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Développement par génie tissulaire d'un modèle de peau humaine innervée, vascularisée et immunocompétente pour l'étude des réactions inflammatoires cutanées

Muller, Quentin 09 March 2019 (has links)
"Thèse en cotutelle, Université Laval Québec, Canada Philosophiæ doctor (Ph. D.) et Université de Strasbourg Strasbourg, France" / Les réactions immunitaires de la peau sont initiées par les cellules dendritiques cutanées (dendritic cells, DCs). L'effet potentiellement sensibilisateur d'un composé peut être prédit in vitro en utilisant des monocytes humains différenciés en DCs (MonoDCs). Cependant, ces modèles simplistes restent imprécis car l'activation des DCs cutanés par les sensibilisateurs peut être déclenchée ou modulée par des interactions microenvironnementales avec de multiples types de cellules non immunitaires. Notre objectif est de développer une peau immunocompétente qui combinera des MonoDCs avec tous les éléments structurels et fonctionnels de la peau, c'est-à-dire une barrière épidermique posée sur un derme contenant une pseudo-vascularisation et des neurones nociceptifs. Une matrice de collagène a été ensemencée avec des fibroblastes et des cellules endothéliales, puis avec des précurseurs de fibres nerveuses dérivées soit de l'iPSC humaine, soit de la DRG embryonnaire murins. Enfin, nous avons introduit les MonoDC et les kératinocytes. Nous avons observé que les neurones différenciés in situ innervent l'épiderme comme observé habituellement dans la peau humaine normale. De plus, les neurones dérivées d’iPSCs, expriment neuropeptides et canaux calcique spécifiques des fibres nociceptives. Enfin, les Mono-DC intégrés au modèle restent stable pendant toute la durée nécessaire à la formation de l’épiderme et peuvent être stimulé. Le modèle sera utilisé pour prédire le potentiel irritant des composés chimiques et l'impact de l’innervation nociceptive sur l'activation des DCs. / Immune reactions in the skin are initiated by the cutaneous dendritic cells (DCs). The potential sensitizing effect of a compound can be predicted in vitro using human monocytes differentiated into DCs (Mono-DCs). However, these simplistic models remain inaccurate because the activation of cutaneous DCs by sensitizers may be triggered or modulated by microenvironmental interactions with multiple types of nonimmune cells. Our goal is to develop an immunocompetent human tissue-engineered skin that will combine DCs with all structural and functional element of the skin, i.e. an epidermal barrier laid upon a dermis containing a pseudo-vascularization and nociceptive neurons. Collagen matrix was seeded with fibroblasts and endothelial cells, then with precursors of nerve fibers derived from either human iPSC or murine embryonic DRG. Finally, we introduced Mono-DCs and keratinocytes. We observed that in situ differentiated neurons grow axons towards the epidermis as usually observed in normal human skin. What's more, the neurons derive from iPSC, express neuropeptides and calcium channel as normal nociceptive fibers. Moreover, Mono-DCs settled as expected beneath the epidermis and remained sessile to stimulation for several weeks. The model will be used to predict the irritant potential of chemical compounds, and the impact of nerves on DC activation.
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Mise au point par génie tissulaire d'un modèle de peau contenant des cellules immunitaires d'origine dermique : application à la cicatrisation cutanée

