Aeromonas hydrophila es un bacilo gram-negativo, patógeno oportunista de animales y humanos. La patogénesis de A. hydrophila es multifactorial. Con objeto de identificar genes implicados en la virulencia de la cepa PPD134/91 de A. hydrophila, se realizaron experimentos de sustracción génica, que llevaron a la detección de 22 fragmentos de ADN que codificaban 19 putativos factores de virulencia, incluyendo un gen que codificaba una proteína de sistema de secreción de tipo III (T3SS). La creciente importancia del T3SS en la patogénesis de diversas bacterias, llevó a identificar y analizar la agrupación génica del T3SS de las cepas AH-1 y AH-3 de A. hydrophila, así como también el efector AexT en la cepa AH-3. La inactivación de los genes de T3SS aopB y aopD en A. hydrophila AH-1, y ascV en A. hydrophila AH-3 conlleva una disminución de la citotoxicidad, un incremento de la fagocitosis, y una reducción de la virulencia en diferentes modelos animales, demostrando estos resultados que el T3SS es necesario para la patogenicidad del género Aeromonas. El mutante en el gen aexT de la cepa AH-3 de A. hydrophila muestra una ligera reducción de la virulencia, ensayada con diferentes métodos. Por otro lado, la proteína AexT presentó actividad ADP-ribosiltransferasa, y se demostró su translocación vía T3SS al interior de células eucariotas, sistema que a su vez parece ser inducible in vitro en condiciones de depleción de calcio. Mediante el uso de diferentes sondas de ADN, se determinó la presencia del T3SS en cepas tanto clínicas como ambientales de diferentes especies del género Aeromonas: A. hydrophila, A. veronii, y A. caviae, y la codistribución de esta agrupación génica y del gen aexT. Finalmente, con el fin de analizar la activación transcripcional de la agrupación génica de T3SS y del efector AexT en A. hydrophila AH-3, los promotores predichos del operón aopN-aopD y el gen aexT se fusionaron con el gen reporter gfp (Green Fluorescence Protein). Además, se demostró que la expresión de ambos promotores depende de diferentes componentes bacterianos, como por ejemplo el sistema de dos componentes PhoP/PhoQ, el sistema de quórum sensing AhyI/AhyR, el sistema flagelar, el lipopolisacárido, la oxidoreductasa DsbA o el complejo enzimático piruvato deshidrogenasa. / Aeromonas hydrophila is a gram-negative opportunistic pathogen of animals and humans and its pathogenesis is multifactorial. Genomic subtraction was used to identify putative virulence genes in A. hydrophila PPD134/91 and led to the identification of 22 unique DNA fragments encoding 19 putative virulence factors, including a gene encoding a type III secretion system (T3SS) protein. The increasing importance of the T3SS in the pathogenesis of several bacteria, led us to identify and further analyse the T3SS gene clusters in A. hydrophila AH-1 and AH-3. Insertional inactivation of the T3SS genes aopB and aopD in A. hydrophila AH-1 and ascV in A. hydrophila AH-3 led to decreased cytotoxicity, increased phagocytosis, and reduced virulence in several animal models. These results show that the T3SS is required for A. hydrophila pathogenicity. We also cloned and sequenced an ADP-ribosylating toxin (AexT) in A. hydrophila AH-3, and showed that this toxin is translocated via the T3SS, which also seems to be inducible in vitro under calcium depleted conditions. The A. hydrophila AH-3 aexT mutant showed a slight reduction in virulence assayed by several methods. By using several gene probes, we also determined the presence of the T3SS in clinical and environmental strains of different Aeromonas species: A. hydrophila, A. veronii, and A. caviae, and the co-distribution of this gene cluster and the gene encoding the toxin AexT. Finally, to study the transcriptional regulation of the T3SS gene cluster and the effector AexT in A. hydrophila AH-3, we isolated the predicted promoter regions of both operon aopN-aopD and gene aexT, which were fused with a green fluorescence protein reporter gene. Furthermore, we established that expression of the T3SS gene cluster and the effector AexT in A. hydrophila AH-3 depends on the expression of several bacterial components, such as the lipopolysaccharide, the polar flagellum, the two component regulatory system PhoP/PhoQ, the quorum sensing system based on AhyI/AhyR proteins, the pyruvate dehydrogenase complex and the periplasmic oxidoreductase DsbA.

El género Aeromonas está constituido por bacilos Gram negativos y comprende patógenos de animales poiquilotermos y oportunistas en humanos. El lipopolisacárido (LPS) es un importante factor de virulencia de Aeromonas hydrophila, por lo que se planteó hallar los genes implicados en la biosíntesis del núcleo del LPS de la cepa AH-3. Con este fin, se aislaron tres mutantes por inserción del transposón mini-Tn5::Km1 con un fenotipo alterado del núcleo, lo que permitió la caracterización de tres regiones wa genómicas distintas. La construcción de mutantes en los genes en los que fue posible y la elucidación de la estructura química de su núcleo mediante ESI MS y el análisis de metilación de los monosacáridos, permitió, junto con el análisis fenotípico del LPS mediante SDS-PAGE y los datos obtenidos a partir de su secuencia y de ensayos de complementación, asignar funciones a cada uno de ellos. Las regiones 2 y 3 wa, constituidas por 4 y 2 genes, respectivamente, codifican las enzimas para la biosíntesis del núcleo interno. La región 1 wa contiene 7 genes que codifican la epimerasa HldD, la ligasa del antígeno O WaaL y las transferasas para la biosíntesis del núcleo externo y la incorporación de la L,D-HepIV. Además, se estudió la distribución de distintos genes del núcleo y se observó su elevada conservación entre diferentes serotipos de Aeromonas mesófilas.Por otro lado, se realizó el análisis y la caracterización funcional de algunos de los genes de la agrupación wb de la cepa AH-3 responsable de la biosíntesis del antígeno O:34, obtenida en un estudio anterior. Consta de 17 genes entre los que se incluyen genes para la biosíntesis de GDP-manosa y dTDP-6-desoxi-L talosa y para la transferencia de sus monosacáridos, para la modificación del antígeno O con acetilaciones, para el inicio de la síntesis de las subunidades O (wecA), su transporte (wzx) y su polimerización (wzy), y para la determinación de la longitud de la cadena (wzz). La región promotora del gen wzz, localizada en función de la determinación de su inicio de transcripción por 5'RACE, presentaba una regulación por temperatura, de manera que el nivel de transcripción/expresión del gen era menor a 37ºC que a 20ºC, según los ensayos de RT-PCR semicuantitativa y de la actividad β-galactosidasa de la fusión transcripcional de la región promotora con el gen indicador lacZ.Este hecho ofrece una explicación a la diferente producción del LPS que presenta la cepa AH-3 a ambas temperaturas. / The genus Aeromonas is composed of Gram-negative rod-shaped bacteria and comprises opportunistic and primary pathogens of poikilothermic and homeothermic animals, including humans. The lipopolysaccharide (LPS) is an important virulence factor of Aeromonas hydrophila. In order to identify the genes involved in the LPS core biosynthesis a mini-Tn5::Km1 transposon mutagenesis was carried out in strain AH-3 and three different mutants with an altered core phenotype were isolated, which enabled the characterization of three different wa genomic regions. By means of mutant construction in each gene when possible and their LPS core structures elucidation by ESI-MS and monosaccharides methylation analysis, together with LPS phenotypic analysis by SDS-PAGE and data obtained from the sequence analysis and complementation assays, it was possible to assign functions to each gene. Regions 2 and 3 wa, containing 4 and 2 genes, respectively, encode inner core biosynthesis enzymes. Region 1 wa includes 7 genes encoding HldD epimerase, WaaL Oantigen ligase and transferases involved in outer core biosynthesis and L,D-HepIV incorporation. Moreover, the LPS core genes distribution study showed a high conservation between different mesophilic Aeromonas serotypes. Analysis and functional characterization of some of the 17 genes of the AH-3 wb gene cluster responsible for the O:34-antigen biosynthesis, which had been identified in a previous work, was also performed. It contains genes for activated monosaccharides GDP manose and dTDP-6-deoxy-L-talose production and for transfer, for O-antigen acetylation, for the O-unit biosynthesis initiation (wecA), transport (wzx) and polymerization (wzy) and to determine the O-antigen chain length (wzz). The wzz promoter region was localized due to its transcription start site determined by 5'RACE. Semi-quantitative RT-PCR and β-galactosidase fusion assays lead to the conclusion that the wzz gene transcription/expression level was much lower at 37ºC than at 20ºC, which explains the differential O:34-antigen production at both temperatures.

