Orientador: Alexandre Ninhaus Silveira / Banca: George Shigueki Yasui / Banca: Danilo Pedro Streit Junior / Resumo: A criopreservação é uma ferramenta biotecnológica que permite congelar e estocar, por longos períodos células, tecidos, órgãos e embriões; contudo, o sucesso desta tecnologia, para peixes, é bem estabelecida apenas para as células germinativas masculinas, conservando assim, parcialmente material genético de uma população. Desta forma objetivou-se estabelecer um eficaz protocolo de crioconservação para embriões de peixes neotropicais, visando à preservação total da bagagem genética da espécie. Utilizou-se como modelo biológico embriões de Prochilodus lineatus, que foram avaliados quanto a sua sensibilidade ao frio, à toxicidade dos crioprotetores dimetil formamida, dimetil sulfóxido, propileno glicol e glicerol, aos protocolos de resfriamento nos estágios de gastrulação e organogênese com seis e vinte somitos e a vitrificação nos estágios de organogênese com seis e vinte somitos. As amostras foram fixadas em solução de paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 2% em tampão fosfato Sorensen 0,2 M pH 7,2, incluídos em metacrilato glicol, seccionados a 3 e 5 µm de espessura e corados com hematoxilina-eosina, azul de toluidína, P.A.S. e metanil yellow. A fase embrionária de organogênese com 20 somitos foi a mais resistente ao frio e a toxicidade dos crioprotetores. Apesar das altas taxas de larvas vivas nos tratamento de resfriamento, em nenhum dos protocolos propostos obteve-se êxito na preservação das estruturas embrionárias, sendo verificado graves danos morfológicos como corpo reduzido e com sinuosidades, nadadeiras com crescimento desordenado das células, alta concentração de células necróticas na região do encéfalo, má-formação das vesículas ópticas e óticas, má-formação das narinas, fusão desordenada dos mioblastos, retração do vitelo, espaços entre as células provocadas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cryopreservation is a biotechnological tool that allows you to freeze and store cells, tissues, organs and embryos for long periods; however, the success of this technology, to the fish, it is established only from the male germ cells, preserving, partly the material of a population. Therefore the purpose was to establish an effective protocol of cryopreservation to embryos of neotropical fish, in order to preserv all the genetic load of the species. As biological model of this research it was used Prochilodus lineatus type of embryos, which were evaluated regarding to their sensibility to cold temperatures, the toxicity of cryoprotectants dimethyl formamide, dimethyl sulfoxide, propylene glycol and glycerol, also the protocols of cooling down on the gastrulation and organogenesis stages with six and twenty somites, and the vitrification on the organogenesis stages with six and twenty somites. The samples were fixed in solutions with 4% of paraformaldehyde and 2% of glutaraldehyde, Sorensen phosphate with 0.2 M pH 7.2, included in glycol methacrylate, sectioned at 3 and 5 µm of thickness and stained with hematoxylin-eosin, Blue toluidine, PAS and Metanil Yellow. The embryonic phase of organogenesis with 20 somites was the most resistant to cold and toxicity of cryoprotectants. Despite of the high rates of alived larvae founded in the cooling treatment, none of the proposed protocols succedded in the preservation of the embryonic structures, it could be seen severe morphological damages as reduction in the body and sinuous in the forms, with fins disorderly cell growth, high concentration of necrotic cells on region of the brain, malformation of the ear and eyes vesicle, malformation of the nostrils, disorderly fusion of the myoblasts, retraction of the yolk, spaces between cells caused by the formation of ice crystals... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-05Bitstream added on 2014-06-13T19:08:35Z : No. of bitstreams: 1 costa_rs_me_sjrp.pdf: 2335330 bytes, checksum: a362b3c9ff0199411e65f245cbed8903 (MD5) / A criopreservação é uma ferramenta biotecnológica que permite congelar e estocar, por longos períodos células, tecidos, órgãos e embriões; contudo, o sucesso desta tecnologia, para peixes, é bem estabelecida apenas para as células germinativas masculinas, conservando assim, parcialmente material genético de uma população. Desta forma objetivou-se estabelecer um eficaz protocolo de crioconservação para embriões de peixes neotropicais, visando à preservação total da bagagem genética da espécie. Utilizou-se como modelo biológico embriões de Prochilodus lineatus, que foram avaliados quanto a sua sensibilidade ao frio, à toxicidade dos crioprotetores dimetil formamida, dimetil sulfóxido, propileno glicol e glicerol, aos protocolos de resfriamento nos estágios de gastrulação e organogênese com seis e vinte somitos e a vitrificação nos estágios de organogênese com seis e vinte somitos. As amostras foram fixadas em solução de paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 2% em tampão fosfato Sorensen 0,2 M pH 