Chaib, Yanis 26 May 2021 (has links)
Les modèles de peau in vitro en trois dimensions sont des outils pour étudier des processus biologiques ou pathologiques. La majorité des modèles in vitro actuellement disponibles ne comporte pas de système immunitaire et de réseau vasculaire, tous deux présents dans la peau humaine. Nous avons développé un modèle de peau entièrement composé de cellules d'un même donneur (autologue) et contenant des cellules immunitaires et endothéliales. En nous basant sur le modèle d'auto-assemblage du LOEX, nous avons mis en culture durant quatre semaines des fibroblastes dermiques dans un milieu favorisant le dépôt de matrice extracellulaire. La résultante est un feuillet manipulable composé de cellules entourées de matrice. Un isolat dermique préalablement extrait du derme humain est ensemencé sur un premier feuillet de fibroblastes et les kératinocytes sur un second. L'isolat dermique contient l'ensemble des cellules présentes dans le derme du donneur. Les deux feuillets sont ensuite superposés et mis en culture pendant deux semaines à l'interface air-liquide pour stimuler la différenciation de l'épithélium. Une analyse histologique a mis en évidence un épithélium stratifié sur un derme composé de matrice et de cellules. Des immunomarquages ont également montré la présence de cellules immunitaires CD45+ viables et d'un réseau vasculaire CD31+ au niveau du derme. Une plaie a ensuite été créée au centre de ce modèle de peau et une analyse histologique a montré une migration des cellules épidermiques et dermiques dans la plaie. La création de ce modèle permettra d'avoir une meilleure compréhension de l'homéostasie de la peau et du phénomène de cicatrisation cutanée. / In vitro three-dimensional human skin models provide a tool to investigate biological or pathological processes and to test drug effect or toxicity. In vitro models usually lack an immune system and vasculature, both characteristics of the human skin. We developed a skin model composed of cells from the same donor (autologous) and containing immune cells and endothelial cells. Based on the self-assembly method developed at the LOEX, dermal fibroblasts were first cultured during four weeks in a medium stimulating the production of an extracellular matrix. The result of this culture is a fibroblast sheet used for the development of our model. A dermal fraction enzymatically extracted from a human dermis was seeded onto a first sheet while the keratinocytes were seeded on a second one. The dermal fraction contained all the dermal cells from a donor. The two sheets were then superimposed and raised at the air-liquid interface during two weeks to stimulate epidermis differentiation. Histological studies of the 3D skin model highlighted a stratified epidermis on a dermis composed of matrix and cells. Immunofluorescence staining showed viable CD45+ immune cells and a CD31+ capillary network in the dermis. A wound was then produced at the center of the model and histological studies highlighted the migration of the epidermal and dermal cells into the wound. The creation of this first autologous 3D model containing immune cells paves the way to increase knowledge about skin homeostasis and the role of immune cells in the wound healing process.
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Caractérisation des cellules souches présentes dans les follicules pileux et analyse de leur potentiel de différenciation in vivo et in vitro à l'aide de peaux reconstruites par génie tissulaire

Larouche, Danielle 13 April 2018 (has links)
Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006 / Les cellules souches sont à la base de la régénération des tissus adultes et du maintien de leur homéostasie. Afin d'étudier le processus de différenciation des cellules souches cutanées et d'approfondir nos connaissances sur les conditions qui contrôlent leur différenciation en épiderme et/ou en follicules pileux in vitro différents substituts cutanés ont été mis au point par génie tissulaire. D'une part, la portion dermique des peaux reconstruites a été produite par la superposion de feuillets de matrice extracellulaire produits par des fibroblastes humains ou murins cultivés en présence d'acide ascorbique. D'autre part, des kératinocytes (humains ou murins) ou des follicules pileux immatures (murins) ont été implantés sur les dermes reconstruits. Les propriétés histologiques et immunohistochimiques des tissus ont été évaluées après leur maturation in vitro ou sur l'animal. Nos résultats ont révélé que les interactions mésenchyme-épithéliales créées dans la peau reconstruite par génie tissulaire influencent significativement la voie de différenciation qu'empruntent les kératinocytes engendrés par les cellules souches et qu' il est possible, en recréant les conditions adéquates, de reconstruire des substituts cutanées aux propriétés histologiques similaires à la peau native ainsi que des peaux reconstruites capables de soutenir la formation de follicules pileux après la greffe. Des études in situ ont également été menées sur les cellules souches de la vibrisse de la souris. Nous avons observé que les kératinocytes présentant un cycle cellulaire long forment deux populations distinctes dans la région du renflement: une est en contact avec la membrane basilaire et l'autre ne l'est pas (appelée Bs1). Chacune de ces populations possède un aspect histologique distinct et présente une organisation, du réseau de kératine qui lui est spécifique et qui est associée à l'expression de kératines particulières. L'étude des vibrisses des souris dont le gène de la kératine 17 (K 17) a été invalidé a révélé que la K 1 7 est essentielle à la formation des vibrisses et à l'intégrité ultrastructurale des cellules Bs 1. En conclusion, mes travaux apportent de nouvelles données sur les conditions qui régissent la différenciation des cellules souches cutanées et sur les caractéristiques intrinsèques des cellules souches de la vibrisse.
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Développement de peaux reconstruites microvascularisées et application à l'étude du mélanome in vitro

