The presence of microglia at sites of CNS injury can potentially shift the balance between neuronal survival and death; however, the mechanisms regulating their mobilization to these sites are still poorly understood. Here I report that microglia express podosomes, short-lived, punctate organelles which adhere to and degrade extracellular matrix (ECM). Podosomes and related invadopodia of cancer cells have recently been the focus of much interest for their roles in migration and invasion. Microglial podosomes degraded ECM, providing impetus for further study of their function in microglia. Further, I report the Ca2+-activated SK3 channel as a novel component of the podosome core. While SK3 and SK4 channels are reported to play redundant roles in activated microglia (Kaushal et al., 2007; Schlichter et al., 2010), immunostaining work suggests that they are differentially regulated during microglial activation. Together, these results suggest unique functions for these channel subtypes in microglia.

The presence of microglia at sites of CNS injury can potentially shift the balance between neuronal survival and death; however, the mechanisms regulating their mobilization to these sites are still poorly understood. Here I report that microglia express podosomes, short-lived, punctate organelles which adhere to and degrade extracellular matrix (ECM). Podosomes and related invadopodia of cancer cells have recently been the focus of much interest for their roles in migration and invasion. Microglial podosomes degraded ECM, providing impetus for further study of their function in microglia. Further, I report the Ca2+-activated SK3 channel as a novel component of the podosome core. While SK3 and SK4 channels are reported to play redundant roles in activated microglia (Kaushal et al., 2007; Schlichter et al., 2010), immunostaining work suggests that they are differentially regulated during microglial activation. Together, these results suggest unique functions for these channel subtypes in microglia.

Le TGFB(bêta) est un facteur clé dans l'homéostasie du réseau vasculaire. Le laboratoire a découvert que le TGFB(bêta) induit des podosomes dans les cellules endothéliales (CE) artérielles in vitro. Ces microdomaines riches en F-actine, sont capables de dégrader localement la matrice extracellulaire. Nous avons mis en évidence des structures de même type dans l’endothélium natif, démontrant la pertinence des observations in vitro. Les CE expriment 2 récepteurs de type I au TGFB(bêta), ALK5 et ALK1, dont les fonctions respectives sur les CE font l’objet de controverses. Nous montrons in vitro, que l’assemblage des podosomes est dépendant de ALK1 et est induit dans un contexte d'activation de la CE. La fibronectine, présente dans la matrice lors de situations d'activation de la CE, est régulée par TGFB(bêta) /ALK1 dans notre modèle et est essentielle à la formation des podosomes. L'ensemble des données obtenues laisse présager un rôle des podosomes endothéliaux dans le remodelage artériel en réponse au TGFB(bêta). / TGFB(beta), a pleiotrop cytokine, acts as an important regulator for the maintenance of vascular homeostasis. Our team has discovered, for the first time, that TGFB(beta) induces podosomes formation in aortic endothelial cells (EC) in vitro. Podosomes are highly dynamic adhesion microdomains formed at the ventral membrane, consisting of a core of F-actin and actin-associated proteins, surrounded by a ring structure which in turn is consisting of plaque proteins as well as signaling proteins. In addition to the presence of specific markers, they are distinguished from other adhesion structures by the presence of metalloproteases, endowing them with the ability to degrade the extracellular matrix locally. We have bringing to light these structures in the endothelium of native arterial vessel exposed to biologically active TGFB(beta), showing relevance of these structures. Endothelial cells express two types I receptors of TGFB(beta), ALK5 and ALK1, which relative function on EC are controversial. We show in our model in vitro, that podosomes formation is ALK1-dependent and are induced when EC are in an active background. Fibronectin, an extracellular matrix component which is present during active situation, is regulated by TGFB(beta)/ALK1 signaling pathway and is essential for podosomes formation. This work open up new avenues to study the role of podosomes in vascular pathophysiology. We propose that podosomes are involved in arterial vessel remodeling.

