Orientador: Renée Laufer Amorim / Banca: Luiz Henrique de Araújo Machado / Banca: Paulo César Maiorka / Resumo: O mastocitoma ou tumor de mastócitos é a neoplasia cutânea mais comum em cães. O sistema de graduação histopatológico proposto por Patnaik et al. (1984), é um importante critério preditivo para o estadiamento da neoplasia e determinação de terapia adjuvante. O grau I representa a neoplasia bem diferenciada, o grau II a moderadamente diferenciada e o grau III a pouco diferenciada ou anaplásica. Alguns autores demonstraram a discrepância entres observadores quando realizadas comparações nas graduações histopatológicas, devendo-se principalmente a subjetividade do sistema atualmente utilizado. A busca de biomarcadores prognósticos pode ser feita utilizando-se anticorpos primários contra as proteínas envolvidas no processo de iniciação, promoção e progressão tumoral, angiogênese, além mediadores inflamatórios. Estudos foram realizados avaliando-se a expressão de c-KIT (indutor de proliferação celular), VEGF (indutor de angiogênese), PGE2 (mediador inflamatório), com a graduação histopatológica. Além de uma avaliação do próprio sistema de graduação. Foi observada uma discrepância ao avaliar 42 casos de mastocitomas, onde em 21,4% dos casos houve concordância entre os quatro observadores envolvidos no estudo. Em 45 mastocitomas avaliados não houve correlação entre a intensidade de expressão de c-KIT com a graduação histopatológica. No entanto o padrão de marcação de c-KIT apresenta correlação com a graduação histopatológica, sendo a membranosa mais frequente no grau I, citoplasmática difusa no grau II e citoplasmática focal no grau III. Ao correlacionar o percentual de células marcadas por campo e a intensidade de coloração do VEGF e PGE2 com a graduação histopatológica de 53 mastocitomas, não houve correlação estatística da expressão de VEGF, visto que todos mastocitomas expressam altas quantidades de VEGF. / Abstract: The mast cell tumor is the most common cutaneous neoplasia in dogs. The histopathologic grading system proposed by Patnaik et al. (1984) is an important predictive criteria for stablishing the neoplasia staging and therapy. The grade I represents a well diferentiated neoplasia, grade II a moderate differentiated, and grade III a poorly diferentiated or anaplasic. Some authors demonstrated a disagreement among pathologists when comparing histopathologic grading, due mainly to the subjective grading system in use. The search for prognostic biomarkers can be made using primary antibodies against proteins involved in the process of tumor initiation, promotion and progression, angiogenesis and inflammatory mediators. Studies were made evaluating c-KIT (cellular proliferation inductor), VEGF (angiogenesis inductor) and PGE2 (inflammatory mediator) expression and its correlation with the histopathologic grading. A evaluation of the grading system itself was also performed. It was found a disagreement when evaluating 42 canine cutaneous mast cell tumors, where 21,4% of the tumors had agreement of all four pathologists. In 45 mast cell tumors evaluated, there was no correlation between the c-KIT expression intensity and the histopathologic grading. However the expression pattern of c-KIT presented a correlation with the histopathologic grading, where the membrane pattern was more frequent in grade I, diffuse citoplasmatic in grade II and focal citoplasmatic in grade III. When correlating the percentual of marked cells and the expression intensity of VEGF and PGE2 with the histopathologic grading of 53 mast cell tumors, there was no statistical correlation of VEGF, due to all mast cell tumors express high levels of VEGF. The PGE2 presented correlation between the percentual of marked cells when comparing grades I and III. / Mestre

Resumo não disponível

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Os glicocorticóides inalados vêm sendo amplamente utilizados em diversas abordagens terapêuticas. Apesar de suas inúmeras vantagens, esta terapia pode levar à irritação e inflamação dos tecidos especialmente nos sítios primários de contato. Em virtude da inexistência de estudos que avaliam a repercussão do uso de corticosteroides inalatórios sobre os tecidos moles da cavidade bucal, este trabalho propõe-se a avaliar o efeito da Budesonida inalatória em diferentes concentrações sobre a mucosa palatina de ratos Wistar. Para realização deste estudo foram utilizadas amostras parafinadas provenientes do estudo realizado por Daudt et al., 2011. Cada amostra foi avaliada quanto a proliferação celular pela técnica histoquímica (AgNORs), a porcentagem de células inflamatórias