Serratia marcescens és un bacteri gramnegatiu que es comporta com un patogen oportunista i és responsable d'un nombre creixent d'infeccions nosocomials. Les infeccions més comuns causades per aquest bacteri són pneumònies, infeccions del tracte urinari, septicèmies i meningitis.A la membrana externa de la paret dels bacteris gramnegatius s'hi localitzen unes molècules amfifíliques, anomenades lipopolisacàrids, que consten de tres regions principals: el lípid A, que constitueix la part lipídica, i el nucli i l'antigen O, que formen la part polisacarídica, que es projecta cap a l'exterior. Aquesta particular disposició comporta que el LPS sigui l'antigen superficial més important en els bacteris gramnegatius i un dels principals factors de virulència. Per aquest motiu, ens els últims anys s'han estudiat les estructures químiques i les funcions dels LPSs d'un nombre important de bacteris gramnegatius, així com també els responsables genètics de la seva biosíntesi. Aquesta tesi s'ha centrat en l'estudi estructural i genètic del nucli del LPS de S. marcescens N28b O4. Anàlisis químiques i estructurals realitzades sobre l'oligosacàrid majoritari de la regió del nucli del LPS d'un mutant de S. marcescens N28b deficient en antigen O juntament amb anàlisis de complementació ens van permetre proposar la següent estructura química: β-Glc-(1→6)-α-Glc-(1→4)-α-D-GlcN-(1→4)-α-D-GalA-[(2←1)-α-D,D-Hep-(2←1)-α-Hep]-(1→3)-α-L,D-Hep[(7←1)-α-L,D-Hep]-(1→3)-α-L,D-Hep-[(4←1)-β-D-Glc]-(1→5)-Kdo. La configuració D dels residus de β-Glc, α-GlcN, i α-GalA es va deduir a partir de les dades genètiques i per això s'ha de considerar temptativa. Diversos anàlisis comparatius realitzats sobre la regió del nucli del LPS de la soca salvatge i del mutant deficient en antigen O van demostrar que aquesta regió és compartida per ambdós bacteris i per tant l'estructura de nucli proposada és perfectament extrapolable a la de la soca salvatge S. marcescens N28b. A més, per espectrometria de masses de ressonància d'ió ciclotró per transformada de Fourier i ionització per electrosprai (ESI FT-ICR-MS) es van identificar altres oligosacàrids en aquesta regió que probablement contenien substitucions addicionals per residus de D-glicero-D-talo-oct-2-ulosonic (Ko) o d'àcid hexosurònic, que hi eren presents tant a la regió del nucli de la soca salvatge com del mutant deficient en antigen O. D'altra banda la identificació de diferents ions que diferien uns dels altres per masses de +80 Da, suggeriren la presència de substitucions no-estequiomètriques per residus monofosfats.La identificació de l'estructura del nucli del LPS de S. marcescens N28b va permetre poder completar, en la segona part del treball, la caracterització funcional dels gens de l'agrupació waa d'aquesta soca bacteriana, implicada en la biosíntesi del nucli del seu LPS. Estudis previs realitzats sobre aquesta agrupació, constituïda per 14 pautes de lectura oberta, havien permès identificar la funció dels gens compartits amb la resta d'enterobacteris. La caracterització de la resta de gens no compartits es va realitzar a partir d'anàlisis químics i de complementació gènica sobre mutants no polars en aquests gens obtinguts en aquest treball. D'aquesta manera, l'estudi de les estructures de nucli incomplert d'aquests mutants o dels canvis fenotípics que es produïen com a conseqüència de la mutació en comparació amb la soca salvatge van permetre proposar funcions per la resta de gens de l'agrupació waa de S. marcescens N28b. Com a més rellevant, es pot citar la identificació dels gens responsables de la transferència del disacàrid lateral d'heptosa, dels residus d'àcid galacturònic i glucosamina i dels tres residus de glucosa. / Genetic and Structural Study of the Core Region of the Lipopolysaccharide from Serratia marcescens N28b""Serratia marcescens" is a recognised nosocomial gram-negative pathogen that mainly causes pneumonia, septicaemia, meningitis and urinary tract infections. In gram-negative bacteria, the lipopolysaccharide (LPS) is one of the major structural and immunodominant molecules of the outer membrane. It consists of three domains: lipid A, core oligosaccharide and O-antigen. Lipopolysaccharides are important virulence factors in pathogenic strains. Thus, structures and functions of lipopolysaccharides from many gram-negative bacteria as well as the genetic determinants of their biosynthesis have been intensely investigated. This doctoral thesis has focused in the structural and genetic characterisation of the LPS core region of S. marcescens N28b.Chemical and structural analyses of the major oligosaccharide from the LPS core region of an O-antigen-deficient mutant of S. marcescens N28b as well as complementation analyses led to the following proposed structure: β-Glc-(1→6)-α-Glc-(1→4)-α-D-GlcN-(1→4)-α-D-GalA-[(2←1)-α-D,D-Hep-(2←1)-α-Hep]-(1→3)-α-L,D-Hep[(7←1)-α-L,D-Hep]-(1→3)-α-L,D-Hep-[(4←1)-β-D-Glc]-(1→5)-Kdo. The D configuration of the β- Glc, α-GlcN and, α-GalA was deduced from genetic data and thus is tentative. Several comparative chemical analyses demonstrated that the wild strain S. marcescens N28b and the O-antigen-deficient mutant share the same core region and therefore the proposed core structure is completely applicable to that of the wild strain. Furthermore, other oligosaccharides were identified by ion cyclotron resonance-Fourier-transformed electrospray ionisation mass spectrometry, which presumably contained additional residues of D-glycero-D-talo-oct-2-ulosonic acid (Ko) or of hexuronic acid. Several ions were identified that differed from others by a mass of +80 Da, suggesting a nonstoichiometric substitution by a monophosphate residue. The elucidation of the structure shown above, allowed us to complete the functional characterisation of the genes in the S. marcescens N28 waa gene cluster involved in the biosynthesis of its LPS core region. Previous studies had led to the identification of waa genes shared by all known "Enterobacteriaceae". Chemical and/ or complementation analyses of several nonpolar mutants within the S. marcescens gene cluster generated in this work allowed us to propose functions for the remaining waa genes. Among others, genes involved in the transfer of the galacturonic acid, glucosamine and the tree glucose residues of the core region as well as in the transfer of the branched heptose disaccharide were identified.

