Podosomes are adhesive and invasive structures which may play an important role in numerous physiological and pathological conditions including angiogenesis, atherosclerosis, and cancer metastasis. Recently, the cysteine protease m-calpain (m-Capn) has been shown to cleave cortactin, an integral component of the podosomal F-actin core, as well as various proteins found in the peripheral adhesive region leading to the disassembly of these dynamic structures. In this study, I investigated whether Capn plays a role in the formation of podosomes downstream of c-Src. I show that: 1) phorbol-12, 13-dibutyrate (PDBu) as well as c-Src-Y527F expression induces podosome formation in mouse embryonic fibroblasts; 2) PDBu- and constitutively active c-Src-induced podosome formation is inhibited by the knockout of the m- and µ-Capn small regulatory subunit Capn4 in mouse embryonic fibroblasts (Capn4-/-), but is partially restored by re-expression of Capn4; 3) Capn4 localizes to podosomes; and 4) Inhibition of m- and µ-Capn proteolytic activity by the cell permeable calpain inhibitors has little effect on the formation of podosomes downstream of active c-Src. I conclude that Capn4 may play a role in the assembly phase of podosomes independent of calpain proteolytic activity. Work done in collaboration to determine a possible mechanism of action for the role of Capn4 in podosome assembly indicates that a possible binding partner of Capn4, β-PIX, co-localizes with, and shows in vivo association with Capn4. Furthermore, β-PIX and Capn4 bind directly in vitro in the presence of Ca2+. We conclude that Capn4 plays a role in podosome assembly, and this role may be through direct interaction with β-PIX in a calcium-dependent manner. / Thesis (Master, Biochemistry) -- Queen's University, 2008-09-26 16:16:00.768

À mon arrivée dans le laboratoire, les travaux réalisés indiquaient que le trafic des endosomes de recyclage (ERs) vers le Golgi était régulé par les kinases de la famille Src (KFS) et contribuait au remodelage de l’actine induit par différents stress (E4orf4, staurosporine). Or les KFS coordonnent la dynamique de l’actine et le trafic membranaire, mais les mécanismes impliqués demeurent peu caractérisés. Des évidences récentes indiquaient aussi que le trafic endosomal contribuait à la transformation cellulaire induite par des formes oncogéniques des KFS, laquelle est associée à l’assemblage de structures invasives riches en actine (podosomes). En se basant sur ces données, notre hypothèse de recherche était que le transport des ERs vers le Golgi sous le contrôle du rétromère, un régulateur majeur des voies de transport rétrograde, pourrait contribuer à la formation des podosomes lors de la transformation cellulaire induite par v-Src. Les objectifs du travail présenté dans ce mémoire étaient de caractériser les changements précoces dans le trafic endosomal dépendant du rétromère suivant l’activation de v-Src et d’adresser leur contribution dans la formation des podosomes. Mes travaux ont tiré profit de l’utilisation d’un modèle permettant l’activation rapide d’un mutant thermosensible de v-Src dans des cellules épithéliales MDCK. J’ai ainsi pu observer dans ce modèle une polarisation précoce des ERs autour des podosomes en formation. Une augmentation dans le nombre et la morphologie des endosomes rétromère-dépendants (Vps26) a été mesurée et coïncidait avec un transport accru de cargos dépendants du rétromère vers le Golgi. Notamment, l’inhibition de Rab7, un régulateur du rétromère, interfère avec la formation des endosomes Vps26-positifs et des podosomes. En conclusion, mes résultats suggèrent que v-Src active les voies de transport dépendantes du rétromère pour mobiliser des protéines de signalisation et/ou des lipides bioactifs nécessaires au remodelage polarisé de l’actine et à la formation des structures invasives.

L'ostéoclaste est une cellule spécialisée dans la résorption de la matrice osseuse. Elle présente une organisation différente de l'actine selon les substrats sur lesquels elle est ensemencée. Sur verre ou plastique, l'actine est sous forme de "podosomes", alors que sur un substrat résorbable, elle se ré-organise en une ceinture conttinue, la zone de scellement (SZ). L'étude de cellules déficientes en WIP nous a permis de démontrer qu'un ostéoclaste sur verre forme 2 domaines d'actine distincts: les coeurs de podosomes et le nuage. Ces 2 domaines sont induits par différents récepteurs, CD44 et Beta3, polymérisés par des voies distinctes, et ont pour fonction l'adhérence et la contraction. Ils se ré-organisent en une unique structure, la SZ, quand l'ostéoclaste est transféré sur un substrat résorbable. Nous avons également démontré que le maintien de la ceinture de podosomes dépend d'un réseau de microtubules intact.

In addition to classical adhesion structures like filopodia or focal adhesions, dendritic cells similar to macrophages and osteoclasts assemble highly dynamic F-actin structures called podosomes. They are involved in cellular processes such as extracellular matrix degradation, bone resorption by osteoclasts, and trans-cellular diapedesis of lymphocytes. Besides adhesion and migration, podosomes enable dendritic cells to degrade connective tissue by matrix metalloproteinases. SWAP-70 interacts with RhoGTPases and F-actin and regulates migration of dendritic cells. SWAP-70 deficient osteoclasts are impaired in F-actin-ring formation and bone resorption. In the present study, we demonstrate that SWAP-70 is not required for podosome formation and F-actin turnover in dendritic cells. Furthermore, we found that toll-like receptor 4 ligand induced podosome disassembly and podosome-mediated matrix degradation is not affected by SWAP-70 in dendritic cells. Thus, podosome formation and function in dendritic cells is independent of SWAP-70.

In addition to classical adhesion structures like filopodia or focal adhesions, dendritic cells similar to macrophages and osteoclasts assemble highly dynamic F-actin structures called podosomes. They are involved in cellular processes such as extracellular matrix degradation, bone resorption by osteoclasts, and trans-cellular diapedesis of lymphocytes. Besides adhesion and migration, podosomes enable dendritic cells to degrade connective tissue by matrix metalloproteinases. SWAP-70 interacts with RhoGTPases and F-actin and regulates migration of dendritic cells. SWAP-70 deficient osteoclasts are impaired in F-actin-ring formation and bone resorption. In the present study, we demonstrate that SWAP-70 is not required for podosome formation and F-actin turnover in dendritic cells. Furthermore, we found that toll-like receptor 4 ligand induced podosome disassembly and podosome-mediated matrix degradation is not affected by SWAP-70 in dendritic cells. Thus, podosome formation and function in dendritic cells is independent of SWAP-70.