In 2010, 2011 and 2012 growing seasons, the occurrence of the ascomycetes Podosphaera fusca and Golovinomyces orontii, causal agents of powdery mildew disease, was monitored on cultivated cucurbits located in Bologna and Mantua provinces to determine the epidemiology of the species. To identify the pathogens, both morphological and molecular identifications were performed on infected leaf samples and a Multiplex-PCR was performed to identify the mating type genes of P. fusca isolates. The investigations indicated a temporal succession of the two species with the earlier infections caused by G. orontii, that seems to be the predominant species till the middle of July when it progressively disappears and P. fusca becomes the main species infecting cucurbits till the end of October. The temporal variation is likely due to the different overwintering strategies of the two species instead of climatic conditions. Only chasmothecia of P. fusca were recorded and mating type alleles ratio tended to be 1:1. Considering that only chasmothecia of P. fusca were found, molecular-genetic analysis were carried out to find some evidence of recombination within this species by MLST and AFLP methods. Surprisingly, no variations were observed within isolates for the 8 MLST markers used. According to this result, AFLP analysis showed a high similarity within isolates, with SM similarity coefficient ranging between 0.91-1.00 and also, sequencing of 12 polymorphic bands revealed identity to some gene involved in mutation and selection. The results suggest that populations of P. fusca are likely to be a clonal population with some differences among isolates probably due to agricultural practices such as fungicides treatments and cultivated hosts. Therefore, asexual reproduction, producing a lot of fungal biomass that can be easily transported by wind, is the most common and useful way to the spread and colonization of the pathogen.

E2F-1 is a transcription factor that plays a key role in cell-cycle control at G1/S check-point level by regulating the timely expression of many target genes whose products are required for S phase entry and progression. In mammalian cells, E2F-1 is negatively regulated by hypo-phosphorylated Retinoblastoma protein (pRb) whereas it is protected against degradation by its binding to Mouse Double Minute 2 protein (MDM2). In this study we experimented a drug combination in order to obtain a strong down-regulation of E2F-1 by acting on two different mechanisms of E2F-1 regulation mentioned above. This was achieved by combining drugs inhibiting the phosphorylation of pRb with drugs inactivating the MDM2 binding capability. The mechanism of action of these drugs in down-regulating E2F-1 level and activity is p53 independent. As expected, when combined, these drugs strongly inhibits E2F-1 and hinder cell proliferation in p53-/- and p53-mutated cells by blocking them in G1 phase of cell cycle, suggesting that E2F-1 down-regulation may represent a valid chemotherapeutic approach to inhibit proliferation in tumors independently of p53 status.

Small cell lung carcinoma (SCLC) is a highly lethal disease due to its chemorefractory nature after first line treatment. The mechanisms to overcome this resistance have remained elusive to tackle up to date. MET is a transmembrane tyrosine kinase receptor and its activation is associated with increased motility, migration and invasion in cancer cells. MET is activated in several tumour types and has been linked to patient prognosis. MET activation by its natural ligand Hepatocyte Growth Factor (HGF) has been involved in Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT), a process by which cells decrease adhesion, lose polarity, acquire the ability to migrate and invade surrounding tissue. EMT is also associated with resistance to anticancer agents. We hypothesized that HGF-induced EMT would explain resistance to chemotherapy in SCLC and that MET inhibitors could revert this phenomenon. In our work we demonstrated that HGF-induced MET activation in SCLC cells resulted in a more aggressive phenotype. In human SCLC we demonstrated in two independent series that MET phosphorylation was associated with poor prognosis. In preclinical models we observed that MET activation by HGF induced EMT that resulted in chemoresistance in vitro and in vivo. MET inhibition was able to block or reverse this process and resensitized cells to chemotherapy. Mesenchymal markers in human SCLC specimens were associated with MET activation, predicted a worse survival and were upregulated in chemorefractory disease. Finally, increased HGF serum levels in SCLC patients correlated with higher risk of death. These results suggest that the use of MET inhibitors in combination with chemotherapy as a therapeutic approach in the MET-activated subpopulation of SCLC merits further investigation. / El Cáncer de Pulmón de Célula Pequeña (CPCP) es una enfermedad altamente letal debido a su naturaleza quimiorefractaria después del tratamiento de primera línea. Los mecanismos para derrotar estar quimioresistencia