Bourland, Jennifer 14 February 2021 (has links)
La translation vers la clinique de nouveaux médicaments anti-cancéreux peut échouer à différentes étapes, notamment lors du passage des modèles animaux à l'humain. Pour améliorer la prédictibilité des tests précliniques, de nouveaux modèles in vitro humains recréant le microenvironnement tumoral sont nécessaires. Dans le cadre du mélanome cutané, les vaisseaux sanguins et lymphatiques dermiques sont des composantes essentielles à la progression tumorale, tout comme les cellules immunitaires. Nous avons émis l'hypothèse qu'il est possible de microvasculariser des substituts cutanés avec des capillaires sanguins et lymphatiques, puis d'appliquer ce contexte tissulaire à la modélisation du mélanome. Notre modèle, basé sur la méthode d'auto-assemblage, est constitué, dans un premier temps, de fibroblastes, de cellules endothéliales microvasculaires humaines et de kératinocytes. Deux types de réseaux ont été observés dans les substituts cutanés en coupe et sur tissu entier. Ils présentent des morphologies distinctes et sont caractérisés par des marquages CD31 (pan-endothéliale) et podoplanine (spécifique aux cellules lymphatiques). La capacité des cellules endothéliales à former des réseaux en fonction de leur origine, cellules de nouveau-né ou d'adulte, a été évaluée. Il a également été confirmé que la présence d'un épiderme formé de kératinocytes influe sur la formation des réseaux de capillaires sanguins et lymphatiques. Les peaux doublement microvascularisées ont permis l'étude du mélanome dans un microenvironnement humain in vitro. Ce modèle a été formé en ajoutant des sphéroïdes de mélanome aux substituts cutanés (6 lignées). Une fois incorporées dans le microenvironnement cutané, les tumeurs répondent à un traitement chronique (12 jours) au vemurafenib de façon dose-dépendante (diminution de la prolifération des cellules de mélanome et augmentation significative de l'apoptose). Par la suite, des cellules immunitaires humaines primaires (dérivées du sang périphérique) ont été incorporées dans la tumeur ainsi que dans le tissu environnant, résultant notamment en la présence de monocytes/macrophages (CD14+, CD163+), lymphocytes CD8+ et cellules HLA-DR+. Ces tissus avec ou sans cellules immunitaires ont été stimulés avec du lipopolysaccharide (LPS), menant à une modification de la proportion des sous-populations immunes présentes dans le modèle. Ce modèle humain répondant à des thérapies anti-cancéreuses et pouvant contenir une composante immunitaire est un outil prometteur pour l'étude du mélanome ainsi que pour l'évaluation de futures molécules en oncologie, incluant des immunothérapies. / Clinical translation of new oncology compounds can fail at different stages, including the translation from animal to human studies. To improve the predictability of preclinical testing, new in vitro human models mimicking the tumor microenvironment are needed. In skin melanoma, blood and lymphatic capillaries are key features of tumor progression, as well as immune cells. We hypothesize that it is possible to microvascularize skin substitutes with both blood and lymphatic capillaries in order to use these tissues to model and study melanoma in vitro. Our self-assembled model was produced using primary human fibroblasts, microvascular endothelial cells and keratinocytes. Two subtypes of capillary networks were present in the reconstructed skin as observed after labeling on cryosections and whole mount samples. Their morphology differs, and they were characterized by immunostaining against CD31 (pan-endothelial) and podoplanin (lymphatic endothelial cells). The ability of endothelial cells from newborn or adult to form networks was assessed. It was also confirmed that the keratinocytes can affect the capillary networks, formed by blood and lymphatic endothelial cells. The microvascularized reconstructed skin allowed to study melanoma in a human microenvironment in vitro. The melanoma model was produced by adding melanoma spheroids to the skin substitutes (with 6 melanoma cell lines). After tumor incorporation in the 3D model, it was treated chronically (12 days) with vemurafenib and displayed a dose-dependent response (significant decrease of proliferation and increase of apoptosis). The last step was to incorporate human primary blood-derived immune cells in the tumor and in the surrounding skin, leading to the presence for example monocytes/macrophages (CD14+, CD163+), CD8+ lymphocytes and HLA-DR+ cells. The different tissues were stimulated with LPS, leading to a modification of immune cell subpopulations in the model (with 4 different donors and 2 melanoma cell lines). This human melanoma model which responds to a known therapy and can include an immune component is a promising tool to study melanoma and to test new therapeutic compounds, including immunotherapies.
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Effets du sérum lors de la culture de substituts cutanés sains et psoriasiques