Microglia, immune cells of the central nervous system, activate in response to pathophysiological stimuli. One of their reactive phenotypes is to migrate to site of injury where they could have either beneficial or detrimental effects. However, little is known regarding the mechanisms underlying microglial migration and how they traverse the unique extracellular environment in brain tissue to reach their destination. Our laboratory first discovered that microglia express structures called podosomes, which can adhere to as well as degrade extracellular matrix. In this study, I further characterize microglial podosomes, and show that they associate with Iba1, Orai1 and calmodulin, proteins not yet observed in podosomes of other cell types. I also present evidence that podosome formation depends on Ca2+ and its entry through store-operated Ca2+ channels. The findings in this thesis contribute to a better understanding of podosome dynamics and their probable roles in microglia migration.

Microglia, immune cells of the central nervous system, activate in response to pathophysiological stimuli. One of their reactive phenotypes is to migrate to site of injury where they could have either beneficial or detrimental effects. However, little is known regarding the mechanisms underlying microglial migration and how they traverse the unique extracellular environment in brain tissue to reach their destination. Our laboratory first discovered that microglia express structures called podosomes, which can adhere to as well as degrade extracellular matrix. In this study, I further characterize microglial podosomes, and show that they associate with Iba1, Orai1 and calmodulin, proteins not yet observed in podosomes of other cell types. I also present evidence that podosome formation depends on Ca2+ and its entry through store-operated Ca2+ channels. The findings in this thesis contribute to a better understanding of podosome dynamics and their probable roles in microglia migration.

Le TGF-β (Transforming growth factor-β) régule de nombreux processus cellulaires et la dérégulation de la signalisation du TGF-β est associée à divers troubles vasculaires. Dans le laboratoire du Dr Génot, le TGF-β a été découvert comme étant le facteur capable d’induire la formation de podosomes organisés en superstructures, appelées rosettes, dans les cellules endothéliales aortiques. Les podosomes sont des structures à base d’actine, formées de façon transitoire, capables de dégrader la matrice extracellulaire (MEC). Dans ce projet, nous avons étudié les récepteurs du TGF-β et les mécanismes moléculaires associés, impliqués dans la formation des podosomes en réponse au TGF-β dans le modèle des cellules endothéliales aortiques bovines primaires (BAEc). Deux types de récepteurs du TGF-β de type I (TβRI), ALK5 et ALK1, régulent les réponses au TGF-β dans les cellules endothéliales, ALK5 étant un récepteur ubiquitaire et ALK1 étant un récepteur dont l’expression est restreinte aux cellules endothéliales. Ces deux récepteurs contrôlent l'activation de protéines Smads distinctes et réagissent à la stimulation par le TGF-β. ALK5 active Smad2/3 et ALK1 active Smad1/5/8. BMP9 est un autre ligand d’ALK1. ALK1 n'active pas Smad2/3 dans les BAEc et BMP9 inhibe la formation des podosomes induite par le TGF-β. La stimulation de Smad1/5/8 par le traitement au TGF-β est induite par la signalisation du complexe ALK1/ALK5. En utilisant une approche à base de siRNA ciblant l’un ou l’autre des TβRI, l’induction des podosomes par le TGF-β est supprimée. Cependant, la transfection des TβRI constitutivement actifs (CA) a montré que l’expression du CA-ALK5 se substitue au TGF-β pour induire des podosomes alors que l'expression du CA-ALK1 est inefficace. Concernant la signalisation en aval des TβRI, l'implication des protéines Smads a également été étudiée dans la régulation du processus. La diminution d’expression de Smad3 abolit complètement la formation des podosomes induite par le TGF-β alors que la déplétion des protéines Smad1 ou Smad5 augmente leur formation. La surexpression des protéines Smad2 ou Smad3, elles aussi, dans une certaine mesure, se substituent aux signaux du TGF-β, alors que la surexpression de Smad1 diminue la formation des podosomes en réponse au TGF-β. Le TGF-β est également capable de moduler la formation d'un autre type de structure d'actine appelée étoiles d’actine. Le nombre de cellules présentant des étoiles d'actine diminue avec le traitement au TGF-β. Cependant, dans les cellules déficientes en Smad3, la formation de ces étoiles d’actine semble être stimulée par le TGF-β. Dans les BAEc, la rigidité ainsi