han fracasado hasta la fecha. MET es un receptor de membrana tirosina cinasa y su activación está asociada a una incrementada motilidad, migración e invasión en células tumorales. MET está activado en diversos tipos tumorales y está asociado al pronóstico de los pacientes. La activación de MET mediante su ligando natural “Factor de Crecimiento Hepatocitario” (HGF) ha estado involucrado en la Transición Epitelio- Mesenquimal (EMT), un proceso mediante el cual las células disminuyen su adhesión, pierden la polaridad, adquieren la habilidad de migrar e invaden los tejidos adyacentes. La EMT está también asociada a la resistencia a agentes antitumorales. Nuestra hipótesis es que la EMT inducida por HGF explicaría la resistencia a la quimioterapia en el CPCP y que los inhibidores de MET podrían revertir este fenómeno. En nuestro trabajo demostramos que la activación de MET inducida por HGF en líneas celulares de CPCP dio lugar a un fenotipo más agresivo. En dos series independientes de CPCP humano demostramos que la fosforilación de MET estaba asociada a un peor pronóstico. En modelos preclínicos observamos que la activación de MET mediante HGF indujo la EMT, dando lugar a quimioresistencia in vitro e in vivo. La inhibición de MET fue capaz de bloquear o revertir este proceso, sensibilizando las células tumorales a la quimioterapia. Los marcadores mesenquimales en muestras humanas de CPCP se asociaron a activación de MET, prediciendo una peor supervivencia. Además, la expresión de estos marcadores estaba incrementada en la enfermedad quimiorefractaria. Estos resultados sugieren que el uso de inhibidores de MET en combinación con quimioterapia como una aproximación terapéutica en la subpoblación de pacientes de CPCP con activación de MET merece una investigación más extensa.

Ribosome inactivating proteins (RIPs) are a family of plant proteins that depurinate the major rRNA, inhibiting the protein synthesis. RIPs are divided into type 1, single chain proteins with enzymatic activity, and type 2 RIPs (toxic and non-toxic), with the enzymatic chain linked to a binding chain. RIPs have been used alone or as toxic component of immunotoxins for experimental therapy of many diseases. The knowledge of cell death pathway(s) induced by RIPs could be useful for clarifying the mechanisms induced by RIPs and for designing specific immunotherapy. The topic of the current study was (i) the determination of the amino acid sequence of the type 2 RIP stenodactylin. The comparison with other RIPs showed that the A chain is related to other toxic type 2 RIPs. whereas the B chain is more related to the non-toxic type 2 RIPs. This latter result is surprising because stenodactylin is actually the most toxic type 2 RIP known; (ii) the study of the cell death mechanisms induced by stenodactylin in human neuroblastoma cells (NB100). High doses of stenodactylin can activate the effector caspases (perhaps through the DNA damage and/or intrinsic/extrinsic pathways) and also cause ROS generation. Low doses cause a caspase-dependent apoptosis, mainly via extrinsic pathway. Moreover, the activation of caspases precedes the inhibition of protein synthesis; (iii) the investigation of the cell death pathway induced by the non-toxic type 2 RIPs ebulin l and nigrin b. These RIPs demonstrated high enzymatic activity in a cell-free system, but they lack high cytotoxicity. These preliminary studies demonstrate that the cell death mechanism induced by the two non-toxic RIPs is partially caspase-dependent apoptosis, but other mechanisms seem to be involved

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2008. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-09-17T18:05:41Z No. of bitstreams: 1 2008_PatriciaARuiz.pdf: 2601617 bytes, checksum: 4686577ef653070fd88f7853247e0ae7 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-07-20T19:05:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_PatriciaARuiz.pdf: 2601617 bytes, checksum: 4686577ef653070fd88f7853247e0ae7 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-07-20T19:05:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_PatriciaARuiz.pdf: 2601617 bytes, checksum: 4686577ef653070fd88f7853247e0ae7 (MD5) Previous issue date: 2008 / A angiogênese tem sido implicada na patogênese das lesões periapicais e para que ela ocorra é necessária a atuação de potentes fatores pró-angiogênicos e a participação das MMPs na degradação da matriz extracelular. O objetivo deste estudo foi investigar a imunoexpressão da MMP-9, do VEGF e do FvW em granulomas periapicais (GP), cistos periapicais (CP) e cistos periapicais residuais (CPR) no intuito de verificar a participação da angiogênese no desenvolvimento destas lesões. A análise quantitativa do VEGF nas células do tecido conjuntivo revelou número de médio de células imunorreativas semelhante nos GP e CP (564,9 e 565,0, respectivamente) e maior que nos CPR (443,9), não havendo diferença estatisticamente significativa. Lesões com intenso infiltrado inflamatório apresentaram maior número de células imunorreativas ao VEGF em comparação com lesões