Gauthier, Lydia 17 April 2018 (has links)
Le sérum ajouté aux milieux de culture est connu pour être une substance difficile à contrôler en raison de la présence de facteurs variables. Le but de cette étude était de faire varier les conditions de culture en retirant le sérum lors de la montée à l'interface air-liquide et de poursuivre les observations sur la qualité des substituts cutanés sains et psoriasiques produits par la méthode d'auto-assemblage. Les résultats histologique, macroscopique et immunohistochimique des substituts sains cultivés avec ou sans sérum ne montrent aucune différence significative. Les analyses infrarouges effectuées sur ces derniers permettent d'observer que ceux cultivés en absence de sérum possèdent une meilleure organisation lipidique au niveau de la couche cornée. Par contre, l'absorption percutanée démontre des différences au regard des propriétés physico-chimiques des molécules étudiées. De plus, les substituts conçus à partir de cellules psoriasiques affichent des résultats différents lorsque le sérum est retiré. Il semble que l'apport du sérum soit davantage important lors de l'utilisation de cellules pathologiques.
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Étude des interactions entre les nerfs sensoriels et les follicules pileux dans un modèle in vitro de peau reconstruite par génie tissulaire

Gagnon, Vicky 11 April 2018 (has links)
L'objectif du présent projet était d'optimiser le modèle de peau reconstruite par génie tissulaire déjà mis au point par notre équipe afin qu'il stimule le processus de régénération nerveuse après greffe pour améliorer la récupération tactile des grands brûlés. Nous avons utilisé des follicules pileux murins et des neurones sensoriels extraits des ganglions de la racine dorsale de f?tus de souris et avons posé comme hypothèse que les poils avaient une influence positive sur la migration axonale. Une élongation vigoureuse des neurites a été détectée à l'intérieur du derme reconstruit. En présence de cellules épithéliales, il y a eu une migration préférentielle des axones vers les follicules pileux immatures implantés dans le modèle, migration qui a été suivie d'une association étroite des axones et des follicules pileux. Nous avons donc développé avec succès un modèle nous permettant d'étudier les effets de l'épiderme et des follicules pileux sur la croissance des nerfs.
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Étude de substituts et de lipides cutanés par spectroscopie RMN à l'état solide, infrarouge et Raman

Bernard, Geneviève 12 April 2018 (has links)
Les lipides de la couche cornée, la partie externe de la peau, sont connus pour jouer un rôle très important au niveau de la perméabilité de celle-ci. Une modification des propriétés de perméabilité est observée lors de certaines maladies cutanées, dont le psoriasis. La première partie du projet consistait à la caractérisation physicochimique de substituts sains et psoriasiques produits par la méthode d'auto-assemblage. Nos résultats ont permis de montrer que les substituts psoriasiques lésionnels présentent une couche cornée plus désorganisée que les contrôles. Nous avons également posé l'hypothèse que les propriétés de la peau non-lésionnelle des patients pourraient varier selon la gravité de la pathologie. De plus, des systèmes lipidiques modèles de la couche cornée ont été étudiés pour tenter d'établir le mécanisme d'action de l'acide oléique qui facilite la pénétration de molécules à travers la peau. Nos résultats démontrent une déstabilisation des membranes par l'acide oléique.
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Les protéines de soya, une voie d'avenir pour la régénération tissulaire