imunomarcadas por CD18 e a espessura epitelial por HE. Não foram encontrados resultados estatisticamente significantes quanto a análise da proliferação celular e imunomarcação pelo CD18 quando comparamos os grupos-teste e o grupo controle. No entanto, foram encontradas diferenças estatisticamente significantes (p=0,0027) na camada de queratina, onde o grupo controle apresentou a espessura desta camada menor em relação aos grupos testados. O mesmo resultado não foi encontrado no epitélio, onde não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre o grupo controle e os grupos-teste. Com este estudo pode-se sugerir que a inalação de glicocorticoide possui efeito sobre a fibromucosa palatina, observada no espessamento da camada de queratina e que esta resposta resulta em nenhuma ação danosa às estruturas da fibromucosa bucal. / The inhaled glucocorticoids have been widely used in various therapeutic approaches .Despite of its many benefits, this therapy can lead to irritation and inflammation of the tissues especially in the primary sites of contact. Due to the lack of studies that evaluate the impact of the use of inhaled corticosteroids on the soft tissues of the oral cavity, this study aims to evaluate the effect of inhaled Budesonide in different concentrations on the palatal mucosa of Wistar rats . For this study paraffin samples from the study by Daudt et al (2011) were used. Each sample was assessed for cell proliferation by immunohistochemical technique (AgNORs), the percentage of inflammatory cells immunostained for CD18 and epithelial thickness by HE . No statistically significant results for the analysis of cell proliferation by CD18 immunostaining and were found when comparing the test groups and the control group. However, were found statistically significant differences ( p = 0.0027 ) in the keratin layer , where the control group had the smallest thickness of this layer relative to the tested groups. The same result was not found in the epithelium, where no statistically significant differences between the control and test groups were observed. With this study it can be concluded that inhaled glucocorticoids have effect on the oral mucosa palate observed in the thickening of the keratin layer and that this response results in no harmful to the oral mucosa of the oral structures action.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-10-31T17:28:44Z No. of bitstreams: 1 2006_Danielle Lacerda Pires.pdf: 4562953 bytes, checksum: 1c871e5bdd732392ec55d433358b37b4 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-01-19T13:28:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Danielle Lacerda Pires.pdf: 4562953 bytes, checksum: 1c871e5bdd732392ec55d433358b37b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-01-19T13:28:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Danielle Lacerda Pires.pdf: 4562953 bytes, checksum: 1c871e5bdd732392ec55d433358b37b4 (MD5) Previous issue date: 2006 / Os artrópodes hematófagos são capazes de neutralizar defesas do hospedeiro durante repasto, devido à presença de ampla variedade de fatores anti-hemostáticos presentes em suas salivas como vasodilatadores, fatores antiplaquetários e anticoagulantes. O principal mecanismo de transmissão da Doença de Chagas é a contaminação do hospedeiro por excretas de triatomíneos infectados. O Triatoma infestans Klug, 1834, o principal vetor do mal de Chagas no Brasil, possui várias apirases em sua saliva que inibem a agregação plaquetária do hospedeiro. Neste estudo, nós mostramos que as apirases de 88, 82 e 79 kDa desse inseto são antigenicamente distintas e localizam-se na unidade D2 de sua glândula salivar. O conteúdo de uma unidade D2, e não os das outras, foi capaz de inibir a agregação de plaquetas, induzida por ADP, presentes em 1 mL de sangue. Em adição, identificamos pela primeira vez atividades apirásicas nos conteúdos de glândulas salivares de Rhodnius brethesi Matta, 1919; Rhodnius milesi Carcavallo, Rocha, Galvão, Jurberg & Valente 2001; Rhodnius pictipes Stal, 1872 e Rhodnius robustus Larrousse, 1927 por meio de testes enzimáticos utilizando ATP e ADP como substratos. Os ensaios enzimáticos, realizados a 37 °C e pH 8,3, revelaram que as atividades apirásicas são dependentes de cálcio. As atividades apirásicas das glândulas salivares de R. brethesi e R. pictipes foram parcialmente purificadas em coluna de Oligo dT Celulose. Para identificação de proteínas relacionadas com essa atividade, extratos glandulares e frações eluídas da coluna de Oligo dT, não fervidos e não reduzidos, foram submetidos à enzimografia após separação em SDS-PAGE. Este experimento revelou