Los protozoos pertenecientes al género "Perkinsus" son parásitos de numerosas especies de bivalvos y gasterópodos marinos. Los efectos deletéreos de esta parasitosis son dependientes de las condiciones medioambientales, habiéndose constatado que temperaturas y salinidades elevadas aumentan la prevalencia y la intensidad de la infección. El ciclo vital conocido de estos protozoos lo componen trofozoitos, hipnosporas y zoosporas, siendo los trofozoitos el estadio vegetativo que prolifera en el tejido conjuntivo del huésped. El parasitismo de "Perkinsus" induce diferentes respuestas defensivas según el huésped y la especie. Las almejas venéridas "Tapes semidecussatus" y "T. decussatus" desarrollan frente a la infección de "P. atlanticus" una reacción inflamatoria, mediada por hemocitos granulares, que causa la encapsulación de este parásito. Si bien la encapsulación es una estrategia defensiva habitual tanto en moluscos como en otros grupos de invertebrados, la desarrollada por estas almejas contra los trofozoitos de "P. atlanticus" exhibe características singulares. Así, mientras las cápsulas de moluscos suelen estar compuestas por hemocitos, células semejantes a fibroblastos y fibras del tejido conjuntivo, en estas almejas venéridas, los trofozoitos de "P. atlanticus" son encapsulados por un material de naturaleza no fibrilar secretado por los hemocitos infiltrados en la vecindad de los parásitos.El componente mayoritario de la cápsula es un polipéptido (p225) de un peso molecular aproximado de 225 kDa. Los ensayos de deglucosilación revelan que p225 no está glucosilado, dado que ni la incubación con Endo II ni la fi-eliminación alcalina mostraron un efecto detectable en su peso molecular. La imnunolocalización de este polipéptido indica que "p225" es almacenado en los gránulos de los granulocitos infiltrados, siendo secretado y organizado como una cápsula alrededor de los trofozoitos. Asimismo, la ausencia de este polipéptido, demostrado por "Western-blot" e inmunolocalización, en los animales no parasitados, indica que "p225" es un producto de nueva expresión asociado con esta parasitosis.Los hemocitos granulares son las células implicadas en la respuesta inflamatoria que "Tapes" spp. desarrolla contra los trofozoitos de "P. atlanticus", coincidiendo, de este modo, con el principal tipo hemocitario identificado en las cápsulas de moluscos. Sin embargo, los granulocitos que componen esta reacción celular exhiben características diferenciales respecto a los circulantes. Así, mientras los granulocitos circulantes de "T. semidecussatus" muestran gránulos de contenido flocular con un halo lúcido periférico, los granulocitos localizados en las proximidades de los trofozoitos se caracterizan por la presencia de numerosos gránulos de contenido homogéneo con abundantes membranas internas. Estas observaciones estructurales y los resultados obtenidos mediante el suero contra "p225" indican que una vez que los hemocitos granulares han accedido al tejido conjuntivo de los órganos parasitados sufren un proceso de rediferenciación dando lugar a un nuevo tipo celular de carácter secretor. La secreción ocurre en la estricta inmediación de los trofozoitos e implica la muerte de los granulocitos.Aunque tanto la respuesta defensiva elaborada por "T. semidecussatus", como la desarrollada por "T. decussatus" conllevan la encapsulación de los trofozoitos de "P. atlanticus", estas respuestas exhiben características diferenciales. Así, mientras la reacción celular de "T. semidecussatus" está organizada en áreas individualizadas, separadas por elementos del tejido conjuntivo aquélla de "T. decussatus" está compuesta por una única masa hemocitaria, sin fibras ni células de origen conjuntivo. Asimismo, los gránulos de los granulocitos rediferenciados de "T. decussatus" muestran menos membranas internas y, además, sin la típica ordenación en paralelo de "T. semidecussatus". Por último, aunque mediante el suero contra "p225" se observó inmunoreactividad en "T. decussatus" en los mismos compartimentos intra y extracelulares relacionados con la síntesis secreción y depósito de "p225" que lo fueron en "T. Semidecussatus", las estimaciones de la densidad de marca, para cada uno de los compartimentos, señalan una disminución relativa de ésta en "T. decussatus".Por otra parte, los resultados obtenidos tras la inoculación de cuerpos extraños en "T. semidecussatus" demuestran que el parasitismo de "P. atlanticus" induce específicamente la rediferenciación de los granulocitos infiltrados y la subsiguiente expresión de "p225"; ni heridas experimentales, ni la inoculación de material biológico de diferente tamaño, como bacterias, algas o hipnosporas no viables de "P. atlanticus", induce esta reacción celular específica. Así, aunque los hemocitos granulares asociados a las áreas inoculadas exhibieron actividad fagocítica, en ningún punto del experimento se observaron procesos de secreción por parte de estas células. En cualquier caso, estos hemocitos granulares no expresaron "p225", el componente mayoritario de la cápsula secretado por los granulocitos de la reacción celular.Tras la administración de 5'-bromodeoxiuridina, tan sólo un pequeño número de granulocitos de la reacción celular mostraron reactividad. Sin embargo, en el tejido conjuntivo epicárdico se observaron diferencias significativas entre los animales parasitados y aquéllos libres de la infección. Estos resultados evidencian que esta respuesta defensiva, basada en una reacción inflamatoria, es consecuencia del reclutamiento de hemocitos y de su rediferenciación, siendo repuestos los niveles hemocitarios mediante la actividad proliferativa de este tejido especializado. / Protozoa of the genus "Perkinsus" (Apicomplexa. Perkinsea) are major disease agents in marine molluscs and they have been associated with large-scale mortality in bivalves and gastropods worldwide. The life cycle of those protozoa consists of trophozoiles, hipnospores and zoospores, trophozoites being the vegetative stage observed in the connective tissue of the hosts.The venerid clams "Tapes semidecussatus" and "T. decussates" develop an inflammatory response, based on a cellular reaction, against "Perkinsus atlanticus" infection. This reaction involves the infiltration of granule-containing haemocytes. The holocrine secretion by the granulocytes gives rise la the encapsulation of the trophozoites. The main component of the capsule is a polypeptide (p225) of about 225 kDa, which is slightly glycosylated. The immunolocalization of this polypeptide shows that p225 is stored in the granules of the granulocytes, and is secreted, in a polarized way, around the trophozoites, leading lo their encapsulation. Moreover, the absence of this polypeptide in non-parasitized specimens, confirmed by Western-blot and immunolocatization, indicates that p225 is produced "de novo" in response to the parasitosis. On the other hand, ultrastructural observations and the results obtained by means of the serum against p225 indicate that under parasite induction these infiltrated granular haemacytes redifferentiate, giving rise to secretory granulocytes.After 5'-bromodeoxyuridine administration, only a few granulocytes of the cellular reaction were labelled. However, significant differences between parasitized and non-parasitized specimens were observed in the epicardic connective tissue. These results show that this defensive reaction involves the infiltration and redifferentiation of granular haemocytes without cell division, and that haemocyte levels are recovered by means of the proliferative activity of this specialized tissue.