Curt, Sèverine 13 April 2018 (has links)
Ce travail visait à exploiter le potentiel des protéines de soya afin de concevoir et de développer des biomatériaux sous forme de biofilms aux propriétés physico-chimiques, et surtout biologiques, contrôlées. Pour ce faire, des films à base d'isolats de protéines de soya (IPS) ont été préparés à l'aide de plastifiant, le glycérol, et de différentes concentrations d'agent de réticulation, le formaldéhyde, afin d'obtenir un biomatériau favorable pour la culture de cellules cutanées (fibroblastes et kératinocytes) humaines. La toxicité des films a été testée en évaluant l'adhésion, la croissance, la prolifération et la formation d'une structure cutanée bien organisée. La biocompatibilité et l'immunogénicité des biofilms ont été étudiées grâce aux analyses de cytokines produites par les fibroblastes et les kératinocytes. Les diverses observations microscopiques ont démontré l'innocuité de tous les biofilms vis-à-vis des kératinocytes qui ont adhères. Ces biofilms n'ont aucun effet nocif sur la viabilité cellulaire. Il est intéressant de noter que ces cellules ont une prolifération croissante malgré l'augmentation de la concentration en réticulant. La prolifération des cellules cutanées est, cependant, réduite à fort pourcentage de formaldéhyde. En effet, celles-ci prolifèrent mieux sur les biofilms contenant 0 %, 1 % et 2 % de formaldéhyde comparativement à ceux contenant 3 % d'agent de réticulation. En conclusion, les biofilms à base de protéines de soya offrent un environnement favorable à l'adhésion et la croissance des kératinocytes. Les biofilms ayant le meilleur potentiel sont ceux contenant une concentration de 1 % de formaldéhyde.
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Développement par génie tissulaire d'un modèle d'étude in vitro des voies de signalisation des cellules souches du follicule pileux

Cuffley, Kristine 13 April 2018 (has links)
Au LOEX, un modèle de folliculogénèse a été caractérisé. Ce modèle consiste à incorporer des follicules pileux immatures de souris dans les peaux reconstruites par génie tissulaire. À l'aide des peaux reconstruites, nous avons comparé l'influence des cellules dermiques sur la différenciation des cellules souches des follicules pileux. La maturation in vitro des follicules pileux immatures sur les fibroblastes murins et humains a mené à l'apparition d'inclusions intradermiques. Cependant, les études de caractérisation ont révélé la présence de marqueurs de différenciation épidermique dans les kystes dérivants des follicules pileux immatures cultivés sur fibroblastes humains, contrairement à ceux cultivés sur fibroblastes murins. Ces derniers ont plutôt des caractéristiques histologiques qui ressemblent davantage aux cellules retrouvées au niveau de la gaine folliculaire externe du follicule pileux. Un dérèglement de la voie de signalisation Wnt pourrait expliquer ces phénomènes, puisque la p-caténine et le facteur Lef-l ne sont pas activés dans ces peaux reconstruites.
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Application du génie tissulaire à l'étude du système nerveux périphérique sensoriel et moteur