que apresentavam leve infiltrado inflamatório (p<0.01). No revestimento epitelial, o VEGF revelou forte expressão tanto em CP (55%) quanto em CPR (70%), padrão observado também nos casos de epitélio atrófico (66,7%) e hiperplásico (55,6%), não havendo diferença estatisticamente significativa entre o dois tipos de cistos (p>0.05) e entre os cistos de revestimento epitelial atrófico e hiperplásico (p>0.05). O número médio de vasos imunorreativos ao FvW foi maior nos CP (250,8) que nos GP (210,4) e nos CPR (217,0), sem haver diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p>0.05). Lesões que apresentavam intenso infiltrado inflamatório exibiram maior número de vasos imunomarcados que aquelas com leve ou moderado infiltrado inflamatório (p<0.05). Não houve correlação entre a quantidade de células imunorreativas para o VEGF e o número de vasos imunomarcados com o anticorpo anti-FvW (r=0.224; p=0,118). A MMP-9 revelou marcada tendência à forte expressão na maioria dos casos de GP (70%) e CP (70%) e fraca expressão nos casos de CPR (60%). Houve associação entre a forte expressão da MMP-9 nas células endoteliais e um intenso infiltrado inflamatório (p=0,055). Além disso, foi observado maior número de células imunopositivas para o VEGF (p<0.01) e maior número de vasos imunorreativos para o FvW (p=0,051) em lesões com forte expressão de MMP-9. Os resultados do presente estudo sugerem que o VEGF pode atuar como importante estímulo à expressão de MMP-9 em células endoteliais de vasos sangüíneos, influenciando o processo de angiogênese em granulomas periapicais, cistos periapicais e cistos periapicais residuais. Adicionalmente, a intensidade do infiltrado inflamatório desempenha importante influência no número de vasos sangüíneos, identificados através da expressão do FvW, na expressão de MMP-9 em células endoteliais e na expressão de VEGF em células do tecido conjuntivo, nas lesões do presente estudo. Por fim, a forte expressão do VEGF no revestimento epitelial dos cistos periapicais residuais sugere a existência de um potencial de crescimento nestas lesões, provavelmente em virtude da manutenção de um status de permeabilidade vascular aumentada. ______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Angiogenesis has been related to the pathogenesis of periapical lesions. So that it occurs is necessary the action of powerful angiogênic factors and the participation of MMPs in the degradation of the extracellular matrix. The purpose of this study was to investigate the immunoexpression of MMP-9, VEGF and vWF in periapical granulomas (PG), periapical cysts (PC) and residual periapical cysts (RPC) to ensure the participation of angiogenesis in the development of these injuries. The quantitative analysis of VEGF in the connective tissue cells revealed similar average number of cells expressing this factor in PG and PC (564,9 e 565,0, respectively) and higher than in RPC (443,9), without statistically significant difference. There was a positive association between the intensity of the inflammatory infiltrate and the average number of cells expressing VEGF (p<0.01). In the epithelial lining, VEGF was strongly expressed by both PC (55%) as RPC (70%), pattern observed also in cases of atrophic (66,7%) and hyperplastic epithelium (55,6%), without difference statistically significant between the two types of cysts (p>0.05) and between atrophic and hyperplastic epithelial lining cysts (p>0.05). The average number of vessels expressing vWF was higher in PC (250,8) than in PG (210,4) and the RPC (217,0), without statistically significant difference between groups (p>0.05). Injuries showing intense inflammatory infiltrate exhibited greater number of vessels immunoreactive than those with mild or moderate inflammatory infiltrate (p<0.05). There was no correlation between the number of cells immunoreactive to VEGF and the number of vessels immunoreactive to the anti-vWF (r=0.224, p=0.118). The MMP-9 showed marked tendency to strong expression in most cases of GP (70%) and PCs (70%) and low expression in cases of CPR (60%). There was strong association between the expression of MMP-9 on endothelial cells and an intense inflammatory infiltrate (p=0055). Moreover, it was observed greater number of cells immunexpressing VEGF (p<0.01) and highest number of vessels immunoreactive to vWF (p=0051) in lesions with strong expression of MMP-9. The results of this study suggest that VEGF can act as an important stimulus for expression of MMP-9 in endothelial cells of blood vessels, influencing the angiogenic process in PG, PC and PRC. Additionally, the intensity of the inflammatory infiltrate plays important influence on the number of blood vessels, identified by the expressions of vWF, in the expression of MMP-9 in endothelial cells and the expression of VEGF in connective tissue cells in the lesions of this study. Finally, the strong expression of VEGF in the epithelial lining of the RPC suggests that there is a potential for growth in these injuries, probably because of the maintenance of a increased vascular permeability status.