bandas de proteínas com atividades ATPásicas e ADPásicas de aproximadamente 44-45 kDa. Adicionalmente, experimentos de agregação plaquetária realizados in vitro demonstraram que 0,5 par de glândula salivar de R. brethesi, R. milesi, R. pictipes e R. robustus inibiram totalmente a agregação plaquetária induzida por ADP. Diferentemente das apirases de T. infestans, as de Rhodnius spp. são de baixa massa molecular e não fazem parte da família das 5´nucleotidases. A ampla distribuição das apirases nas salivas dos vetores da doença de Chagas e de outros artrópodes indica que estas enzimas têm importância fundamental na hematofagia. / Blood-feeding arthropods are able to constraints barriers imposed by host defenses, due to the presence of a wide range of antihemostatic factors in their saliva, including vasodilators, antiplatelet factors and anticoagulant. The main Chagas disease transmission mechanism is contamination of a host by faeces from triatominae infected. Triatoma infestans Klug, 1834, the main vector of Chagas disease in Brazil, expresses several apyrases in its saliva that inhibit the vertebrate host platelet aggregation. We show in this report that the 88, 82 E 79 kDa apyrases of the insect are antigenically different and localize within the salivary gland D2 unit. The content of one D2 unit, and not that of the others, was able to mediate fully inhibition of platelet aggregation induced by ADP, from 1 mL of human blood. In addition, we identified for the first time apyrase activities in the saliva of Rhodnius brethesi Matta, 1919; Rhodnius milesi Carcavallo, Rocha, Galvão, Jurberg & Valente 2001; Rhodnius pictipes Stal, 1872 e Rhodnius robustus Larrousse, 1927. The tests, which were accomplished at 37 °C and pH 8,3, revealed that these apyrase activities are dependent upon Ca+2 . The apyrase activities present in the salivary glands of R. brethesi e R. pictipes were then partially purified on an Oligo dT Cellulose® column. To identify proteins related to apyrase activity, salivary gland content and eluted fractions from the Oligo dT column were submitted to SDS-PAGE enzimography without previous boiling or reduction of the samples. This experiment allowed the identification of 44-45 kDa protein bands displaying both ATPase and ADPase activities. In vitro platelet aggregation assays showed that the content of 0,5 salivary gland pair R. brethesi, R. milesi, R. pictipes e R. robustus completely abolished platelets aggregation induced by ADP. Differently fromf T. infestans apirases, Rhodnius spp. express apyrases of low molecular masses that aren’t members of the 5´nucleotidase family. The wide distribution of apyrases in the saliva of Chagas disease vectors and other arthropods indicate that these enzymes play an important role during the hematophagous process.

Tese (doutrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2006. / Submitted by Priscilla Brito Oliveira (priscilla.b.oliveira@gmail.com) on 2009-11-13T22:51:37Z No. of bitstreams: 1 2006_Roselene Ecco.pdf: 9985929 bytes, checksum: 6306953978bd81cfcaee212eb1317707 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-12-20T14:21:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Roselene Ecco.pdf: 9985929 bytes, checksum: 6306953978bd81cfcaee212eb1317707 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-12-20T14:21:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Roselene Ecco.pdf: 9985929 bytes, checksum: 6306953978bd81cfcaee212eb1317707 (MD5) Previous issue date: 2006 / Uma intoxicação acidental envolveu 27 caprinos com 7 a 8 meses de idade, produtos do cruzamento da raça Sannen com a raça Pardo Alpino. Os animais adoecerem após receberem sobredose (15 ml por animal) do antiparasitário closantel. Os caprinos demonstraram principalmente sinais neurológicos centrais, cegueira e dor abdominal. As lesões caracterizavam-se por edema intramielínico da substância branca do encéfalo e do nervo óptico, degeneração de retina e necrose hepática aguda. Para comprovar a causa da intoxicação, as alterações clinico-patológicas apresentadas pelos caprinos do surto foram reproduzidas em dois caprinos através da administração de sobredose do antiparasitário closantel. O produto foi idêntico ao utilizado nos caprinos do surto acidental. Por causa da grande perda econômica conseqüente da morte de animais nesses surtos e, principalmente por ocorrerem com drogas de uso rotineiro na terapêutica, experimentos adicionais com o mesmo produto foram realizados com a finalidade de esclarecer melhor o quadro clínico-patológico da intoxicação, principalmente as alterações oftálmicas, de nervo óptico e as alterações hepáticas