Gingras, Marie 12 April 2018 (has links)
Le génie tissulaire permet de reconstruire des tissus hautement physiologiques qui constituent des modèles tridimensionnels utiles à de nombreuses applications, notamment pour étudier des interactions cellules-cellules ou cellules-matrice. Notre objectif était de modéliser par génie tissulaire le système nerveux périphérique (SNP) sensoriel et moteur, afin de permettre l'étude in vivo et in vitro de la régénération nerveuse et des différents facteurs qui la favorisent, aussi bien que l'étude de la myélinisation et des diverses maladies du SNP, dans le but d'approfondir les connaissances sur ces phénomènes. Nous voulions aussi développer des méthodes permettant d'obtenir des cellules de la moelle épinière murine ainsi que des neurones humains pouvant éventuellement être utilisés dans la reconstruction tissulaire et pour l'étude du SNP. En se basant sur l'expertise déjà acquise au laboratoire, nous avons fabriqué une peau humaine reconstruite en prenant comme base une éponge de collagène et avons étudié son innervation dans un contexte in vivo chez la souris. Nos résultats ont révélé que cette peau pouvait être innervée en 2 à 4 mois par des axones en régénération et que l'invasion de cellules de Schwann précédait cette innervation. Cette peau reconstruite a été par la suite utilisée et adaptée pour développer un modèle unique de régénération nerveuse périphérique sensorielle in vitro. Des neurones sensoriels murins ont été ensemencés sur des éponges de collagène colonisées par des cellules endothéliales et/ou des fibroblastes et, dans certains cas, des kératinocytes. Une forte croissance des prolongements nerveux a été observée et l'addition de cellules endothéliales a provoqué l'association des prolongements nerveux avec les pseudocapillaires reconstruits dans le modèle. Ce modèle constitue un outil puissant pour étudier l'effet de diverses cellules et/ou molécules sur la croissance des prolongements nerveux sensoriels in vitro. Dans le but d'adapter ce modèle à l'étude des neurones moteurs, nous avons d'abord optimisé différentes techniques afin d'obtenir des neurones moteurs de la moelle épinière embryonnaire de souris. Notre méthode a permis l'obtention de populations de neurones moteurs pures à 97%. Par la suite, ces neurones ont été ensemencés sur des éponges de collagène colonisées par des cellules de Schwann et/ou des fibroblastes. Notre modèle a permis la survie, l'élongation et la maturation des prolongements des neurones moteurs. Lorsque des cellules de Schwann étaient présentes, la formation de gaines de myéline autour des prolongements nerveux a été détectée. En plus de son utilité pour des études fondamentales sur la myélinisation et la régénération nerveuse motrice, ce modèle peut être complété par l'addition d'astrocytes, de microglies et de cellules musculaires afin de mieux comprendre les maladies des neurones moteurs. Finalement, nous avons cultivé des précurseurs provenant de la peau humaine adulte et les avons différenciés en neurones matures. Les cellules en différenciation exprimaient de façon séquentielle différents marqueurs du développement normal des neurones pour finalement révéler des marqueurs neuronaux tardifs. Ceci ouvre la voie à de nombreuses applications thérapeutiques potentielles et procure de nouvelles possibilités d'études sur des neurones d'origine humaine. En conclusion, le génie tissulaire nous a permis d'effectuer des études uniques sur le comportement en coculture tridimensionnelle de plusieurs types cellulaires avec des neurones du SNP par l'utilisation des nouveaux modèles que nous avons développés. Ces derniers sont hautement flexibles et s'avéreront très utiles pour plusieurs études fondamentales en neuroscience et pour l'acquisition de nouvelles connaissances sur les diverses maladies du SNP. / Tissue engineering allows the in vitro reconstruction of highly physiological tissues which constitute three-dimensional models useful for numerous applications, particularly to study cell-cell or cell-matrix interactions. Our objective was to modelize the sensory and motor peripheral nervous System (PNS) by tissue engineering, allowing the in vivo and in vitro study of nerve regeneration and the various factors that influence it, as well as myelination and PNS diseases in the aim of looking further into our knowledge on these phenomena. Since the reconstruction of tissues begins with cell isolation, we wanted also to develop methods allowing us to obtain spinal cord cells, including motor neurons, and human neurons to eventually use them in our models. Based on the expertise acquired by our laboratory, we reconstructed a human skin using a collagen sponge and studied its in vivo innervation after graft on mice. Our results revealed that this skin can be innervated in 2 to 4 months by regenerating axons and that this innervation was preceded by Schwann cell invasion. This permissive reconstructed skin was then adapted for the development of a unique in vitro model of sensory nerve regeneration. Murine sensory neurons were seeded onto collagen sponges populated by endothelial cells and/or fibroblasts and, in certain cases, keratinocytes. A robust neurite outgrowth was observed and the addition of endothelial cells allowed the association of neurite with capillary-like tubes formed in the model. This model constitutes a powerful tool for the in vitro study of various cells and/or molecules on sensory neurite outgrowth. In the aim of adapting this system to the study of motor neurons, we optimized different techniques to obtain motor neurons from mouse embryonic spinal cord. Our method allowed the harvesting of a population of 97% pure motor neurons. Afterward, these motor neurons were seeded onto collagen sponges populated with Schwann cells and/or fibroblasts. Our model allowed the survival, neurite outgrowth and maturation of motor neurons. When Schwann cells were added, myelin formation and axon ensheathment was observed. In addition to its utility for fundamental studies on myelination and motor nerve regeneration, this model may be completed by the coculture of astrocytes, microglia and muscle cells to better understand motor neuron diseases. Finally, we cultured precursor cells from adult human skin and differentiated them into mature neurons. Differentiating cells sequentially expressed markers of normal neural development to finally reveal markers of terminally differentiated neurons. This opens the way for numerous potential therapeutic applications and provides new possibilities for the study of human neurons. In conclusion, the tissue-engineered models we developed allowed us to perform unique studies on the three-dimensional coculture comportment of many cells types with PNS neurons with the use of new models that we have developed. Those models are highly flexible and will be very useful for many fundamental neuroscience studies and for acquiring new knowledge on various PNS diseases.

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