que les protéines de la MEC semblent aussi moduler la formation des podosomes et des étoiles d'actine. Ces travaux démontrent que, bien que le TGF-β stimule à la fois ALK5 et ALK1, la signalisation d’ALK5 induit la formation des podosomes et la signalisation d’ALK1 atténue ce signal. Les voies canoniques, par l’intermédiaire de la régulation des protéines Smads, contribuent à la formation des podosomes induits par le TGF-β dans les BAEc. / Transforming growth factor-β (TGF-β) regulates a wide array of cellular processes and deregulation of TGF-β signalling is associated with various vascular disorders. In the Lab of Dr. Génot it was discovered that TGF-β induces the formation of podosomes organised in superstructures called rosettes, in aortic endothelial cells. Podosomes are transient actin-based structures able to degrade the extracellular matrix (ECM). In this project we have studied TGF-β receptors and associated molecular mechanisms underlying podosome formation in response to TGF-β in primary bovine aortic endothelial cells (BAEc). Two types of TGF-β type I receptors (TβRI), ALK5 and ALK1, regulate TGF-β responses in endothelial cells. ALK5 being an ubiquitous receptor and ALK1 being endothelial cell specific. Both ALK5 and ALK1 receptors control the activation of distinct Smad proteins, and both are responsive to TGF-β stimulation. ALK5 activates Smad 2/3 and ALK1 activates Smad 1/5/8. BMP9 is another ligand for ALK1. ALK1 doesn’t activate Smad2/3 in BAEc and ALK1 inhibits TGFβ-induced podosome formation. Smad1/5/8 stimulation by TGF-β treatment is induced through ALK1/ALK5 complex signalling. Using a knockdown approach, at the TβRI level, TGF-β induction of podosomes was inhibited. However, transfection of constitutively active (CA) TβRI showed that CA-ALK5 expression bypassed the TGF-β requirement for podosome induction whereas CA-ALK1 expression was ineffective. Looking downstream of TβRI signalling, the involvement of Smad proteins was also analysed in terms of podosome formation. Smad3 depletion completely abolished TGFβ-induced podosome formation whereas depletion of Smad1 or Smad5 proteins enhanced the TGFβ-induced podosome response. When overexpressed, Smad2 or Smad3, to some extent, bypassed TGFβ signals, whereas Smad1 overexpression diminished the TGFβ-induced podosome response. TGF-β also modulated the formation of another type of actin structure named actin-stars. The number of cells presenting actin-stars decreased with TGF-β treatment. However, in Smad3 depleted cells the formation of these actin-stars seemed to be stimulated by TGF-β. In BAEc stiffness and ECM proteins also seemed to modulate podosome and actin star formation. This project establishes that although TGF-β stimulates both ALK5 and ALK1, ALK5 signalling triggers podosome formation and ALK1 mitigates this signal. The canonical pathways through Smad protein regulation are important for TGF-β induced podosome in BAEc.

Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées, responsables de la résorption osseuse. Quand ils sont déposés sur un substrat, des structures ponctuelles riches en actine, les podosomes, apparaissent et s'assemblent en clusters, anneaux ou ceinture. Nous avons étudié expérimentalement leur fonction et leur dynamique, depuis une population entière jusqu'à l'échelle d'un unique podosome. Sur une population de cellules, des mesures cinétiques montrent que la surface de la cellule A varie comme A ~ K2, où K est le nombre de noyaux ; ce résultat indique une forme aplatie. Par ailleurs, la mesure de quantités qui prennent en compte l'organisation spatiale de l'actine dans la cellule montre que l'organisation des podosomes ne dépend que du temps écoulé après différentiation, et non de K. Dans un seul ostéoclaste, l'observation d'un fort couplage entre l'étalement d'une cellule et la formation des podosomes nous a conduit a suggérer que les podosomes jouent un rôle important dans la mobilité des ostéoclastes. L'analyse de la migration d'ostéoclastes, ainsi que des forces appliquées sur le substrat, montre que la dynamique interne de l'actine dans la cellule est non seulement corrélée avec la migration cellulaire, mais la gouverne. Enfin, afin de comprendre la dynamique interne d'un podosome, nous avons amélioré le modèle de Biben et al. (2005), en prenant en compte d'une part, la polymérisation de l'actine, et d'autre part, la diffusion et la cinétique d'attachement de la gelsoline, une protéine responsable de la coupe des filaments d'actine. Nous montrons que les podosomes sont principalement gouvernés par la dynamique de l'actine, indépendamment de la concentration en gelsoline.