INTRODUCCIÓN: El "Staphylococcus aureus" resistente a meticilina (SARM) es un patógeno de gran importancia para la Salud Pública tanto a nivel hospitalario como en la comunidad. Presenta una rápida diseminación por todo el mundo y crea resistencias a los diferentes antibióticos con gran facilidad. En España se describió por primera vez a finales de 1970 y su frecuencia hasta nuestros días ha seguido un curso ascendente en el que se han producido cambios epidemiológicos y moleculares destacables. Con objeto de conocer la situación actual del SARM en España, se realizó un estudio multicéntrico durante el período de junio de 2003 en el que participaron 64 hospitales españoles pertenecientes a 14 Comunidades Autónomas. OBJETIVOS: Se determinó el porcentaje de resistencia a meticilina en las cepas aisladas durante dicho período, se estudió la sensibilidad a otros antibióticos no beta-lactámicos, así como las propiedades genotípicas de las cepas SARM, la detección de genes de resistencia a macrólidos y finalmente el estudio de la producción de leucocidina de Panton-Valentine en aquellas cepas de adquisición comunitaria y en una selección de cepas de origen nosocomial. METODOLOGÍA: caracterización bioquímica de microorganismos, técnicas microbiológicas convencionales, métodos moleculares de ácidos nucleicos como PCR, Electroforesis en campo pulsátil (ECP), Multilocus sequence typing (MLST), Staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec). Detección de factores de virulencia. RESULTADOS y CONCLUSIONES:- El porcentaje de resistencia a meticilina fue del 20% (similar al obtenido en otros estudios realizados en nuestro país y en Europa).- No se detectaron cepas resistentes a glucopéptidos, aunque un 1,4% de las cepas presentaron heterorresistencia a vancomicina. - El 60% de las cepas resistentes a eritromicina presentaron un fenotipo MLSB codificado por los genes ermA y ermC y el 40% restante presentaron un fenotipo MSB codificado por el gen msrA. - Se identificó un complejo clonal dominante, 73% de las cepas, (ST125::P/Q::mecIV) cuyo ancestro genético podría estar relacionado con el clon epidémico internacional denominado Clon Pediátrico (ST5::mecIV). Estaba presente en todos los hospitales participantes en el estudio.- En menor frecuencia se detectaron otros clones epidémicos, EMRSA-16 (ST36::mecII), 8%, aislado preferentemente en la comunidad Gallega; EMRSA-15 (ST22::mecIV), 2%, aislado en un hospital de Palma de Mallorca; y un solo aislamiento del Clon Ibérico (ST247::mecI) aislado en un hospital de Toledo. - La prevalencia de los aislamientos de SARM de origen comunitario, productores de leucocidina de Panton-Valentine fue baja (3%). Las tres cepas fueron aisladas en dos hospitales en Barcelona y pertenecieron al mismo clon (ST8::BG::mecIV). / "EPIDEMIOLOGY OF RESISTANCE TO METHICILLIN IN STRAINS OF Staphylococcus aureus ISOLATED AT SPANISH HOSPITALS"INTRODUCTION: Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is one of the most relevant health care-associated pathogens. The spread of new antibiotic resistance patterns among methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the detection of the first cases of infection by community-acquired (CA) MRSA, are among the most important features exhibited by MRSA in recent years in Spanish Hospitals.OBJECTIVES: A multicenter study was carried out in Spain during the period of June 2003 to evaluate the percentage of resistance to methicillin, the current levels of antibiotic resistance, the detection of genes of resistance to macrolides, the distribution of clones and the prevalence of strains producing Panton-Valentine Leucocidine and CA-MRSA. METHODS: Biochemical characterization, Molecular typing of MRSA isolates by Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST) and Staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec). Production of Panton-Valentine Leucocidine by PCR.RESULTS AND CONCLUSION:- The percentage of methicillin resistance was to 20%. - There were no glycopeptide resistance, although 1.4% of the isolates showed vancomycin heteroresistance. - Resistance to macrolides of MLSB phenotype was found in 60% of MRSA strains. This was due to the presence of ermA and ermC. In 40% was detected MSB phenotype, these strains carried the genetic determinant msrA, responsible of an active erythromycin efflux. - It was detected a clonal complexe dominant, 73% of the isolates, (ST125::P/Q::mecIV) whose ancestral genetic background would be able to be pertaining to the epidemic international clone named Pediatric clone (ST5::mecIV). He was present at all of the participating hospitals in the study.- More rarely were detected another epidemic clones, EMRSA-16 (ST36::mecII), 8%, isolated preferentially in Galicia; EMRSA-15 (ST22::mecIV), 2%, isolated at Palma's hospital of Mallorca; And only one isolated of the Iberic clone (ST247::mecI) was found among the MRSA studied, isolated at Toledo's hospital.- The prevalence of CA-MRSA was very low in this period (3%). Three strains were isolated at two hospitals in Barcelona and belonged to the same clone (ST8::BG::mecIV ).

El síndrome de replante es consecuencia de una explotación continua y repetida del terreno en el que los problemas de estrés, principalmente de origen patogénico, juegan un papel importante. En los viñedos españoles, el hongo Armillaria mellea que produce la podredumbre blanca de raíz, está considerado como una de sus principales causas. Existen pocas medidas de control disponibles, puesto que no hay portainjertos comerciales que confieran resistencia frente a A. mellea, y la fumigación del suelo está prohibida en los suelos de los viñedos y es probablemente ineficaz. Por este motivo, el control biológico de la podredrumbre blanca es una alternativa a considerar. Entre los grupos de microorganismos del suelo capaces de proteger a las plantas frente a patógenos se encuentran los hongos formadores de micorrizas arbusculares (MA), que forman una simbiosis con la mayoría de las especies de interés agrícola. La importancia de esta simbiosis en la supervivencia y crecimiento de las plantas frente a patógenos de raíz ha sido previamente demostrada pero para avanzar en el estudio de la micorrización como sistema de control, es necesaria la implementación de nuevas técnicas tanto en campo, como en condiciones controladas en invernadero/umbráculo y en condiciones in vitro.Los resultados obtenidos en dos suelos de replante, demuestran que la introducción de inóculo seleccionado puede producir beneficios a corto plazo en las vides. No obstante, es esencial realizar un estudio previo de las condiciones agronómicas antes de decidir la conveniencia de aplicar un inóculo micorrícico, y es igualmente importante adecuar el procedimiento de inoculación a cada situación para conseguir la máxima eficacia.También las combinaciones de microorganismos (hongos antagonistas del género Trichoderma y hongos MA) como sistema de control se plantean como posible alternativa. Los resultados obtenidos en condiciones semicontroladas revelaron que la inoculación temprana de las plantas del portainjerto de vid 110 Richter con el hongo micorrícico Glomus intraradices y Trichoderma harzianum podía ayudar a controlar la podredumbre blanca de raíz en condiciones experimentales, aunque la elección de la cepa y su formulado es importante ya que la efectividad entre ellos puede variar. En experimentos realizados en condiciones controladas, el mayor crecimiento vegetativo y menor avance de los síntomas de A. mellea en las plantas inoculadas con G. intraradices, indicó que las plantas micorrizadas son más tolerantes al patógeno. Las técnicas desarrolladas para el estudio de la respuesta fisiológica de las plantas a la inoculación con G. intraradices y/o con A. mellea mediante el análisis de los cambios en los niveles de hormonas y en los parámetros micromorfométricos demostraron ser adecuadas para la detección temprana de ambas infecciones. Los resultados obtenidos sugieren que tanto las poliaminas como el ácido abscísico podrían estar implicadas en la señalización temprana de los procesos de incremento de tolerancia en las plantas micorrizadas frente al patógeno. Entre los parámetros micromorfométricos, la medida de contracción máxima diaria del sarmiento demostró ser eficaz para la detección temprana de los cambios en el estado hídrico de las plantas en respuesta a la colonización por G. intraradices y a la infección por A. mellea. Por último, la puesta a punto de sistemas experimentales para estudiar la interacción y la evolución de la simbiosis y la infección patogénica in vitro, permitió observar un efecto de bioprotección de la micorriza frente a A. mellea a nivel de la planta, aunque el patógeno indujo un menor desarrollo de G. intraradices en su fase extraradical. Además, la detección de la excreción de enzimas hidrolíticas del A. mellea en medios de cultivos específicos permitió relacionarlas con el proceso de infección del patógeno y el desarrollo de síntomas en las plantas de los sistemas in vitro. / The grapevine replant disease is a consequence of continuous land exploitation and repeated cropping in which stress problems, mainly of pathological origin, play an important role. In Spanish vineyards the root rot fungus Armillaria mellea is considered the principal causal agent of replant disease.Few control measures are available, as there are no commercial grapevine rootstocks conferring resistance against A. mellea, and soil fumigation is banned in vineyard soils. Alternative biological and cultural control methods are under study, and among them, the inoculation of grapevines with arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) could be a good alternative, as they are able to increase the tolerance against soil borne plant pathogens. However, in order to consider the inoculation with AMF as a control system against A. mellea, the symbiosis in grapevines had to be evaluated in the field, in greenhouse / shadowhouse and in vitro.The results obtained in the field indicated that the inoculation with AMF can be beneficial for grapevines in replant soils. Nevertheless, a preliminary study of the agronomic situation is essential before considering the suitability of both AMF application and inoculation procedure. In an experimental microplot set-up, the early inoculation of plants with the mycorrhizal fungus Glomus intraradices and the antagonistic fungus Trichoderma harzianum contributed to control A. mellea, but the choice of the strain and its formulation proved to be important because the effectiveness may vary among them.In the greenhouse, the techniques developed to study the physiological response of plants to inoculation with G. intraradices and/or with A. mellea demonstrated that the analysis of polyamine and abscisic acid levels and of micromorphometric parameters are suitable tools to detect the early response of plants to both microorganisms. The slower development of pathogenic symptoms and the greater biomass in mycorrhizal plants inoculated with A. mellea, indicate that plants inoculated with G. intraradices are more tolerant to the pathogen than non mycorrhizal plants. Finally, an in vitro autotrophic culture system developed for grapevine plants allowed to observe the development of the mycorrhizal symbiosis and of the pathogenic infection, and a bioprotection effect of the mycorrhizal fungus against A. mellea was confirmed.