até o momento não descritas. O estudo experimental procurou avaliar também a relação dose terapêutica e dose tóxica em caprinos com estados nutricionais diferentes. As alterações oftálmicas incluíram cegueira bilateral persistente determinada pela degeneração, necrose e atrofia da retina além de degeneração e malácia do nervo óptico. A cegueira foi evidente em todos os caprinos intoxicados experimentalmente, de acordo com os caprinos da intoxicação acidental. Nos caprinos bem nutridos da intoxicação experimental a morte não ocorreu e tiveram apenas a cegueira com seqüela. Já nos caprinos mal nutridos do experimento, além da cegueira ocorreram mortes com lesões encefálicas, oculares e hepáticas similares aos caprinos da intoxicação acidental. A constatação física e laboratorial (dosagem de albumina) dos diferentes níveis nutricionais desses caprinos mostrou que, quando mal nutridos são mais sensíveis aos efeitos da droga, sendo necessários cuidados bem maiores no uso desse antiparasitário. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / After spontaneous (iatrogenic) poisoning of kid goats with closantel an experimental study was executed. The economical losses caused by outbreaks deaths and drugs used on routine therapeutic protocols justify the toxicosis study of closantel in goats. The closantel outbreak occurred in twenty – seven to eight – month – old cross Saanen goats. The animals became sick two to four days after overdose administration of antihelmintic closantel. The kid goats showed particularly on the clinical signs: nervous disturbances, blindness and colic. The lesions were characterized for oedema in the white matter of the brain and in the optical nerve, retinal degeneration and acute hepatic necrosis. The spontaneous poisoning was confirmed by experimentally reproduction of the toxicosis using the same dose of closantel administered on the farm. Other experiments were performed to clarify the clinical and pathological findings associated with the toxicosis, especially the ophthalmoscopic and optic nerve changes, and not undescribed hepatic lesions. The closantel overdose was evaluated additionally on the different nutritious levels of kid goats. The ophthalmic changes included irreversible bilateral blindness established by degeneration, necrosis and retina atrophy, degeneration and malacia of optic nerve. The evident blindness observed in all of experimental kid goats was similar to blindness present in the accidentally poisoned goats. The experimental poisoned goats, which presented poor body condition and blindness died with encephalic, ophthalmic changes and hepatic lesions similar to the spontaneous poisoning kid goats. The body condition score and laboratory assay (serum level albumin) showed the undernourished kid goats are more susceptible to the closantel effects.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2010-03-02T17:23:51Z No. of bitstreams: 1 2009_AlexLeitePereira.pdf: 8066623 bytes, checksum: 7ecf0efab2fe486b439721642be48825 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-12T13:38:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_AlexLeitePereira.pdf: 8066623 bytes, checksum: 7ecf0efab2fe486b439721642be48825 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-12T13:38:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_AlexLeitePereira.pdf: 8066623 bytes, checksum: 7ecf0efab2fe486b439721642be48825 (MD5) Previous issue date: 2009-05-29 / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é uma categoria diarreiogênica composta por isolados que expressam o característico padrão de adesão agregativa (AA) em associação com células epiteliais. Nas cepas protótipo de EAEC, o fenótipo AA está associado à presença dos plasmídios pAA que codificam para fímbrias de adesão agregativa (AAF). Não obstante, o padrão AA é um evento multifatorial influenciado pela expressão de adesinas afimbriais, de pili e de fimbriais não associadas aos plasmídios AA. Cepas de EAEC típicas (pAA+) são proficientes na formação de biofilmes, característica considerada fator de virulência consensual desta categoria. Durante um estudo epidemiológico, o isolado C. freundii (Cf) 205 demonstrando fenótipo AA foi isolado de uma criança diarréica juntamente com a cepa de EAEC 205-1. Em ensaios preliminares, foi mostrado que a adesão bacteriana a células epiteliais era intensificada em decorrência da co-infecção por Cf 205 e cepas de EAEC. Este estudo tem por objetivo determinar características de patogenicidade em cepas de C. freundii e definir os eventos biológicos mediadores da ação sinérgica de adesão descrita. Ensaios de adesão a células HeLa e