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L'invasion cellulaire est un processus basé sur la dynamique des invadosomes, qui sont desstructures acto-adhesives capables de dégrader localement la matrice extracellulaire. Lesinvadosomes sont composés d'un coeur riche en actine-F entouré par un assemblage desprotéines d'adhésion conduisant à la dégradation de la matrice extracellulaire par lerecrutement et la sécrétion des protéases. Les cellules MEF exprimantes la formeconstitutivement active de la kinase Src (SrcY527F) forment des invadosomes quis'organisent sous forme d'anneaux ou rosettes. Paxilline et hic-5 (une protéine homologue àla paxilline) ont des rôles spécifiques dans la morphologie cellulaire et la plasticité pendantl'invasion cellulaire. La structure de ces deux protéines se caractérise par la présence dedomaines LIM dans la partie C-terminale et de motifs LD dans la partie N-terminale. Cettesimilarité suggère que ces protéines peuvent avoir des fonctions redondantes. L'importance dela famille des protéines paxillines dans la formation des invadosomes a été examiné en tentantd'induire des invadosomes via l'expression de la forme constitutivement active de la kinaseSrc (SrcY527F) dans des cellules déplétées en paxilline et hic-5 (cellules pax-/- et déplétées enhic-5 par shRNA). La formation des invadosomes a été totalement bloquéequand l'expression de ces deux protéines a été diminuée de manière significativesimultanément indiquant leur redondance fonctionnelle. La ré-expression de nombreuxmutants de la paxilline dans ce contexte cellulaire a permis de montrer que les domaines LIMde paxilline n'étaient pas nécessaires pour la formation de l'anneau des invadosomes. Aucontraire, ces études de structure-fonctions ont permis de mettre en évidence le rôle essentieldes motifs LD3 et LD5 considérablement dans l'assemblage des rosettes. En outre, l'ordreprécis de chaque LD dans la molécule de paxilline est essentiel pour leur travail coopératifdans la régulation des invadosomes. Après avoir montré la redondance fonctionnelle entrepaxillin et hic-5, nous avons voulu déterminer leurs fonctions spécifiques. Pour cela,différents traitements siRNAs nous ont permis de diminuer spécifiquement l'expression depaxillin et/ou hic-5 dans des cellules formant des invadosomes. La déplétion rapide de lapaxilline a réduit la formation des rosettes alors que celle de hic-5 a affecté de manièreimportante la dégradation de la matrice extracellulaire. En effet, l'identification despartenaires spécifiques de paxilline et hic-5 à révélé que cette dernière interagissaitspécifiquement avec IQGAP1. Cette protéine est un facteur essentiel pour le recrutement del'exocyst, un complexe régulant la sécrétion locale de métalloprotéases dans lesinvadosomes. En conclusion, il apparaît que l'action complémentaire de la paxilline et hic-5 aun rôle essentiel dans la régulation des fonctions cellulaires assurées par les invadosomes. / Cellular invasion is based on invadosome dynamics where acto-adhesive machinery iscoupled with extracellular matrix proteolysis. Each invadosome unit is composed by a denseF-actin core surrounded by a ring of adhesion molecules that localizes intense ECMdegradation activity via the recruitment and secretion of lytic enzymes. Invadosomes in MEFstransformed with an activated form of the Src kinase (SrcY527F) auto-assemble into circularmeta-structures called rings or rosettes. Paxillin and the closely related family member hic-5(hydrogen peroxide inducible clone 5) have been recently identified as critical determinants ofcell morphology and plasticity during cell invasion with distinct signaling functions.However, the two proteins have a similar overall domain structure, including amino-terminalLD motifs and carboxyl-terminal LIM domains suggesting overlapping or redundantfunctions. We examined the importance of this class of proteins in invadosome