Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2005. / Title from first page of PDF file. Includes bibliographical references (p. 167-181).

Thesis (Ph. D.)--University of Texas at Austin, 2007. / Vita. Includes bibliographical references.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:28:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:56:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP / FAPESP:06/58510-0

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:35:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:03:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:33:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:04:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:28:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:56:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Queratinócitos são células bastante atrativas para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica, uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. No presente trabalho, queratinócitos transduzidos mediante um vetor retroviral com o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foram submetidos a um tratamento de aderência ao colágeno e à análise clonal, com o intuito de enriquecer esta população de queratinócitos em células-tronco. O principal resultado foi um aumento da viabilidade celular in vitro dos queratinócitos tratados, que poderá se refletir num aumento da durabilidade da secreção do hormônio in vivo, quando realizado o implante de culturas organotípicas em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). Foi também utilizado um modelo de terapia gênica in vivo, baseado na eletrotransferência de DNA plasmidial (naked DNA), contendo o gene do hormônio de crescimento humano (hGH), no músculo quadríceps de camundongos anões (lit/lit) e anões imunodeficientes (lit/scid). Foram padronizadas as condições de eletroporação em 8 pulsos de 50 V e 20 ms com 0,5 s de intervalo, utilizando um plasmídeo com o promotor da ubiquitina C e a sequência genômica do hGH. A administração de uma dose única de 50 g do plasmídeo pUC-UBI-hGH em camundongos lit/scid, seguida de eletroporação, propiciou pela primeira vez na literatura obtenção de níveis sustentáveis na circulação de 1,5-3,0 ng hGH/ml, durante 60 dias. Esses animais tratados com DNA apresentaram um aumento de peso altamente significativo (P<0,001) de 33,1%, comparado a uma perda de peso, não significativa, no grupo controle (camundongos injetados com salina + eletroporação). Os músculos quadríceps dos animais tratados apresentaram um aumento de 48%, quando comparados aos dos animais do grupo controle (P<0,001). Outro estudo de eletrotransferência foi realizado comparando a utilização da sequência genômica do hGH (gDNA) com a complementar (cDNA), em plasmídeos sob o controle do promotor de citomegalovírus (CMV). Foi observado que o cDNA do hGH foi expresso de maneira mais eficiente na circulação de camundongos lit/scid, por um período de 21 dias. Foram também construídos vetores lentivirais com os genes do hGH (cDNA e gDNA) e do mGH (cDNA), que serão utilizados num próximo estudo, tanto para a transdução de queratinócitos, como para a eletrotransferência in vivo. Vetores lentivirais serão de fato necessários para futuros estudos devido a sua reduzida toxicidade em comparação com os retrovirais. Os resultados deste trabalho, assim como as perspectivas de estudo abertas, têm como meta estabelecer condições para que a terapia gênica seja num futuro próximo uma alternativa viável e segura para o tratamento da deficiência de GH e de outras doenças sistêmicas. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP / FAPESP:06/58510-0

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:35:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:03:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Níveis sustentáveis de hormônio de crescimento humano (hGH) circulante e aumento de peso altamente significativo, avaliados também em comparação a repetidas injeções de hormônio, foram observados em trabalhos anteriores, baseados na eletrotransferência de DNA plasmidial no músculo de camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). No presente trabalho, um modelo animal homólogo de terapia gênica para GH foi estudado mediante clonagem da sequência genômica do DNA de GH de camundongo (mGH-gDNA), a qual substituiu o hGH-gDNA no vetor que havia sido utilizado em camundongos anões imunodeficientes. O novo vetor, agora nomeado UBI-mGH-gDNA, foi utilizado em camundongos anões imunocompetentes (lit/lit). Foi primeiramente realizado um teste in vitro, transfectando-se células humanas HEK 293 com este plasmídeo e obtendo-se uma expressão de 3,0 &mu;g mGH/106 células/dia, contra 3,7 &mu;g mGH/106 células/dia, para o UBI-hGH-gDNA. Estes dois plasmídeos