La producció de mol·luscs bivalves va moure als anys 2001 i 2002 més de 13 milions d'euros només a Catalunya, corresponents a la comercialització de 5 mil tones de marisc per any; en tot l'Estat Espanyol la producció del 2001 fou de més 256 mil tones. La importància econòmica dels mol·luscs bivalves creix paral·lelament al seu consum arreu del món. No obstant, el caràcter filtrador i bioacumulador d'aquest mol·luscs ha comportat que el seu consum sovint s'hagi vist associat a malalties causades per biotoxines i patògens microbians. L'aplicació de normatives dirigides a controlar aquests factors de risc ha contribuït a la disminució dels problemes sanitaris causats per biotoxines i bacteris d'origen. fecal. Tanmateix, els paràmetres establerts no han estat d'utilitat en el cas dels membres del gènere Vibrio, els quals formen part de la microbiota marina, ni del virus humans, ja que els indicadors bacterians clàssics tenen un comportament molt diferent al d'ambdós grups. En el cas dels virus humans, el problema es veu agreujat per les dificultats tècniques que la seva detecció comporta. És per això que diversos autors han proposat els bacteriòfags de bacteris entèrics com a indicadors. D'altra banda, també s'ha proposat la utilització de virus humans, en concret dels adenovirus detectats mitjançant PCR, com a índex molecular de la contaminació vírica d'origen humà. Amb tot, fins al moment la comunitat científica no ha arribat a un consens ni pel que fa a la tria de l'indicador o indicadors més apropiats ni tampoc pel que fa a un mètode de detecció dels patògens vírics en bivalves. Estudis anteriors a la present tesi han avaluat la contaminació vírica en mol·luscs bivalves i la seva relació amb els diferents microorganismes models proposats; no obstant, aquests estudis s'han dut a terme utilitzant una gran varietat de metodologies i centrant-se en zones de producció molt concretes. En el marc de la Unió Europea, mancava un estudi comparatiu de zones de producció situades en zones geogràficament molt diverses i per tant, molt diferents a tots nivells, però que han de complir certes normatives establertes per la Unió Europea. En aquesta tesi, s'ha validat i estandarditzat un mètode de detecció molecular de virus humans en mol·luscs bivalves molt sensible i de fàcil aplicació. També hem desenvolupat una RT-PCR Multiplex per la detecció simultània d'adenovirus, enterovirus i virus de l'hepatitis A, de forma que es redueix el cost econòmic i temporal que la detecció molecular clàssica comporta. D'altra banda, durant 18 mesos s'ha estudiat de forma simultània la distribució de virus humans en mol·luscs bivalves i de diferents microorganismes proposats com a indicadors en diferents àrees de producció d'Espanya, Grècia, Regne Unit i Suècia. Durant aquest estudi he aïllat dos dels virus de major importància en l'etiologia de malalties associades al consum de marisc, virus de l'hepatitis A i norovirus, en mol·luscs bivalves destinats al consum humà i procedents de zones de producció d'Espanya, Grècia i Regne Unit. Els adenovirus humans són els virus més prevalents en totes les àrees estudiades i presentaren una relació estadísticament significativa amb la resta de virus humans estudiats, fets que aconsellen la seva utilització com a índex molecular de contaminació vírica d'origen humà. Pel que fa als bacteriòfags de bacteris entèrics que també han estat proposats com a microorgaismes model, les anàlisis mostraren que els fags F-específics d'ARN són l'únic grup de fags que presenta una relació estadísticament significativa amb tots els virus humans, tot i això, la capacitat predicitiva dels fags F-ARN és més forta amb els norovirus i en zones amb nivells d'Escherichia coli més elevats, de fet, serien útils com a model de norovirus al Regne Unit.

El género "Aeromonas" pertenece a la familia "Vibrionaceas". Dentro de este généro podemos diferenciar dos grupos: un primer grupo formado por microorganismos psicrófilos no mótiles en el que únicamente hallamos la especie "Aeromonas salmonicida" y un segundo grupo formado por microorganismos mesófilos mótiles en el que hallamos las especies "Aeromonas hydrophila", "Aeromonas sobria" y "Aeromonas caviae". Las cepas de "Aeromonas" mesófilas mótiles son microorganismos que se caracterizan por su elevada diversidad en cuanto al grado de virulencia. Estas diferencias se hallan estrechamente relacionadas con las estructuras moleculares presentes a nivel de la superficie bacteriana. La incidencia y variabilidad de este grupo hizo que obtuviesen a partir de muestras de agua diferentes bacteriófagos específicos para las estructuras superficiales bacterianas, los cuales pudiesen emplearse como marcadores biológicos que permitiesen diferenciar a un serotipo de los restantes dentro del grupo de "Aeromonas" mótiles. De este modo, se aislaron los bacteriófagos PM1, PM2 y PM3.El bacteriófago PM1 presenta doble cadena de DNA, capside poliédrica y una placa con fibras en la cola. Además, posee como receptor el antígeno O del lipopolisacárido (LPS) de las cepas de serotipo 0:34 y, en consecuencia, los mutantes espontáneos resistentes al citado bacteriófago carecen de antígeno 0 del LPS, aunque presentan sensibilidad a bacteriófagos de "Aeromonas" cuyo receptor es el núcleo del LPS. El bacteriófago PM2 presenta doble cadena de DNA, cápside poliédrica y una placa basal con espinas. Además, posee como receptor el núcleo del LPS de diferentes cepas de serotipo 0:34 y 0:11 (así como "A. salmonicida"); en consecuencia, los mutantes resistentes al mismo presentan alteraciones en los oligosacáridos del núcleo del LPS, careciendo en todos los casos de antígeno 0 del LPS. El bacteriófago PM3 presenta doble cadena de DNA y posee como receptor el flagelo monopolar de diferentes serotipos de "A. hydrophila" tanto con lámina S como sin lámina. Los mutantes resistentes a este bacteriófago presentan alteraciones en el flagelo o en la motilidad de dichas cepas bacterianas. Estos bacteriófagos han permitido la agrupación de diferentes cepas de "Aeromonas" mesófilas que luego han correspondido a serotipos distintos. Así, las cepas sensibles al bacteriófago PM1 pertenecen al serogrupo 0:34 y presentan las siguientes características:1.- Un perfil de proteínas de membrana externa tremendamente homogéneo.2.- Un LPS heterogéneo, químicamente formado por KDO, L-heptosas, glucosa y hesoxaminas, y carente en D-heptosas, galactosa, rhamnosa y pentosas.3.- Una DL(50) a 20ºC menos elevada que a 37°C, tanto en ratón como en pez, lo cual indica que son más virulentas a 20ºC que a 37°C. Este hecho se debe a la producción de antígeno 0 del LPS a 20ºC y a la práctica ausencia del mismo a 37°C. Todo ello implica al antigeno 0 del LPS en la virulencia de estas cepas.Uno de los serotipos más importantes dentro de las "Aeromonas" mesófilas a causa de su elevado grado de virulencia es el denominado serotipo 0:11. Este serotipo presenta:1. Un LPS homogéneo, formado químicamente por KDO y L-heptosas en el núcleo del LPS y glucosa, galactosa, mañosa y hexosaminas en el antígeno 0 del LPS. 2. Una lámina proteínica de estructura tetragonal, denominada lámina S, que recubre prácticamente la superficie celular haciendo que el LPS quede totalmente recubierto. Esta poca accesibilidad del antígeno 0 del LPS hace difícil encontrar marcadores biológicos (bacteriófagos) para este serotipo. 