Foram estudados fragmentos dos fígados, linfonodos hepáticos e mesentéricos, bem como dos intestinos de 100 bovinos machos, castrados, entre 3 e 4 anos de idade, da raça Nelore e provenientes do estado de Mato Grosso, onde eram mantidos em pastagens de Brachiaria decumbens e/ou Brachiaria brizantha. Macroscopicamente, os fígados apresentavam coloração amarela que se mantinha mesmo após a fixação em formalina, o que não foi constatado nos animais alimentados com outros pastos. O parênquima dos linfonodos apresentava áreas esbranquiçadas em forma de estrias paralelas, especialmente intensas nos linfonodos hepáticos. As alterações histológicas incluíram tumefação de hepatócitos, colangite mononuclear, áreas com proliferação de ductos e a presença de macrófagos espumosos de distribuição multifocal no fígado, nos linfonodos mesentéricos e hepáticos e na submucosa do intestino. Os tecidos com células espumosas foram submetidos a estudos histoquímicos, lectinoistoquímicos e imunoistoquímicos com o objetivo de caracterizar o conteúdo destas células. Através da Coloração de Perls, constatou-se as células espumosas com citoplasma corados de azul-claro, especialmente nos linfonodos e evidenciando a presença de depósitos de sais férricos, possivelmente em conseqüência da fagocitose de eritrócitos extravasados. Na imunoistoquímica, o anticorpo Mac 387, marcador de macrófagos, não marcou as células espumosas. Na lectinoistoquímica, observou-se que a lectina PNA atuou como marcador devido às altas afinidade e especificidade de união com as células espumosas. Com esta lectina, observaram-se células espumosas isoladas, as quais não eram vistas através de outras colorações. Além disto, em estudos feitos em humanos e em nossos animais, a PNA demonstrou ser específica para macrófagos, o que reforça a hipótese de que as células espumosas sejam macrófagos. A comparação do padrão de afinidade das lectinas entre os animais alimentados e os não alimentados com Brachiaria sp., demonstrou que há alterações na composição de glicídios nos animais alimentados por Brachiaria spp.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Ruthléa Nascimento (ruthlea@bce.unb.br) on 2008-10-22T14:34:27Z No. of bitstreams: 1 2008_AlexandreMBailao.pdf: 7854204 bytes, checksum: c195e3862908af97d8d7b4d7b2935d84 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2008-11-12T13:42:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_AlexandreMBailao.pdf: 7854204 bytes, checksum: c195e3862908af97d8d7b4d7b2935d84 (MD5) / Made available in DSpace on 2008-11-12T13:42:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_AlexandreMBailao.pdf: 7854204 bytes, checksum: c195e3862908af97d8d7b4d7b2935d84 (MD5) / O fungo Paracoccidioides brasiliensis é um patógeno humano com ampla distribuição na América Latina. Este microrganismo causa a paracoccidioidomicose, a micose sistêmica mais prevalente na América Latina. O fungo causa infecção quando o hospedeiro inala propágulos da fase miceliana do organismo. Estas partículas atingem o pulmão e podem disseminar para outros órgãos e tecidos. Embora o perfil de expressão gênica em P. brasiliensis tem sido estudado, pouco se conhece sobre o padrão de expressão de genes desta espécie durante o processo infeccioso. O presente trabalho descreve a análise dos genes diferencialmente expressos em células leveduriformes de P. brasiliensis recuperado de animais infectados e durante incubação com sangue humano, que mimetiza a rota hematogênica de disseminação do fungo. Adicionalmente, também foram identificados os genes preferencialmente expressos durante incubação do fungo com plasma humano, mimetizando os sítios de infecção com inflamação. Os dados revelaram que genes relacionados com captação de ferro, síntese de melanina e defesa celular foram superexpressos no modelo de infecção animal. Os transcritos induzidos durante a incubação de células leveduriformes com sangue humano foram aqueles predominantemente relacionados com síntese/remodelamento da parede celular. Genes relacionados com degradação de ácidos graxos, síntese protéica, estresse osmótico, remodelamento da parede celular e defesa celular foram superexpressos no tratamento com plasma humano. A expressão diferencial dos genes identificados foi confirmada por ensaios de dot blot, northern blot e RT-PCRsq. Os dados gerados podem facilitar estudos funcionais de novos genes induzidos os quais podem ser importantes para estratégias de sobrevivência e crescimento do P. brasiliensis em diferentes nichos do hospedeiro.