foram então injetados (50 &mu;g/animal) no músculo quadríceps de camundongos, seguido de eletroporação, realizando um ensaio de 94 dias. Enquanto após 15 dias, as inclinações das curvas de variação de peso relacionadas ao mGH, hGH e salina foram 0,130, 0,112 e 0,027 g/camundongo/dia, respectivamente, após 94 dias, as inclinações correspondentes foram 0,041, 0,028 e 0,033 g/camundongo/dia. As análises estatísticas mostraram que após 15 dias, as inclinações das duas curvas com o GH foram significativamente maiores que a inclinação do controle (P<0,001), enquanto que após 94 dias, somente a inclinação da curva do mGH foi maior que a do controle (P<0,005). A porcentagem de aumento de peso nos animais tratados com o gene do mGH, após 94 dias, foi de 34,3%, enquanto que o comprimento nariz-cauda e o comprimento do fêmur, dois parâmetros que medem diretamente o crescimento longitudinal, foram de 9,5% e 26%, respectivamente, quando comparados aos valores iniciais. A interrupção do crescimento progressivo do grupo tratado com hGH não foi inesperada, considerando a óbvia reação imunogênica dos animais imunocompetentes contra o GH humano e não contra o de camundongo (título do anticorpo anti-hGH 1:100 a 1:3200). A inclinação altamente positiva do grupo controle, já observada em camundongos lit/lit mas não em lit/scid, é provavelmente devida ao ganho de peso natural desta linhagem, não suportada, contudo, por um proporcional crescimento longitudinal. Níveis circulatórios de mGH da ordem de 4 ng/mL foram detectados após 15 dias para o grupo tratado com o mGH, enquanto o grupo controle apresentou níveis em torno de 0,7 ng mGH/mL (P<0,001). Níveis circulatórios de mIGF-I foram também determinados nos dias 15, 45 e 94 nos animais tratados com mGH, sempre mostrando valores 1,5 - 3,0 vezes maiores que o grupo controle, e valores 1,2-1,6 vezes maiores que o grupo tratado com hGH. Este modelo de tratamento homólogo pode ser considerado uma primeira abordagem e um importante suporte para futuros ensaios pré-clínicos baseados na administração de DNA plasmidial para o tratamento da deficiência de GH humano. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:33:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:04:36Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Nosso grupo tem estudado uma estratégia alternativa de tratamento para a deficiência de hormônio de crescimento (DGH), utilizando a administração in vivo do plasmídeo pUC-UBI-hGH, seguida de eletroporação, no músculo quadríceps de camundongos anões e imunodeficientes (lit/scid), que proporcionou níveis sustentáveis de hGH na circulação durante 60 dias e um aumento significativo de peso dos animais tratados. Visando investigar os efeitos autócrinos/parácrinos e endócrinos derivados deste tipo de tratamento, e compará-los aos da administração diária por via parenteral do hormônio de crescimento humano recombinante (r-hGH) neste modelo animal, os seguintes parâmetros de crescimento foram avaliados no presente trabalho: peso corpóreo, comprimento total do corpo e da cauda, pesos de órgãos (fígado, rins, coração, baço, músculos quadríceps e gastrocnêmio) e os níveis plasmáticos de mIGF-I (fator de crescimento semelhante à insulina I de camundongo) e de glicose. Em um primeiro experimento, foram observados aumentos altamente significativos (P<0,001) do peso corpóreo e do comprimento total do corpo e da cauda, após 50 dias de tratamento. Todos os órgãos analisados para o grupo tratado, exceto os músculos gastrocnêmios apresentaram aumentos de peso altamente significativos. O quadríceps direito, o que recebeu a injeção do DNA plasmidial, apresentou um aumento de peso de 48,1% em comparação com o controle injetado com salina (P<0,001), enquanto o aumento de peso dos quadríceps esquerdo, não injetados, dos animais tratados foi de 31% (P<0,005). Estes dados sugerem efeitos locais (autócrino e / ou parácrinos) e sistêmicos (endócrinos) resultantes da injeção do plasmídeo contendo o gene do hGH e da consequente expressão e secreção do hGH. Em outro experimento, a comparação da administração única de DNA plasmidial com injeções diárias de r-hGH proporcionou aumentos significativos dos pesos corpóreos, em relação ao grupo controle, de 23,1% (P<0,01) e de 35,5% (P<0,001) para os grupos tratados com DNA e proteína, respectivamente, enquanto as inclinações das curvas de crescimento foram praticamente idênticas: 0,094 g / animal / dia para a injeção de DNA e 0,095 g / animal / dia para a proteína. Entre os dois grupos tratados, não houve diferenças significativas entre o peso dos seguintes órgãos: rins direito e esquerdo, baço e músculo quadríceps direito. Os níveis de glicose no plasma dos grupos tratados e controle não apresentaram diferenças significativas ao final dos tratamentos de 28 e 50 