3. Todas las cepas de serotipo 0: 11 al igual que las de "A. salmonicida" poseen la propiedad de autoaglutinar. Dicha propiedad está ligada fundamentalmente a la presencia de lámina S y de flagelo.4. La DL(50) de este serotipo es dos logaritmos inferior a la existente en las cepas de serotipo 0:34 y además es muy similar en todos los mutantes isogénicos obtenidos para las diferentes estructuras superficiales. Una vez estudiados los serotipos 0:34 y 0:11 de las "Aeromonas" mesófilas se obtuvieron mutantes isogénicos, bien por resistencia a bacteriófagos específicos para las diferentes estructuras superficiales o bien mediante mutagénesis con un agente alquilante y contraselección con anticuerpos especificos frente a 1as estructuras superficiales a alterar.Con el uso de los citados mutantes se determinó que la vía clásica del complemento es la responsable en las "Aeromonas" pertenecientes al serotipo 0:34 y 0:11 de la activación del complemento y por consiguiente, de la actividad bactericida del suero. Además, se obeservó que la lámina S peresente en las cepas de serotipo 0:11 no activaba la acción del complemento (a diferencia de la lámina A de "A. salmonicida"), sino que el determinante a nivel de las estructuras superficiales de la resistencia a la actividad bactericida del suero en ambos serotipos son los oligosacáridos del núcleo del LPS. Finalmente se demostró que el LPS de todas las "Aeromonas" mesófilas es capaz de activar el complemento, y la razón de ser sensible o resistente a la actividad bactericida del suero se debe a la fijación o no de C3b pegado a la membrana y la consiguiente formación de los complejos C5b-9. / The motile "Aeromonas" group is characterized by their high diversity degree of virulence. These differences are related with molecular structures located on the bacterial surface.Several bacteriophages of motile "Aeromonas" were isolated and characterized from water samples. Thus, it was obtained bacteriophages whose receptors are: the 0 antigen lipopolisaccharide (LPS) of 0:34 serotype strains, the core LPS of 0:34 and 0:11 serotype strains (as soon as "Aeromonas salmonicida" and the monopolar flagellum of motile "Aeromonas".Then, motile "Aeromnas" 0:34 and 0:11 isogenic mutants were obtained by resistance to the specific bacteriophages for different structures, or by mutagenesis with an alquilant agent and contraselection with specific antibodies.Using the different isogenic mutants it was possible to determinate: a) the complement activation pathway in the 0:34 and 0:11 serotypes motile "Aeromonas" is the classical pathway, b) the S-layer present on the 0:11 serotype strains not activate the complement action; but, in contrast, the A-layer present on the "Aeromonas salmonicida" strains active this action, c) the complement activation determinant at the structural bacterial surface are the core LPS oligosaccharides, and d) the LPS present at all motile "Aeromonas" strains activate the classical complement pathway; and the sensibility or resistance from the bactericidal action was due to the presence or absence of C3b linked on the membranes and the subsequence formation of C5b-9 complexes.

La utilització de composts com substrats de cultiu i/o l'ús d'agents de control biològic són una alternativa als mitjans de control de fitopatògens mitjançant fitosanitaris químics. Aquesta tesi consta de 4 capítols. En el Capítol I es va estudiar la capacitat de 5 composts procedents de residus municipals i agrícoles de suprimir la malaltia produïda pel patogen foliar Botrytis cinerea en plantes de cogombre. Els cinc composts van ser capaços de reduir la incidència i severitat de la malaltia en comparació amb els substrats de cultiu estàndard (2 torbes comercials). La reducció de la malaltia es va associar al subministrament de Ca, Mo i Si per part dels composts, a cert grau d'estrès salí produït en la planta, així com a l'alta activitat microbiològica dels composts. En el Capítol II es descriu el desenvolupament d'un mètode basat en la cromatografia líquida acoblada a detecció per espectrometria de masses en tàndem per a la quantificació simultània de les hormones àcid salicílic i àcid jasmònic en extractes vegetals. El mètode es va aplicar per a estudiar l'efecte de la colonització de l'arrel de plantes de cogombre per part de l'agent de control biològic Trichoderma asperellum T34 o la infecció per part del patogen Rhizoctonia solani. No es va observar cap efecte de T34 aplicat a l'arrel a 105 ufc/ml sobre els nivells d'aquestes hormones. R. Solani, va produir l'increment de les dues hormones, tant en arrel com en cotilèdon. En el Capítol III es va estudiar l'efecte de T34 aplicat a l'arrel de la planta de cogombre a 105, 106 i 107 ufc/ml sobre l'activitat peroxidasa, els nivells d'àcid salicílic i jasmònic i el proteoma dels cotilèdons en les primeres hores de la interacció. T34 activa l'activitat peroxidasa i eleva els nivells de les hormones estudiades de forma depenent a la concentració. A 105 no s'observen efectes. T34 aplicat a l'arrel a 107 ufc/ml és capaç de produir canvis el proteoma dels cotilèdons afectant l'expressió de proteïnes relacionades amb la defensa contra patògens. Aquest mateix tractament és capaç d'induir en la planta resistència sistèmica contra el patogen foliar Pseudomonas syringae pv. lachrymans. En el Capítol IV es va comprovar la capacitat de T34 aplicat a 105 ufc/ml per a induir resistència sistémica en Arabidopsis enfront dels patògens foliars Pseudomonas syringae pv. tomato, Hyaloperonospora parasitica i Plectosphaerella cucumerina. Aquesta resistència sistèmica és semblant a la induced systemic resistance (ISR) produïda per rizobacteris no patogènics. L'ús d'Arabidopsis mutants va permetre establir que la ISR induïda per T34 és independent d'àcid salicílic i depenent de NPR1 i MYB72. A més, la ISR induïda per T34 es basa en el priming ja que precondiciona a les plantes a expressar el gen LOX2 i el bloqueig d'espores de patògens mitjançant cal·losa de forma mes ràpida i intensa quan posteriorment responen a un atac. / This thesis consists in 4 chapters. In Chapter I we checked the ability of 5 composts from municipal an agricultural wastes to suppress disease produced by the foliar pathogen Botrytis cinerea in cucumber plants. The 5 studied composts were able to reduce disease incidence and disease severity compared to standard growth media (2 commercial peats). The reduction in disease was related to the supply of Ca, Mo and Si to the plants, a certain degree of salt stress and the high microbial activity of the composts. In Chapter II we describe a method based in liquid chromatography coupled to mass spectrometry to simultaneously quantify salicylic and jasmonic acids in crude plant extracts. No effect on the hormones was found when the biological control agent Trichoderma asperellum T34 was applied to the roots at 105 cfu/ml. Rhizoctonia solani infection increased both hormones in both cotyledons and roots. In Chapter III we studied the effect of T34 applied to the roots at 105, 106 and 107 cfu/ml on peroxidase activity, salicylic and jasmonic acids levels and proteome of cucumber cotyledons during the early hours after the interaction. T34 affects peroxidase activity and hormone levels depending on the concentration. No effects at 105. T34 applied to the roots at 107 cfu/ml is able to produce changes to the proteome affecting the expression of defense related proteins. This treatment is also able to induce systemic resistance against the foliar pathogen Pseudomonas syringae pv. lachrymans. In Chapter IV we checked the ability of T34 applied at 105 cfu/ml to induce systemic resistance in Arabidopsis against the foliar pathogens Pseudomonas syringae pv. tomato, Hyaloperonospora parasitica and Plectosphaerella cucumerina. This systemic resistance is similar to induced systemic resistance (ISR) triggered by non pathogenic rhizobacteria. The use of Arabidopsis mutants allowed us to establish that ISR induced by T34 is salicylic acid independent but is dependent on NPR1 and MYB72. In addition ISR triggered by T34 is based on priming as it primes plants for enhanced LOX2 gene expression as well as callose deposition when plants face an stress.