A leucoplasia se caracteriza por apresentar, microscopicamente, hiperceratose, acantose ou displasia epitelial. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a velocidade de proliferação celular destes distúrbios de maturação epitelial por meio da Técnica de AgNOR. A amostra foi constituída de 50 blocos de parafina distribuídos em 5 grupos de acordo com seu diagnóstico histopatológico em hiperceratose, hiperceratose com acantose, acantose, displasia epitelial e epitélio normal. Para cada grupo foram avaliadas as células da camada basal e suprabasal e a quantificação das AgNORs foi realizada através da média dos pontos de AgNOR por núcleo, da área média dos pontos de AgNOR por núcleo e do percentual médio de células com 1, 2, 3 e 4 ou mais pontos de AgNOR por núcleo. Verificou-se que a média de pontos de AgNOR por núcleo aumentou gradualmente do epitélio normal, hiperceratose com acantose, hiperceratose, acantose até a displasia epitelial. Na comparação em relação à área média dos pontos de AgNOR por núcleo observou-se diferença significativa entre o epitélio normal e os demais grupos. Verificou-se ainda que em todos os grupos há o predomínio de células com 1 AgNOR, e o epitélio normal apresentou valor superior No entanto, a displasia epitelial apresentou maior percentual de células com 4 ou mais AgNORs por núcleo, demonstrando o maior potencial de transformação maligna, uma vez que este parâmetro pode representar um sinal de malignidade. Todavia, os três métodos de quantificação não foram capazes de distinguir os distúrbios de maturação epitelial entre si. A partir dos resultados encontrados, pode-se concluir que os distúrbios de maturação epitelial estudados apresentam ritmo de proliferação celular semelhante e que, dentre eles, a acantose e displasia epitelial têm comportamento de maior risco. Portanto, uma leucoplasia que apresente qualquer um dos distúrbios de maturação epitelial no diagnóstico histopatológico, a conduta clínica deve ser semelhante.

AgNORs, e expressão do Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) em células epiteliais de ameloblastomas. Onze casos de ameloblastomas foram submetidos à técnica de hematoxilina e eosina, para análise morfológica; à técnica de impregnação com prata para quantificação das AgNORs e à marcação com anticorpo anti-Epidermal Growth Factor Receptor. Os resultados não revelaram diferenças estatisticamente significativas quanto à quantificação das AgNORs. A expressão do EGFR nas ilhas epiteliais de ameloblastoma não se mostrou uniforme, sendo possível identificar ilhas marcadas e ilhas sem marcação. A localização da marcação também foi variável nas diferentes ilhas epiteliais, sendo a marcação predominante a de citoplasma e raras as de membrana, essas geralmente eram nas ilhas epiteliais de menor tamanho. Concluiu-se que o tumor apresenta um crescimento irregular, com as ilhas de menor tamanho podendo estar associadas a uma maior atividade proliferativa, contribuindo para a infiltração do tumor.

O objetivo do presente estudo é mapear e quantificar as populações de células CD 20, CD 8 e CD 4+ em Hiperplasias inflamatórias (HI) e estabelecer relação com a infecção por Candida sp. Foram utilizados 41 casos de HI do Laboratório de Patologia Bucal da UFRGS. Novos cortes de todos os casos foram submetidos à técnica de coloração do PAS, criando – se 2 grupos: com e sem infecção por Candida sp. Seguiu – se a marcação imunohistoquímica com os anticorpos monoclonais anti CD 20, anti CD 8 e anti CD 4, para se avaliar a localização, a distribuição e quantificação das células positivamente marcadas em 3 campos consecutivos (400x), escolhidos sobre a área de maior concentração do infiltrado inflamatório. Os resultados da recontagem dos campos mostraram que o examinador estava calibrado pelo teste “t”de Student. As células CD 8+ apresentaram localização próxima às hifas de Candida sp. e foram mais numerosas no grupo com infecção (diferença estatisticamente significante p= 732 x 10-20). As células CD 20 e CD 4 positivas não apresentaram relação com a infecção por Candida sp. Concluiu – se que as células CD 8+ apresentaram localização relacionada às hifas de Candida sp., além de uma razão células positivamente marcada/ linfócitos totais estatisticamente mais alta no grupo com infecção por Candida sp.