>Des études de surexpression de SKIP en cellules tendent à montrer que cette protéine pourrait jouer un rôle de régulateur négatif dans la formation du cytosquelette d’actine et/ou dans la voie de signalisation de l’insuline. <p><p>Afin d’étudier in vivo la fonction de la protéine SKIP chez la souris, nous avons décidé de générer des souris transgéniques surexprimant cette protéine de manière conditionnelle. Dans ce but, nous avons infecté des embryons murins par des lentivirus porteurs d’un transgène SKIP et avons obtenu, après réimplantation des embryons infectés dans des femelles pseudogestantes, deux lignées de souris transgéniques. Celles-ci ont ensuite été croisées avec des souris exprimant la recombinase Cre de manière ubiquitaire afin de pouvoir activer la transcription de SKIP dans l’ensemble des organes. Des expériences de Western blot, de dosage d’activité 5-phosphatase ainsi que des PCR en temps réel sont venus confirmer la présence de la protéine transgénique et de son activité catalytique.<p>L’ensemble des expériences qui ont été menées du point de vue phénotypique tend à montrer que dans notre modèle, la surexpression de SKIP ne provoque aucune anomalie évidente du point de vue anatomique, glycémique ou immunologique. Toutefois, des expériences concernant la physiologie rénale ont été réalisées sur base des résultats d’immunohistochimie et nous ont permis de détecter une anomalie dans les mécanismes de réabsorption d’eau ainsi que dans l’expression et la phosphorylation des canaux hydriques AQP2.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished