Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T21:57:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_CelisaCaldana_M.pdf: 3533582 bytes, checksum: 0766aeffae17a09254ca22c48c13f425 (MD5) Previous issue date: 2004 / Mestrado

Orientador: Francisco Javier Medrano Martin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T00:11:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Salmazo_AnitaPaulaTesta_M.pdf: 3523521 bytes, checksum: c953c7f73d24e98bbdce46507535161e (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: o sistema regulador de dois componentes responde a mudanças no meio ambiente, regulando genes envolvidos na adaptação de bactérias. Este sistema, normalmente é formado por duas proteínas, uma proteína sensora que nota a mudança ambiental, e outra proteína reguladora que regula os genes necessários para a resposta adequada. Assim, visando caracterizar as proteínas Xf0389 (reguladora) e Xf0390 (sensora) de Xy/ella fastidiosa, experimentos desde amplificação gênica até purificação protéica foram iniciados. Enquanto o gene Xf0390 foi amplificado e clonado em vetor pGEM-T-Easy, o gene Xf0389 foi inserido em vetor de clonagem e após a confirmação de similaridade do fragmento extraído do vetor com o gene descrito de X. fastidiosa, o fragmento foi subclonado em vetores de expressão (pET28a(+), pET29a(+) e pGEX4T-3). A proteína foi expressa em diferentes linhagens de Escherichia colí, para obtenção da mesma em sua forma solúvel. Através de experimentos de dicroísmo circular, a proteína foi caracterizada como estável e predominantemente rica em a-hélice. Esta última característica da estrutura secundária também foi mostrada pelo modelo construído para a proteína Xf0389, baseado na estrutura tridimensional da proteína "DNA binding response regulator D" (DrrD) de Thermotoga maritima que pertence a subfamília OmpR/PhoB / Abstract: The two-component regulatory system are signal transduction strategies used by bacteria in order to sense the surrounding the environment. This system is composed by two proteins, a transmembranic sensor protein (PhoQ) that interacts with the other one, a response regulator protein (PhoP) that once it has been phosphorilated, it generates a response by regulating the expression of several genes, involved in virulence and adaptation. In Xy/ella fastidiosa this system is formed, at least, by these two genes: Xf0389 (PhoP) and Xf0390 (PhoQ). The Xf0390 was cloned only in pGEM-T-Easy, while the Xf0389 was ais o cloned into the expression vector pET28a(+) and the protein was expressed in E. colí C43 (DE3) strain. Circular dichroism spectra of the purified protein show a high content in alpha-helix. A three-dimensional model of Xf0389 was built and the modeling was based on the protein DNA binding response regulator D (DrrD) from Thermotoga maritima (PDB accession code: 1 kgs). Typically, response regulators have two domains: a N-terminal regulatory domain which is phosphorilated and a C-terminal effector domain which has a DNA binding motif. Based on the sequence of the effector domain, there are three subfamilies: NtrC, NarUFixJ and OmpRlPhpB. Xf0389 has characteristics of the proteins belonging to the OmpRlPhoB subfamily / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Resumo: Herbaspirillum seropedicae SmR1 é uma ?-proteobactéria capaz de colonizar de forma endofítica diversas plantas de interesse comercial, sugerindo o seu uso como um potencial biofertilizante. Este trabalho é apresentado em dois blocos que descrevem a caracterização de proteínas de H. seropedicae SmR1 envolvidas no metabolismo do polímero polihidroxibutirato (PHB) e na regulação pós-transcricional da expressão gênica, com o objetivo de explorar os mecanismos regulatórios destas proteínas do ponto de vista molecular e estrutural. O capítulo 1 descreve a caracterização das proteínas PhbF e PhaP1 envolvidas no metabolismo de PHB. A capacidade de produzir este poliéster alifático é um importante fator associado à sobrevivência no ambiente em condições de estresse e competitividade com outras bactérias. Este polímero é estocado no interior das células na forma de grânulos cobertos por uma camada de várias classes de proteínas que regulam desde a produção/degradação do polímero, passando por seu tamanho e chegando a transcrição. PhbF está relacionada com a regulação transcricional e PhaP1 ou fasina está envolvida na regulação da relação volume/superfície dos grânulos. Estas proteínas foram expressas de forma heteróloga em Escherichia coli e purificadas com sucesso na forma fusionada a uma cauda de histidinas, utilizando o detergente TritonX-100. Experimentos de gel filtração revelaram PhbF como uma proteína tetramérica e PhaP1 como uma proteína pentamérica, ambas em solução. A proteína PhbF foi capaz de ligar-se a onze prováveis regiões promotoras de genes envolvidos com o metabolismo de PHB em H. seropedicae, confirmando a sua atividade de ligação ao DNA. A análise in silico destas regiões promotoras indicou a sequência consenso 5`-TG[N]TGC[N]3GCAA-3` que foi protegida da ação da DNaseI na região promotora de phbF. Esta proteína foi também capaz de ligar-se ao polímero PHB extraído de H. seropedicae assim como PhaP1. A fasina interagiu fortemente com o PHB e foi capaz de aderir a um filme deste polímero onde foram observadas várias estruturas proteicas individualizadas com dimensão lateral média de 177,8 ± 11,7 Å. Esta dimensão é compatível com a distância máxima de 200 Å calculada para PhaP1 em solução pelo método de SAXS. Esta técnica permitiu também acessar o envelope molecular das proteínas PhbF e PhaP1. Aspectos in vivo relacionados à correlação entre o metabolismo de PHB e a transcrição dos genesphbF e phaP1 foram abordados através de fusões transcricionais ao gene lacZ. PhbF foi capaz de reprimir a sua própria expressão e a do gene phaP1 em E. coli sem a interferência do polímero PHB. Em H. seropedicae, foi possível observar o acoplamento entre a expressão dos genes phbF e phaP1 ao metabolismo de PHB assim como a mobilidade da proteína PhbF entre as formas ligada ao DNA e ligada ao grânulo de PHB. O capítulo 2 descreve a caracterização da chaperona de RNA Hfq de H. seropedicae. Esta é uma proteína homohexamérica, identificada em E. coli como um fator do hospedeiro envolvido na replicação do bacteriófago Q? e como um importante regulador pós-transcricional de vários tipos de RNA afetando uma série de funções bacterianas. A estrutura da proteína Hfq foi determinada por cristalografia de raios-X e espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS). A estrutura cristalográfica revelou uma topologia do tipo Sm conservada, composta por uma ?-hélice N-terminal seguida de cinco fitas ?, e uma nova interação intra-subunidades do tipo empilhamento ?-? entre dois resíduos de histidinas ausente em outras Hfqs com estrutura resolvida. Além disso, o envelope molecular calculado com base nos dados de SAXS concordou com a estrutura cristalográfica, sugerindo que a proteína tem a mesma

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. / Made available in DSpace on 2012-10-17T11:28:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-25T19:30:09Z : No. of bitstreams: 1 50708.pdf: 10235909 bytes, checksum: 61d5ef27ac723fac8c79d8c90a237b87 (MD5) / Neste trabalho, estudou-se a transferência reversa de a-quimiotripsina (a-CT) em sistemas de micela reversa com diferentes surfactantes (AOT, lecitina de soja- SbPC, C12E4 e CTAB), para a fase aquosa receptora de NaOH contendo 2,5% de etanol O pH da solução aquosa de a-CT injetada na solução orgânica, influenciou no processo de transferência, em pH 7,7 obteve-se valores mais elevados. A determinação do teor protéico na fase aquosa após a transferência, foi realizada através do método de Lowry. A reação de hidrólise do n-glutaril-L-fenilalanina-p-nitroanilida - GPNA em meio de micela reversa de AOT catalisada pela a-CT obedece a cinética de Michaelis-Menten na faixa de [GPNA] = 0,056 ´ 10-5 - 1,110 ´ 10-5 M. O valor da KM e a Vmáx obtidas foram 6,83 ´ 10-5 M e 3,68 ´ 10-4 s-1, respectivamente. A desidratação da solução de micela reversa de AOT/heptano contendo a-CT, foi realizada através do equilíbrio da fase vapor da solução micelar com LiCl umedecido. A atividade catalítica da a-CT em pH 7,0; 7,7; 8,2 e 9,0, durante o processo de desidratação, diminuiu e aumentou após a re-hidratação do sistema, mostrando que a enzima não foi desnaturada, permanecendo em estado "dormente". Esta propriedade é extremamente importante para a indústria alimentícia e farmacêutica na obtenção de aroma instáveis.

Uma das complicações que levam o paciente terminal de câncer à morte é a imunossupressão. Por sua vez, a superprodução de prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs) no plasma desses indivíduos é um fator de risco para depressão imunológica já que as CP PGs bloqueiam inúmeras interações entre células imunológicas. Estudos de nosso grupo revelaram que células tumorais apresentam alta atividade da ATPase bomba GS X/MRP que exporta conjugados sulfidrila, inclusive CP PG na forma de S-conjugados de glutationa. A glutationa é uma das, ou a mais importante substância para manutenção do estado redox celular. Como o acúmulo de proteínas de choque térmico (HSP) induzidas pelas CP PGs em células imunológicas é indicativo do grau de estresse ao qual cada célula está sendo submetida, neste trabalho, buscamos determinar qual a influência da MRP1/bomba GS-X na presença de estresse celular causado por desbalanço redox e os parâmetros de estresse celular necessários para influenciar a expressão e/ou a atividade da MRP1/bomba GS-X. Nossos resultados sugerem que linfócitos respondem bem a transfecção por eletroporação com o gene da MRP1/bomba GS-X e que a presença desta proteína possa conferir resistência ao tratamento com substâncias eletrofílicas de maneira a ajustar o estado redox celular mais rapidamente, o que impede o efeito citotóxico destas substâncias.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2014-07-09T21:07:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) TESE_SumorilaçãoHedilaçãoProteínas.pdf: 15662809 bytes, checksum: 699ef59a3a98ec94437e42e5889bbaf7 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-07-24T13:03:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) TESE_SumorilaçãoHedilaçãoProteínas.pdf: 15662809 bytes, checksum: 699ef59a3a98ec94437e42e5889bbaf7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-24T13:03:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) TESE_SumorilaçãoHedilaçãoProteínas.pdf: 15662809 bytes, checksum: 699ef59a3a98ec94437e42e5889bbaf7 (MD5) Previous issue date: 2014 / A esquistosomose mansônica é a segunda parasitose mais devastadora segundo a Organização Mundial da Saúde, afligindo mais de 240 milhões de pessoas no mundo. Contudo, apesar do genoma do Schistosoma mansoni ser extensivamente estudado, os mecanismos envolvidos no remodelamento morfológico e adaptação do parasito após instalação no hospedeiro mamífero permanecem desconhecidos. A hipótese deste trabalho é que modificações pós-traducionais dependentes de SUMO e NEDD8 regulam o proteoma de maneira estágio-específica, contribuindo para uma adaptação rápida ao hospedeiro mamífero. Para investigar essa hipótese, inicialmente foi utilizado busca por similaridade, pesquisa de domínio e resíduos conservados, seguido de análises filogenéticas para identificar os genes relacionados com a via de sumorilação e nedilação de proteínas. Nesta etapa, também foram analisados genes do complexo COP9 signalossoma, devido a sua atividade denediladora intrínseca. Os resultados sugerem o envolvimento de 24 genes, sendo 9 com a modificação dependente de SUMO, 7 para a via dependente de NEDD8 e 8 com a montagem do complexo COP9. Em geral, as proteínas preditas apresentam um alto grau de conservação em relação às proteínas ortólogas. Para investigar padrões de expressão gênica diferencial ou estágio-específica nos estágios de cercária, verme adulto e esquistossômulos de 3,5 horas a 7 dias de cultivo in vitro, foi utilizada a técnica de qRT-PCR. Com relação à via de sumorilação, foi verificada uma expressão diferencial das E3 ligases: SmPIAS e SmRanBP2 e das enzimas desumoriladoras: SmSENP1 e SmSENP7. Além disso, a protease SmSENP1 mostrou uma atividade diferencial em verme adulto e em cercária. Já em relação à via de nedilação, foi observada uma correlação positiva entre o perfil de expressão dos constituintes da via de NEDD8 e seus alvos clássicos: culinas 1-5; p53 e p73. Subunidades do complexo COP9 signalossoma também foram avaliadas e mostraram ser mais expressas em cercária do que em verme adulto, o perfil de expressão entre os esquistossômulos foi semelhante. Também foram observadas que ambas as vias de modificação são ativadas em condições de estresse e inibidas na presença de MG132, um inibidor clássico do proteassoma. A continuação desta linha de investigação, utilizando técnicas proteômicas e silenciamento gênico, poderá confirmar a hipótese de que o proteoma de cercária e esquistossômulos jovens são extensivamente modificados por SUMO e NEDD8, sugerindo uma importância dessas vias de modificação para a instalação do parasitismo. __________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Schistosomiasis is the second most devastating parasitic disease according to the World Health Organization, afflicting over 240 million people worldwide. Although the Schistosoma mansoni genome has been extensively studied, the mechanisms involved in morphological remodeling and adaptation of the parasite in the mammalian host remain unknown. Our working hypothesis is that SUMO and NEDD8-dependent post-translational modifications regulate, in a stage - specific manner, the parasite´s proteome, contributing to a rapid adaptation to the mammalian host. To investigate this hypothesis, we initially used, domain and conserved residues similarity searches, followed by phylogenetic analysis to identify genes involved in the SUMOylation and NEDDylation pathways. In this step, the genes related to COP9 signalosome complex were also analyzed, due to their intrinsic deNEDDylating activity. The results suggest the involvement of 24 genes, of which 9 were related to SUMO modification, 7 to NEDD8 pathway and 8 involved in the assembly of the COP9 complex. In general, the predicted proteins showed a high degree of conservation compared to orthologue proteins. To investigate differential gene expression patterns in cercariae, adult worms and in-vitro schistosomula cultured for 3.5 hours and 7 days it was used the qRT-PCR technique. Concerning the SUMOylation pathway, it was observed a differential expression of E3 ligases: SmPIAS and SmRanBP2 and also for deSUMOylating enzymes: SmSENP1 and SmSENP7. Moreover, SmSENP1 protease showed a differential activity in adult worms and cercariae. As for the NEDDylation pathway, a positive correlation was observed comparing the expression profile of the NEDD8 pathway constituents and their classic targets p53 and p73 cullins 1-5. Subunits of the COP9 signalosome complex were also evaluated and showed to be up-regulated in the cercariae compared to adult worms, the expression profiles of such subunits were similar among the cultured schistosomula. It was also observed that both pathways are activated under stress and inhibited in the presence of MG132, a classic proteasome inhibitor. Proteomic techniques and gene silencing may further validate our hypothesis that the cercariae and early-schistosomula proteomes are extensively modified by SUMO and NEDD8, revealing the importance of these pathways for parasite installation and maintenance inside the vertebrate host.

Resumo: A cristalização da lisozima sobre a superfície de grade de cobre revestida com filme fino de carbono bacteriano(GC) para microscopia de transmissão foi analisada por microscopia de força atômica (MFA) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). A lisozima é uma proteína globular, que atua como enzima antibacteriana, hidrolisando uma porção da parede celular de algumas bactérias, sendo assim conhecida como um antibiótico natural. A solução da lisozima foi depositada por diferentes métodos sobre a superfície de GC. Além da deposição da solução de lisozima, foram também utilizadas nano partículas (NP) de ouro como nucleantes. Os cristais formados com e sem NP de Au e em diferentes concentrações, foram analisados por MET e por MFA. As imagens topográficas de MFA não mostram diretamente as NP de Au, devido a irregularidade da superfície da GC, comprometendo o uso do MFA nesta análise. A análise de Espalhamento Dinâmico de Luz (EDL) da solução de lisozima mostra aglomerados com dimensões comparáveis com unidades protéicas, sugerindo que não ocorre cristalização antes da deposição na GC. A análise das imagens de difração de elétrons obtidas por MET sugerem que houve formação de cristais de lisozima com parâmetros de rede a=3,1nm, b= 5,25nm e c= 8,9 nm. O maior número de cristais tanto na forma monocristalina, quanto policristalina ocorreu nos filmes preparados com NP de Au e com baixas concentrações (10 M) de proteína e menores tempo de incubação.

Uma das complicações que levam o paciente terminal de câncer à morte é a imunossupressão. Por sua vez, a superprodução de prostaglandinas ciclopentenônicas (CP-PGs) no plasma desses indivíduos é um fator de risco para depressão imunológica já que as CP PGs bloqueiam inúmeras interações entre células imunológicas. Estudos de nosso grupo revelaram que células tumorais apresentam alta atividade da ATPase bomba GS X/MRP que exporta conjugados sulfidrila, inclusive CP PG na forma de S-conjugados de glutationa. A glutationa é uma das, ou a mais importante substância para manutenção do estado redox celular. Como o acúmulo de proteínas de choque térmico (HSP) induzidas pelas CP PGs em células imunológicas é indicativo do grau de estresse ao qual cada célula está sendo submetida, neste trabalho, buscamos determinar qual a influência da MRP1/bomba GS-X na presença de estresse celular causado por desbalanço redox e os parâmetros de estresse celular necessários para influenciar a expressão e/ou a atividade da MRP1/bomba GS-X. Nossos resultados sugerem que linfócitos respondem bem a transfecção por eletroporação com o gene da MRP1/bomba GS-X e que a presença desta proteína possa conferir resistência ao tratamento com substâncias eletrofílicas de maneira a ajustar o estado redox celular mais rapidamente, o que impede o efeito citotóxico destas substâncias.

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Resumo: Em tripanossomatídeos, a regulação da expressão gênica ocorre principalmente em nível pós-transcricional. A associação entre mRNAs e determinadas proteínas determinam o destino de um mRNA, direcionando-o à tradução, repressão ou degradação. Para caracterizar complexos proteicos associados a mRNAs traduzidos ou não-traduzidos, um trabalho prévio isolou mRNPs de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional utilizando microesferas poli-(T) e os complexos proteicos ligados a mRNAs poli-(A+) foram analisados por espectrometria de massas. Dentre estas proteínas, uma proteína poli-Q com função desconhecida, ortóloga à TbGAP2 em T. brucei, foi identificada, presente nas frações polissomal e pós-polissomal de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional. O objetivo deste estudo é caracterizar esta proteína e determinar se esta está envolvida com a regulação da expressão gênica. O gene codificador desta proteína foi clonado e expresso para produzir anti-soro policlonal. O anti-soro contra a proteína TcGAP2 mostrou especificidade e identificou uma proteína de tamanho esperado em extratos de T. cruzi. TcGAP2 está presente no cinetoplasto e no citoplasma. Além disso, análises por Western blotting mostraram que TcGAP2 está diminuída nas formas metacíclicas, corroborando a marcação de imunofluorescência mais fraca nestas formas. Quando lisados de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional foram aplicados em gradiente de sacarose 15-55% e as frações foram analisados por imunoblotting, a proteína foi detectada em polissomos apenas nas últimas formas. Marcação in situ de nicks e gaps nas redes de minicírculos com a terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) e dUTP fluorescente seguida de imunofluorescência mostrou co-localização parcial indicando certo envolvimento com replicação de minicírculo. Para identificar mRNAs e proteínas associadas a complexos mRNPs contendo TcGAP2, foram realizados ensaios de imunoprecipitação com o soro contra TcGAP2 usando lisados de epimastigotas e epimastigotas sob estresse nutricional. Os RNAs alvo de TcGAP2 foram identificados por sequenciamento de RNA em larga escala e as proteínas, por espectrometria de massas. Os transcritos dos complexos contendo TcGAP2 mudam entre as duas formas, entretanto eles são funcionalmente relacionados, estando enriquecidos em ligação a ATP, fosforilação de proteínas, processo metabólico, dentre outros. Análises utilizando o algoritmo MEME foram realizadas para identificar motivos de sequência comuns dentre os alvos identificados. Nenhum motivo aparente foi encontrado nas regiões 3' não-traduzidas nem nas regiões codificadoras. Entretanto, dois motivos foram encontrados na região 5' nãotraduzida. Assim como os RNAs alvo mudam entre os dois estágios, as proteínas parceiras também. Algumas das proteínas identificadas em epimastigotas como parte dos complexos contendo TcGAP2 incluem proteínas ribossomais e proteínas de ligação a RNA e em epimastigotas sob estresse nutricional, várias proteínas hipotéticas. Já GAP1 foi identificada em ambas formas e, juntamente com GAP2, está envolvida com estabilização de gRNA em T. brucei. O duplo nocaute do gene de TcGAP2 não se mostrou viável sugerindo que este gene seja essencial. Estes dados sugerem que esta proteína pode ter diferentes funções dependendo de sua localização e que TcGAP2 é um componente de complexos ribonucleoprotéicos no citoplasma que podem estar regulando o processamento de mRNAs específicos.