de formação de biofilme, bem como a detecção de marcadores de virulência de E. coli, foram realizados para determinar possíveis associações entre cepas de C. freundii e diarréia. Todas as 28 cepas de C. freundii utilizadas no estudo foram negativas para os fatores de virulência pesquisados. Isolados de C. freundii recuperados exclusivamente de diarréia foram caracterizados pela expressão do padrão AA e pela formação de intenso biofilme, e, então, foram denominados C. freundii agregativo formadores de biofilme (BACF). Para determinar a natureza do efeito sinérgico desenvolvido por C. freundii e cepas de EAEC, ensaios de pré-condicionamento de meio de cultura foram conduzidos com o intuito de verificar a ocorrência eventos de sinalização química. Adicionalmente, análises de ultra-estrutura baseadas em microscopia eletrônica de varredura foram realizadas em complemento a ensaios de agregação bacteriana e de formação de biofilme para verificar o envolvimento de apêndices bacterianos na ação sinérgica descrita. A cepa de BACF 205 mostrou-se capaz de induzir agregação bacteriana quando na presença de cepas de EAEC. Os agregados bacterianos eram mediados por apêndices flexíveis expressos por cepas de EAEC que portavam genes para pilina F (traA). Estruturas semelhantes foram visualizadas nos biofilmes simples formados por cepas de EAEC traA-positivas, como também nos biofilmes mistos intensificados em decorrência da co-cultura de BACF 205 e cepas de EAEC traApositivas. O aumento dos biofilmes mistos produzidos pela combinação BACF 205-EAEC traA-positiva foi abolido por zinco, um inibidor específico de pili F. Complementarmente foi mostrado que zinco inibe seletivamente a maioria dos biofilmes formados por cepas de EAEC típicas isoladas de crianças diarréicas. Em conclusão, supostos pili F expressos por cepas típicas de EAEC incrementam a formação de biofilmes mistos quando na presença de BACF. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) are enteropathogenic strains that display the distinctive aggregative adhesion (AA) when in association with cultured cells. In typical EAEC strains, the AA phenotype is associated with specific fimbriae (AAFs) encoded by plasmids (pAA). However, other factors, including afimbrial adhesins and pili, are also associated with this adherence pattern, indicating its complex nature. The expression of biofilms has been considered a consensual virulence factor among typical (pAA+) EAEC isolates. During an epidemiologic study focusing infantile diarrhea, AA-positive Citrobacter freundii (Cf) 205 and EAEC strains were concomitantly recovered from a severe case of mucous diarrhea. Preliminary assays showed that the coinfection of epithelial cells with Cf 205 and EAEC strains led to an increase in the bacterial adhesion. The aim of this study was to verify the occurrence of pathogenic traits in C. freundii strains as well as to identify the biological events underlying the increase in bacterial adherence. Biofilm and adhesion assays showed that C. freundii strains that displayed aggregative adhesion to HeLa cells and formed strong biofilms were exclusively isolated from diarrhea. This subset of strains was then named biofilm-forming aggregative C. freundii (BACF). All C. freundii strains were tested negative for the EAEC fimbrial genes as well as for others E. coli virulence markers. In attempt to define the nature of the synergic events developed by C. freundii and EAEC strains, pre-conditioned media were used to verify the role of chemical signals in the studied events. Additionally, bacterial aggregation and biofilm assays were carried out and ultrastructurally analyzed employing electron microscopy. The increased adherence was mediated by physical interactions among the bacteria and primed in the absence of chemical signaling. Thus, significant increases in bacterial adhesion were also observed during the formation of mixed biofilms on abiotic surfaces. Bacterial settling assays showed that EAEC strains harboring F-pili genes (traA) were capable of forming bacterial aggregates only in the presence of BACF. In scanning electronic microscopy analyses, it was observed that bacterial aggregates as well as enhanced biofilms formed by BACF and traA-positive EAEC were mediated by non-bundle forming, flexible pili. Moreover, mixed biofilms formed by BACF and traA-positive EAEC strains were significantly reduced using nonlethal concentration of zinc, a specific inhibitor of F pili. In addition, EAEC strains isolated from diarrheic children frequently produced single biofilms sensitive to zinc. In conclusion, putative F pili expressed by EAEC strains boosted the mixed biofilm formation when in presence of biofilm-forming aggregative C. freundii.