dias. As diferenças das concentrações de mIGF-I entre os grupos tratados foram significativas apenas após 7 dias de tratamento. Os valores foram sempre maiores para o grupo tratado com DNA plasmidial em relação ao grupo do r-hGH, e os níveis de ambos os grupos tratados foram significativamente superiores ao do grupo controle. Apesar da necessidade de outros estudos para confirmar a segurança e a viabilidade deste tratamento, este tipo de terapia gênica para a DGH pode vir a ser uma alternativa viável ao tratamento padrão desta doença, baseado em repetidas injeções de r-hGH altamente purificado. / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Orientador: João Pessoa Araujo Junior / Resumo: A segurança dos alimentos é essencial para o desenvolvimento da sociedade e as doenças transmitidas por alimentos (DTAs) acometem milhares de pessoas todos os anos. Dentre os agentes de DTA, Salmonella se destaca como a principal causa de hospitalizações e mortes. A carne suína é uma importante fonte de nutrientes, sendo a mais consumida no mundo. Vários relatos apontaram o isolamento de Salmonella multidrogas resistentes (MDR) associados com a cadeia produtiva dos suínos, e a ocorrência de elementos que possibilitam a transferência de genes de resistência entre populações bacterianas estão diretamente relacionados a essa característica. O presente trabalho objetivou determinar os genes associados com resistência a antimicrobianos de 9 isolados de Salmonella MDR provenientes de linfonodos mesentéricos de suínos, além de aplicar um protocolo in silico para predizer a localização de cada gene (plasmidial ou cromossomal) e detectar e caracterizar a presença de Integrons de resistência. Diversos genes de resistência para a mesma classe de antimicrobianos foram encontrados em cada cepa, e a localização presumida dos genes foi heterogênica, com exceção para os genes de resistência a sulfonamidas, todos classificados como plasmidiais. Cinco cepas apresentaram integrons classe 1, agrupados em três diferentes perfis. A comparação destes perfis com sequências do GenBank revelou que bactérias de diversas espécies, isoladas em diversos países e proveniente de diferentes fontes, inclusive... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Food safety is essential for society development, and foodborne diseases affect thousands of people every year. Among the main foodborne disease agents, Salmonella stands out as the most associated with hospitalizations and deaths. Pork products are an important source of nutrients for population and the most consumed meat in the world. Several reports reveal the presence of Multidrug Resistant (MDR) Salmonella strains in the pork production chain, and the occurrence of elements that allows transference of resistance genes between bacterial populations is related to this characteristic. The present study aimed to determinate the genetic bases associated with Antimicrobial Resistance (AMR) in nine MDR Salmonella strains isolated from swine mesenteric lymph-nodes, beside applying an in-silico protocol to determinate location of the AMR genes (chromosomal or plasmidial) and characterize resistance integrons. Different resistance genes for the same antimicrobial class were present in each strain, and gene localization was heterogenous, except for sulphonamides resistance genes, where all were classified as plasmidial. Five isolates harbored Class 1 ix integrons, which were classified in three distinct Integron Profiles (IPs). Comparison of IPs with sequences of GenBank database revealed that different species of bacteria, from different countries and isolation sources, including human clinical isolates had the same integrons. The diversity of resistance mechanisms for the same an... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Colistin, also known as polymyxin E, is antibiotics active against most of Gram-negative bacteria. In the pas decade, emergency of multidrug-resistant bacteria led to increase of colistin administration as a last resort antibiotic for human infections. The first plasmid-mediated colistin resistance gene mcr-1 was identified in 2015 in animals in China and after first detection, additional mcr genes: mcr-2, mcr-3, mcr-4, mcr-5, mcr-6, mcr-7 a mcr-8 were described throughout the world. The aim of this thesis was to clarify whether there is horizontal transmission colistin resistance encoded by the mcr genes in gram-negative bacteria isolated from the environment, animals and their breeding and food. The mcr-1 gene was detected in 2 strains Escherichia coli isolated from waste water. The mcr-4 gene was detected in 1 strain Shewanella putrefaciens isolate obtained from the lake. The environment is the most important source and way of spreading this type of resistance in the Czech Republic.