formation, byexpressing SrcY527F in pax-/- cells depleted or not of hic-5. Only when the expression of bothproteins was significantly decreased, invadosome formation was blocked indicating theirfunctional redundancy. Importantly, LIM domain of paxillin was dispensable for ringformation whereas individual depletion of LD3 and LD5 motifs dramatically reducedinvadosome rosette assembly. Furthermore, the precise order of each LD in the paxillin'smolecule was necessary to allow their cooperativity during invadosome formation. Beyondtheir redundancy, their distinct roles in invadosomes were assessed via siRNA strategy aimingat the acute depletion of each molecule. Rapid depletion of paxillin reduced invadosome ringformation whereas hic-5 silencing dramatically affected extracellular matrix degradation. Hic-5 role in ECM degradation was enhanced by the fact that it was found to specifically interactwith IQGAP1, a CDC42- effector that is essential to recruit the exocyst complex ininvadosomes. In summary, the functional redundancy of paxillin and hic-5 suggests anextensive cross-talk between these two closely related proteins in the regulation ofinvadosome-based cellular functions.

La formation de podosomes dans les cellules endothéliales (Ces) aortiques en réponse au TGFβ est bien décrite in vitro (dans des boîtes de culture) et ex vivo (dans des segments de vaisseaux aortiques vivants). Le projet de cette thèse était de franchir l’étape suivante en démontrant la présence de podosomes in vivo en réponse à du TGFβ d’origine endogène. Pour ce faire, nous avons choisi d’utiliser un modèle de souris génétiquement modifiées présentant spontanément des niveaux de TGFβ élevés dans la paroi aortique, raisonnant que cet environnement devrait être propice à l’apparition des structures. La souris Marfan (FbnC1039G/+) constitue le modèle murin de la maladie humaine appelée « syndrome de Marfan ». Chez la souris comme chez l’homme, une mutation dans le gène codant pour la fibrilline-1 conduit à une augmentation des niveaux de TGFβ dans la paroi aortique et dans le sang circulant. Nous avons utilisé ce modèle pour rechercher la présence de podosomes dans l'endothélium aortique. La visualisation « en face » de l'endothélium marqué pour l’actine fibrillaire, la cortactine, la protéine adaptatrice Tks5 et la metalloprotéase MT1-MMP, a révélé des rosettes de podosomes semblables à celles détectées ex vivo en réponse à du TGFβ d’origine exogène. Ces rosettes peuvent être trouvées dans l'endothélium de l'aorte ascendante ou descendante. L’analyse du tissu sous-jacent révèle une détérioration de la lame basale qui apparait parsemée de zones dépourvues d’un de ses constituants majeurs, le collagène IV. Nous émettons l'hypothèse que les rosettes de podosomes sont impliquées dans la formation de ces zones de dégradation du collagène IV. Pour examiner les conséquences du déficit en fibrilline-1 pour les CEs et confirmer les données in vivo concernant la souris Marfan, nous avons utilisé deux approches in vitro. D’abord, nous avons mis au point un protocole pour isoler les CEs aortiques à partir des souris Marfan. Ensuite, nous avons, par la stratégie des siRNA, procédé à la déplétion en fibrilline-1 de CEs aortiques d’origine bovine (BAEc). Les cellules endothéliales aortiques isolées des souris Marfan conservent in vitro le phénotype « TGFβ » et forment podosomes capables de dégrader la matrice extracellulaire sans aucune stimulation exogène. Dans le modèle des cellules BAE, le dosage du TGFβ indique que, in vitro, la déplétion de ces cellules en fibrilline-1 provoque une augmentation de TGFβ biologiquement actif associé à la fraction cellulaire. Ce TGFβ conduit alors à la formation de podosomes dans les CEs. Nous avons observé d’autres conséquences du déficit en fibriline-1 dans l’endothélium in situ. L’analyse topologique de la surface de l’endothélium aortique de la souris