El consum de fruites fresques tallades i sucs de fruites no pasteuritzats s'haincrementat significativament en els darrers anys degut a la creixent demanda deproductes sans de baix contingut calòric i característiques similars a les del productefresc. Tot i això, aquests productes poden contaminar-se amb microorganismespatògens o deterioratius per una inadequada manipulació o emmagatzematge, donantlloc a riscs de malalties microbianes i deteriorament del producte. De fet, el nombrede brots i casos de malalties causades pel consum d'aquests productes ha augmentatnotablement, motiu pel qual l'ús de composts naturals que garanteixin la seguretat iqualitat de les fruites fresques tallades i sucs de fruites no pasteuritzats haaugmentat. L'objectiu principal d'aquesta recerca ha estat avaluar l'efectivitat dediferents antimicrobians per a controlar microorganismes patògens tals com Listeriamonocytogenes, Salmonella Enteritidis i Escherichia coli O157:H7 i allargar la vidaútil de fruites fresques tallades. Inicialment les concentracions mínimes inhibitòries(CMI) i bactericides (CMB) d'àcid màlic i diferents olis essencials (EOs) i els seuscompostos actius van ser determinats en sucs de poma, pera i meló. Desprésaquestes substàncies han estat aplicades en combinació amb compostsestabilitzadors de la qualitat directament per immersió o indirectament a través derecobriments comestibles a base d'alginat a pomes, peres i melons frescs tallats per agarantir la seva seguretat i qualitat. Els sucs de poma, pera i meló van ser inhibitorisper a L. monocytogenes, S. Enteritidis i E. coli O157:H7 a 5ºC, no obstant a 20 i35ºC concentracions mínimes d'àcid màlic de 0,2% per a L. monocytogenes i S.Enteritidis i 0,4% per a E. coli O157:H7 van ser requerides per a inhibir els seuscreixements en suc de meló. En general, concentracions d'àcid màlic de 2% en sucsde poma i pera i de 2,5% en suc de meló van ser requerits per a reduir les poblacionsde L. monocytogenes, S. Enteritidis i E. coli O157:H7 en més de 5 cicles log a 5ºC,mentre a 20 i 35ºC concentracions més baixes van ser suficients per a aconseguiraquest efecte. D'altra banda, els olis essencials de canyella, clan, herba de llimona ipalmarosa així com també els seus compostos actius van mostrar activitatantimicrobiana sobre els microorganismes patogènics però en diferents graus. Aixíl'efectivitat d'aquestes substàncies va dependre del tipus de microorganismes, tipusde suc i concentració de la substància. Una combinació d'àcid màlic al 2,5%, Nacetil-L-cisteina a l'1% glutatione a l'1% i lactat de calci a l'1% aplicada perimmersió va reduir les poblacions de L. monocytogenes i S. Enteritidis inoculades enpomes i peres fresques tallades en més de 5 cicles log el mateix dia de la preparacióde les mostres (t = 0 dies), mentre que la població de E. coli O157:H7 va mostraruna major àcid-resistència, aconseguint aquesta reducció a partir dels 3 i 14 dies enaquestes fruites respectivament. A més a més, aquesta combinació de substàncies vaoriginar una disminució en la tasa de creixement i una prolongació de la fase lag deles poblacions d'aerobis mesòfils, psicròfils i floridures i llevadures, allargant lavida útil des d'un punt de vista microbiològic fins a 23 dies en peces de poma i permés de 30 dies en peces de pera. Així mateix, un menor consum d'O2 i una menorproducció de CO2, etilé i etanol, com també un millor manteniment de la textura i elcolor foren aconseguits amb l'ús d'aquesta combinació de substàncies, aconseguintaixí un allargament de la vida útil fisicoquímica. D'altra banda, la incorporaciód'àcid màlic junt amb composts estabilitzadors de la qualitat en recobrimentcomestibles a base d'alginat va ser efectiva per a reduir les poblacions d'E. coliO157:H7 i S. Enteritidis inoculades en peces de poma i meló així com també per ainhibir el creixement de la flora nativa, tot i això un major efecte sobre aquellsmicroorganismes es va aconseguir quan ambdós àcids màlic i EOs o els seusprincipals composts actius van ser incorporats en els recobriments, mostrant ser l'oliessencial d'herba de llimona la substància antimicrobiana més efectiva. Aquestefecte antimicrobià fou a més a més potenciat amb l'augment de les concentracionsd'EOs. Una extensió de la vida útil microbiològica de peces de poma i meló foutambé aconseguida amb la incorporació d'aquestes substàncies, no obstant algunescaracterístiques fisicoquímiques i sensorials de les fruites com textura, color, olor igust van ser afectades. Els resultats demostraven que l'ús d'antimicrobians naturalsper immersió o a través de la seva incorporació en recobriments comestibles a based'alginat és una bona alternativa per a garantir la seguretat i qualitat de fruitesfresques tallades. / El consumo de frutas frescas cortadas y zumos de frutas no pasteurizadosha incrementado significativamente en los últimos años debido a la crecientedemanda de productos sanos con bajo contenido calórico y características similaresa las del producto fresco. No obstante, estos productos pueden contaminarse conmicroorganismos patógenos o deteriorativos por una inapropiada manipulación oalmacenamiento, dando lugar a riesgos de enfermedades microbianas y deterioro delproducto. De hecho, el número de brotes y casos de enfermedades causadas porconsumo de esos productos ha aumentado notablemente, razón por la cual el uso decompuestos naturales que garanticen la inocuidad y calidad de las frutas frescascortadas y zumos de frutas no pasteurizados ha aumentado. El objetivo principal deesta investigación fue evaluar la efectividad de diferentes antimicrobianos paracontrolar microorganismos patógenos tales como Listeria monocytogenes,Salmonella Enteritidis y Escherichia coli O157:H7 y extender la vida útil de frutasfrescas cortadas. Primeramente se determinaron las concentraciones mínimasinhibitorias (CMI) y bactericidas (CMB) de ácido málico y diferentes aceitesesenciales (EOs) y sus compuestos activos en zumos de manzana, pera y melón.Después, esas sustancias fueron aplicadas en combinación con compuestosestabilizadores de la calidad directamente por inmersión o indirectamente a través derecubrimientos comestibles a base de alginato a manzanas, peras y melones frescoscortados para garantizar su inocuidad y calidad. Los zumos de manzana, pera ymelón fueron inhibitorios para L. monocytogenes, S. Enteritidis y E. coli O157:H7 a5ºC, sin embargo a 20 y 35ºC, se necesitaron concentraciones mínimas de ácidomálico de 0,2% para L. monocytogenes y S. Enteritidis y 0,4% para E. coli O157:H7para inhibir su crecimiento en zumo de melón. En general, concentraciones de ácidomálico de 2% en zumos de manzana y pera y 2,5% en zumo de melón fueronrequeridas para reducir las poblaciones de L. monocytogenes, S. Enteritidis y E. coliO157:H7 en más de 5 ciclos log a 5ºC, mientras a 20 y 35ºC concentraciones másbajas fueron suficientes para alcanzar ese efecto. Por otra parte, los aceitesesenciales de canela, clavo, hierba de limón y palmarosa así como también suscompuestos activos mostraron