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-07-08T19:32:20Z No. of bitstreams: 1 2008_CarlosMaximilianoRMFilho.pdf: 1415168 bytes, checksum: 458bfff36d1c3017ce67dc4f8ca8205a (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-07-14T22:23:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_CarlosMaximilianoRMFilho.pdf: 1415168 bytes, checksum: 458bfff36d1c3017ce67dc4f8ca8205a (MD5) / Made available in DSpace on 2010-07-14T22:23:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_CarlosMaximilianoRMFilho.pdf: 1415168 bytes, checksum: 458bfff36d1c3017ce67dc4f8ca8205a (MD5) Previous issue date: 2008 / A proteína acessória do HIV-1 Vpr ativa ATR induzindo um estresse replicativo do DNA. A ativação de ATR resulta num prolongamento da fase G2 do ciclo celular e termina induzindo a célula entrar em apoptose. No presente estudo investigou-se a função do sistema ubiquitina/proteassoma no contexto da atividade de Vpr. Reporta-se que esse sistema essencial para Vpr disparar o ponto de checagem de dano ao DNA na fase G2. Também investigou-se em detalhes as E3 ligases manipuladas por Vpr nesse processo. Foi encontrado que Vpr se liga a DCAF1, uma subunidade de Cul4-A/DDB1 E3 ligase. Mutações no domínio C-terminal da Vpr(R80A) mutante, a qual é capaz de se ligar à DCAF1, é incapaz de realizar a ativação do ponto de checagem do ciclo celular e possui um caráter dominante negativo. Em contraste, a mutação Q65R, na cadeia rica em leucina de Vpr inibe a interação com DCAF1, resultando numa forma inativa de Vpr; portanto, considerar-se-ia, então, que essa interação é requerida porém não suficiente para Vpr induzir o prolongamento de G2. Foi, então, proposto um modelo no qual Vpr recruta, através do seu domínio C-terminal, uma proteína celular desconhecida para ser degradada pelo sistema de ubiquitina- proteassoma e isto causaria o bloqueio do ciclo celular. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / HIV-1 Vpr is a viral accessory protein that activates ATR through the induction of DNA replication stress. ATR activation results in cell cycle arrest in G2 and induction of apoptosis. In the present study, we investigate the role of the ubiquitin/proteasome system (UPS) in the above activity of Vpr. We report that the general function of the UPS is required for Vpr to induce G2 checkpoint activation. We further investigated in detail the specific E3 ubiquitin ligase subunits that Vpr manipulates. We found that Vpr binds to the DCAF1 subunit of a cullin 4a/DDB1 E3 ubiquitin ligase. The carboxyterminal domain Vpr(R80A) mutant, which is able to bind DCAF1, is inactive in checkpoint activation and has dominant-negative character. In contrast, the mutation Q65R, in the leucine-rich domain of Vpr that mediates DCAF1 binding, results in an inactive Vpr devoid of dominant negative behavior. Thus, the interaction of Vpr with DCAF1 is required, but not sufficient, for Vpr to cause G2 arrest. We propose that Vpr recruits, through its carboxy terminal domain, an unknown cellular factor that is required for G2- to-M transition. Recruitment of this factor leads to its ubiquitination and degradation, resulting in failure to enter mitosis.

Dissertação (mesrtrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-06-21T16:23:57Z No. of bitstreams: 1 2010_PaulaGonçalvesMacedo.pdf: 1895380 bytes, checksum: 659abf34a1921dbb7d514fa76f0ba02f (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-07-08T17:01:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_PaulaGonçalvesMacedo.pdf: 1895380 bytes, checksum: 659abf34a1921dbb7d514fa76f0ba02f (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-08T17:01:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_PaulaGonçalvesMacedo.pdf: 1895380 bytes, checksum: 659abf34a1921dbb7d514fa76f0ba02f (MD5) / Introdução: O teste de inclinação (TI) é frequentemente utilizado na investigação da síncope inexplicada. No entanto, na prática clínica é considerado muito longo e mal tolerado pelos pacientes. Objetivos: Primário: comparar a sensibilidade, especificidade, acurácia entre o TI convencional e o TI sem fase passiva. Secundários: comparar o tempo de positivação e a tolerabilidade do paciente aos dois protocolos referidos. Métodos: Pacientes com história típica de síncope vasovagal (SVV) foram randomizados para realizar o TI convencional (grupo I) que consistia de 20 minutos de fase passiva seguida por 25 minutos de fase sensibilizada com dinitrato de isossorbida (DNIS); ou para o TI sem fase passiva (grupo II) em que o DNIS era administrado imediatamente após a inclinação e o paciente era observado por 25 minutos no total. O grupo controle era constituído por indivíduos sem história de síncope ou pré-sincopes, pareados por gênero e idade com os pacientes. Um questionário para avaliação da tolerabilidade foi aplicado após os exames. Resultados: Sessenta pacientes foram incluídos (29 ± 10 anos, 82% sexo feminino). No grupo I, 22/30 pacientes tiveram TI positivo comparado a 21/30 no grupo II (73% vs. 70%, p=0,77). Também não houve diferença na acurácia entre os dois protocolos (63% vs. 73%, p=0,24). O tempo para positivação do exame foi significativamente menor no grupo II (13 vs. 30 minutos, p < 0,001). Dentre os indivíduos controle (n=60), a frequência de resultados falso-positivos foi de 47% e 23% pelo TI convencional e TI sem fase passiva, respectivamente (p=0,058). Após o TI convencional, 75% dos indivíduos classificaram o teste como longo comparado a 35% dos indivíduos submetidos ao TI sem fase passiva (p=0,002). Do mesmo modo, indivíduos que realizaram o TI convencional se queixaram mais de cansaço (29% vs. 6%, p=0,03) e dor nas pernas (42% vs. 7%, p=0,005). Conclusões: No presente estudo, o TI sem fase passiva não foi inferior ao TI convencional no que se refere à sensibilidade, especificidade e acurácia. Além disso, o protocolo mais curto permitiu diagnóstico mais rápido e foi melhor tolerado. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Background: The head-up tilt testing (HUT) is widely used to investigate unexplained syncope; however, in the clinical practice, it is time-consuming and poorly tolerated. Objectives: To compare the sensitivity, specificity, accuracy, and patients’ tolerability of a conventional and a shortened HUT. Methods: Patients with a typical history of vasovagal syndrome were randomized to a conventional HUT (Group I) consisting of 20-min passive tilting followed by 25 min after administration of sublingual isosorbide dinitrate (ISDN); or a shortened HUT (Group II) where ISDN was given immediately after tilting and were observed for 25 min. The control group consisted of age and gendermatched healthy subjects. A specific questionnaire to evaluate tolerability was applied after the tests. Results: Sixty patients (29±10 years, 82% female) were included. In group I, 22/30 patients had a positive HUT compared to 21/30 in group II (73% vs. 70%, p=0.77). There was also no difference in the accuracy between the two protocols (63% vs. 73%, p=0.24). The time to positivity was shorter in group II (13.2 min vs. 30 min, p<0.001). Within the control group (n=60), the frequency of falsepositives was 47% and 23% for the conventional and shortened HUT, respectively (p=0.058). After conventional HUT, 75% of subjects classified the exam as too long compared to 35% after the shortened HUT (p=0.002). Likewise, subjects who did the conventional HUT complained more of tiredness (29% vs. 6%, p=0.03) and leg pain (42% vs. 7%, p=0.005). Conclusion: In this study, the HUT without passive phase was non-inferior to the conventional HUT regarding sensitivity, specificity and accuracy. Furthermore, the shortened protocol allowed faster diagnosis and was better tolerated.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2013. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-01-02T10:23:34Z No. of bitstreams: 1 2013_LuisaDefrancoFerreiraPeconick_Parcial.pdf: 855251 bytes, checksum: bb95fc3c687f69b402e9466503c903f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2014-01-02T13:07:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_LuisaDefrancoFerreiraPeconick_Parcial.pdf: 855251 bytes, checksum: bb95fc3c687f69b402e9466503c903f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-02T13:07:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_LuisaDefrancoFerreiraPeconick_Parcial.pdf: 855251 bytes, checksum: bb95fc3c687f69b402e9466503c903f5 (MD5) / O basidiomiceto Cryptococcus neoformans, é um fungo oportunista, que comumente infecta pacientes portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e imunocomprometidos em geral. É o agente etiológico da criptococose, doença potencialmente fatal e cosmopolita cuja incidência mundial vem se aproximando da de doenças como a tuberculose. O gene VOSA pertence à família velvet, exclusiva de fungos e primeiramente descrita em Aspergillus, e está envolvido na viabilidade dos esporos e na regulação das fases assexuada e sexuada. Proteínas dessa família são fatores transcricionais altamente conservados entre ascomicetos e basidiomicetos que regulam diferentes processos em resposta a estímulos ambientais. A análise in silico do gene VOSA de C. neoformans mostrou sua conservação entre os fungos. Construiu-se um cassete de deleção do gene VOSA contendo o gene de resistência à higromicina B por PCR double joint. O cassete foi transformado por biobalística nas linhagens selvagens KN99a/α (soroA) que permitiu a obtenção de mutantes vosAaΔ e vosAαΔ. Da mesma forma, o fragmento contendo o locus VOSA foi transformado para obtenção do reconstituído tipo a (vosAaΔ::VOSA). Confirmou-se a deleção e a reconstituição de VOSA por PCR comum. Os mutantes vosAaΔ e vosAαΔ foram submetidos aos testes de fenótipo: crescimento a 30°C e 37°C, formação de cápsula, produção de urease e fosfolipase, alterações de parede celular e produção de melanina, no entanto não foram observadas quaisquer alterações no fenótipo quando comparados com a linhagem selvagem. Quanto à capacidade de realizar acasalamento, os mutantes vosAaΔ e vosAαΔ foram submetidos a acasalamento com linhagem selvagem de tipo sexual oposto e apresentaram diminuição na formação de hifas e alteração morfológica significativa de sua estrutura. Mutantes de tipo sexual opostos (vosAaΔ vs. vosAαΔ) também foram submetidos a acasalamento e não apresentaram qualquer formação de hifas. Acredita-se que VOSA seja um regulador positivo da reprodução sexuada, e que controle a formação de estruturas sexuais. A expressão de genes velvet foi analisada no mutante vosAaΔ em comparação à cepa selvagem sem indicação de qualquer alteração transcricional. Os resultados até agora obtidos em C. neoformans colaboram para um melhor entendimento do papel de VOSA na patobiologia deste patógeno. Pretende-se identificar em detalhe o papel deste gene no ciclo de vida de C. neoformans, em especial na produção de esporos, que são as formas infectivas e de disseminação deste patógeno. Os dados moleculares gerados neste trabalho servem como ponto de partida para elucidar a complexa regulação do ciclo sexual de C. neoformans e pela primeira vez descreve o envolvimento de um gene velvet na biologia de um basidiomiceto. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The basidiomycete fungus Cryptococcus neoformans is an opportunistic organism which commonly infects HIV and immunocompromised patients. It is the etiological agent of cryptococcosis, a potentially fatal and cosmopolitan disease, whose world’s incidence is approaching from diseases such as tuberculosis. VOSA gene belongs to the velvet family, fungal exclusive and primarily described in Aspergillus, involved in the regulation of sexual and asexual development as well as in the viability of the spores. Proteins of this family are transcriptional factors highly conserved among ascomycetes and basidiomycetes regulating different process in response to environmental stimuli. In silico analysis of VOSA gene showed its conservation among the fungi. A VOSA disruption cassette containing the hygromycin reistance gene was assembled by Double Joint PCR. The cassette was transformed by biolistic in KN99a/α (soroA) wild type strains that allowed obtaining the vosAaΔ and vosAαΔ mutants. Likewise, the fragment containing the VOSA locus was transformed to obtain a mating type a reconstituted strain (vosAaΔ::VOSAa). Both disruption and reconstitution were confirmed by traditional PCR. The mutants vosAαΔ and vosAaΔ were tested for various phenotypes: growth at 30 and 37°C, capsule formation, urease and phospholipase production, changes in cell wall and melanin production, however no phenotypic changes were observed compared to the wild type strains. Regarding the ability to mate, vosAaΔ and vosAαΔ mutants were crossed with wild type strain of opposite mating type and the crosses showed decreased hyphae formation and significant morphological alteration of its structure. Mutants of opposite mating type (vosAaΔ vs. vosAαΔ) were subjected to mating and showed no formation of hyphae. VOSA is believed to be a positive regulator of sexual reproduction, and that controlling the formation of sexual structures. Expression of velvet genes was analyzed in vosAaΔ mutant in comparison with wild type strain and any significant transcriptional changes were noticed. The results obtained so far in C. neoformans collaborate for a better understanding of its role in the pathobiology of this pathogen. It is intended to identify in detail the role of VOSA in C. neoformans lyfe cycle, in particular spore production, the infective and dissemination form of the pathogen. The molecular data generated in this study are starting point for a research to elucidate the molecular mechanism of the sexual cycle regulation on C. neoformans and for the first time describ a velvet gene involved in the biology of a basidiomycete.