Marfan révèle des phénomènes de « blebbing », des filopodes, des anomalies des jonctions cellules-cellules. L’analyse ultrastructurale en microscopie électronique à transmission révèle que l’endothélium de la souris Marfan a une apparence radicalement distincte de celui observé chez les témoins sauvages. La lame élastique, fragilisée par le déficit en fibrilline-1, disparaît comme digérée, par endroits. On observe une sécrétion anormale de matrice extracellulaire. Les cellules présentent un phénotype activé ou des signes d’apoptose. Ces études fournissent la première démonstration de l'apparition de podosomes endothéliaux in vivo et suggèrent leur implication en physiopathologie vasculaire. Elles fournissent également la première démonstration que l’endothelium aortique est profondément modifié dans le modèle murin de la maladie de Marfan. / Podosome formation in aortic endothelial cells exposed to TGFβ has been well described in vitro (in tissue culture dishes) and ex vivo (in living aortic vessel segments). The aim of the project was to go to the next step and demonstrate the occurrence of podosomes in vivo in response to endogenous TGFβ. For this purpose, we chose to use a genetically engineered mouse model, which spontaneously presents high TGFβ levels in the aorta, reasoning that this would be a favorable environment for these structures to appear. Marfan mice represent the murine model of the human disease Marfan syndrome. Similar to the human disease, a mutation in the fibrillin-1 gene (C1039G/+) leads to enhanced TGFβ levels in the aortic wall as well as in circulating blood. We therefore used the Marfan mouse model in search of podosomes in the aortic endothelium. “En face” viewing of the endothelium stained for filamentous actin, cortactin, Tks5 adaptator protein and MT1-MMP metalloprotease detected podosome rosettes with features similar to those detected in the ex vivo situation. Podosome rosettes were found in both descending and ascending aorta. Analysis of the underlying tissue with collagen IV staining revealed a basement membrane scattered with staining-free patches, most likely corresponding to collagen IV degradation. We propose that podosome rosettes are involved in basement membrane degradation in this mouse. To examine the consequences of fibrillin-1 deficiency in endothelial cells and confirm the data obtained in vivo in Marfan mouse aorta, we used two in vitro approaches. First, we set up a protocol to isolate aortic endothelial cells from Marfan aortas, second, we depleted fibrillin-1 from BAE cells by siRNA silencing. Isolated Marfan aortic endothelial cells retained in vitro the TGFβ activated phenotype and formed functional podosomes without any exogenous stimulation. TGFβ levels measurements in fibrillin-1 depleted aortic endothelial cells confirmed that fibrillin-1 deficiency triggers an increase in active, cell associated TGFβ, which in turns, leads to podosome formation in endothelial cells. Finally we studied other alterations caused by the fibrillin-1 defect at the endothelial cell level in situ. Topological analysis of the Marfan mouse aortic endothelium monolayer revealed cell blebbing, numerous filopodia and showed altered cell-cell junctions. At the ultrastructural level, transmission electronic microscopy revealed that the Marfan mouse endothelium had an appearance dramatically distinct from that observed in control littermates. The elastic lamina, weakened by fibrillin-1 deficit, disappeared in some places. The vessel wall also showed abundant extracellular matrix proteins. Endothelial cells presented an activated or apoptotic phenotype. These studies provide the first demonstration for the occurrence of endothelial podosomes in vivo and suggest their involvement in vascular physiopathology. In addition, they provide evidence that the aortic endothelium is profoundly altered in the murine model of Marfan syndrome.