actividad antimicrobiana sobre los microorganismospatogénicos pero en diferentes grados. Así la efectividad de esas sustancias dependiódel tipo de microorganismo, tipo de zumo y concentración de la sustancia. Unacombinación de ácido málico al 2,5%, N-acetíl-L-cisteína al 1% glutatione al 1% ylactato de calcio al 1% aplicada por inmersión redujo las poblaciones de L.monocytogenes y S. Enteritidis inoculadas en manzanas y peras frescas cortadas enmás de 5 ciclos log el mismo día de la preparación de las muestras (t = 0 días),mientras que la población de E. coli O157:H7 mostró una mayor ácido-resistencia,alcanzando esa reducción a partir de los 3 y 14 días en esas frutas respectivamente.Además esa combinación de sustancias causó una disminución en la tasa decrecimiento y una prolongación de la fase lag de las poblaciones de aerobiosmesófilos, psicrófilos y mohos y levaduras, extendiendo la vida útil desde un puntode vista microbiológico hasta 23 días en piezas de manzanas y por más de 30 días enpiezas de peras. Así mismo, un menor consumo de O2 y una menor producción deCO2, etileno y etanol, así como también un mejor mantenimiento de la textura y elcolor fueron logradas con el uso de esa combinación de sustancias, alcanzándose asíuna extensión de la vida útil fisicoquímica. Por otra parte la incorporación de ácidomálico junto con compuestos estabilizadores de la calidad en recubrimientoscomestibles a base de alginato fue efectiva para reducir las poblaciones de E. coliO157:H7 y S. Enteritidis inoculadas en piezas de manzana y melón así comotambién para inhibir el crecimiento de la flora nativa, sin embargo un mayor efectosobre esos microorganismos fue logrado cuando ambos ácido málico y EOs o susprincipales compuestos activos fueron incorporados en los recubrimientos,mostrando ser el aceite esencial de hierba de limón la sustancia antimicrobiana másefectiva. Este efecto antimicrobiano fue además potenciado con el aumento de lasconcentraciones de EOs. Una extensión de la vida útil microbiológica de piezas demanzana y melón también fue alcanzada con la incorporación de estas sustancias,sin embargo algunas características fisicoquímicas y sensoriales de las frutas comotextura, color, olor y sabor fueron afectadas. Los resultados demostraron que el usode antimicrobianos naturales por inmersión o a través de su incorporación enrecubrimientos comestibles a base de alginato es una buena alternativa paragarantizar la inocuidad y calidad de frutas frescas cortadas. / The consumption of fresh-cut fruits and unpasteurized juices hassubstantially risen over the last years mostly due to the increasing demand of healthyfood with low caloric contents and fresh-like characteristics. Nonetheless, thoseproducts can contaminate with pathogenic and deteriorative microorganisms as aconsequence of inappropriate manipulation and storage conditions, resulting in risksof microbial diseases and spoilage of the product. In fact, the number of outbreaksand cases of illness caused by consumption of fresh-cut fruits and unpasteurizedjuices has notably increased reason by which, the use of natural compounds thatassure the safety and quality of fresh-cut fruits and unpasteurized fruit juices hasincreased. To evaluate the effectiveness of different antimicrobials to controlpathogenic microorganisms such as Listeria monocytogenes, Salmonella Enteritidisand Escherichia coli O157:H7 and extend the shelf-life of fresh-cut fruits was themain objective of this research. Minimal inhibitory (MIC) and bactericidalconcentrations (MBC) of malic acid and essential oils (EOs) and their activecompounds against those pathogens were firstly determined in apple, pear andmelon juices. Then, those substances were applied in combination with qualitystabilizing compounds directly by dipping treatments or indirectly through thealginate-based edible coatings to fresh-cut apple, pear and melon to assure theirsafety and quality. Apple, pear and melon juices were inhibitory for L.monocytogenes, S. Enteritidis and E. coli O157:H7 at 5ºC, however at 20 and 35ºCminimal concentrations of 0.2% of malic acid for L. monocytogenes and S.Enteritidis and 0.4% for E. coli O157:H7 were required to inhibit their growth inmelon juice. In general, concentrations of malic acid of 2% in apple and pear juicesand 2.5% in melon juice were necessary to reduce more than 5 log cycles of L.monocytogenes, S. Enteritidis and E. coli O157:H7 at 5ºC, whereas at 20 and 35ºClower concentrations were enough to reach that effect. On the other hand, EOs ofcinnamon, clove, lemongrass and palmarosa as well as their active compoundsshowed antimicrobial activity over pathogenic microorganisms but in differentgrade. Thus, the effectiveness of those substances depended on the microorganismtype, kind of juice and concentration of the substance, thus resulting, the essential oilof lemongrass the substance more effective to inactivate those microorganisms. Acombination of 2.5% D-L malic acid, 1% N-acetyl-L-cysteine, 1% glutathione and1% calcium lactate applied through dipping treatment reduced the populations of L.monocytogenes and S. Enteritidis inoculated in fresh-cut apples and pears in morethan 5 log cycles the same day of sample preparation (t = 0 days), whereas thepopulation of E. coli O157:H7 showed a higher acid-resistance, reaching thatreduction from 3 and 14 days in those fruits respectively. In addition, thatcombination provoked a decrease of the growth rate and prolonged the lag phase ofmesophilic aerobic, psychrophilic and yeast and molds populations, extending theshelf-life from a point of view microbiological until 23 days in apple pieces and bymore than 30 days in fresh-cut pears. Likewise, a lower consumption of O2 and alower production of CO2, ethylene and ethanol, as well as a better maintenance ofthe firmness and color were achieved with the use of that substances combination,thus reaching a physicochemical shelf-life extension. On the other hand, theincorporation of malic acid with quality stabilizing compounds into alginate-basededible coatings was effective to reduce the populations of E.coli O157:H7 and S.Enteritidis inoculated in apple and melon pieces as well as to inhibit the native floragrowth. However, a higher effect over those microorganisms was achieved whenboth malic acid and EOs or their main active compounds were added into coatings,showing the essential oil of lemongrass to be the most effective antimicrobialsubstance. That antimicrobial effect was also intensified with the increase of theEOs concentrations. An extension of the microbiological shelf-life of apple andmelon pieces was also reached with the incorporation of those substances.Nonetheless, some physicochemical and sensory characteristics of the fruits such asfirmness, color, flavour and taste were affected. The results demonstrated that theuse of natural antimicrobials by immersion or through their incorporation intoalginate-based edible coatings is a good alternative to assure the safety and qualityof the fresh-cut fruits.