7,2, incluídos em metacrilato glicol, seccionados a 3 e 5 µm de espessura e corados com hematoxilina-eosina, azul de toluidína, P.A.S. e metanil yellow. A fase embrionária de organogênese com 20 somitos foi a mais resistente ao frio e a toxicidade dos crioprotetores. Apesar das altas taxas de larvas vivas nos tratamento de resfriamento, em nenhum dos protocolos propostos obteve-se êxito na preservação das estruturas embrionárias, sendo verificado graves danos morfológicos como corpo reduzido e com sinuosidades, nadadeiras com crescimento desordenado das células, alta concentração de células necróticas na região do encéfalo, má-formação das vesículas ópticas e óticas, má-formação das narinas, fusão desordenada dos mioblastos, retração do vitelo, espaços entre as células provocadas... / Cryopreservation is a biotechnological tool that allows you to freeze and store cells, tissues, organs and embryos for long periods; however, the success of this technology, to the fish, it is established only from the male germ cells, preserving, partly the material of a population. Therefore the purpose was to establish an effective protocol of cryopreservation to embryos of neotropical fish, in order to preserv all the genetic load of the species. As biological model of this research it was used Prochilodus lineatus type of embryos, which were evaluated regarding to their sensibility to cold temperatures, the toxicity of cryoprotectants dimethyl formamide, dimethyl sulfoxide, propylene glycol and glycerol, also the protocols of cooling down on the gastrulation and organogenesis stages with six and twenty somites, and the vitrification on the organogenesis stages with six and twenty somites. The samples were fixed in solutions with 4% of paraformaldehyde and 2% of glutaraldehyde, Sorensen phosphate with 0.2 M pH 7.2, included in glycol methacrylate, sectioned at 3 and 5 µm of thickness and stained with hematoxylin-eosin, Blue toluidine, PAS and Metanil Yellow. The embryonic phase of organogenesis with 20 somites was the most resistant to cold and toxicity of cryoprotectants. Despite of the high rates of alived larvae founded in the cooling treatment, none of the proposed protocols succedded in the preservation of the embryonic structures, it could be seen severe morphological damages as reduction in the body and sinuous in the forms, with fins disorderly cell growth, high concentration of necrotic cells on region of the brain, malformation of the ear and eyes vesicle, malformation of the nostrils, disorderly fusion of the myoblasts, retraction of the yolk, spaces between cells caused by the formation of ice crystals... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Laura Satiko Okada Nakaghi / Coorientador: George Shigueki Yasui / Banca: Sérgio Fonseca Zaiden / Banca: Rafael Henrique Nóbrega / Banca: Flávio Vieira Meirelles / Banca: Luciano Andrade Silva / Resumo: O transplante de células germinativas primordiais (CGPs) é uma abordagem promissora para área da Aquicultura, mas para isso é necessária à compreensão dos estágios de desenvolvimento embrionário e larval como também a padronização de técnicas relacionadas à micromanipulação do embrião e de células germinativas a fim de obter com sucesso quimeras germinativas. Assim, os objetivos desta pesquisa foram avaliar o efeito de três temperaturas (22ºC, 26ºC e 30ºC) sob o desenvolvimento inicial de B. amazonicus (espécie doadora); desenvolver protocolos para micromanipulação de ovos, de células embrionárias e de criopreservação de blastômeros em Astyanax altiparanae (espécie receptora); identificar as CGPs e a rota de migração dessas células em ambas as espécies, além da produção de quimeras germinativas através do transplante de células embrionárias a fim de que a espécie receptora estéril (3n) produza gametas da espécie doadora. Para isso, os reprodutores das espécies envolvidas foram induzidos hormonalmente à reprodução, os gametas foram extrusados e fertilizados pelo método a seco. Para avaliar o desenvolvimento inicial, ovos recém-fertilizados foram distribuídos em aquários com oxigenação e temperatura controlada, coletados em momentos pré-estabelecidos e analisados sob estereomicroscópio. Para o desenvolvimento do protocolo de micromanipulação de ovos de Astyanax altiparanae, inicialmente avaliou-se a eficácia na remoção do córion em alíquotas de ovos recém-fertilizados distribuí... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Primordial germ cell (PGCs) transplantation is a promising approach for aquaculture area, but it is necessary the understanding of the embryonic and larval development stages as well as the standardization of techniques related to embryo micromanipulation and germ cells in order to get germ chimeras successfully. Thus, the aims of this research were to evaluate the effect of three temperatures (22°C, 26°C and 30°C) on the early development of Brycon amazonicus (donor species); develop protocols for micromanipulation of egg, embryonic cells and blastomeres cryopreservation in Astyanax altiparanae (host species); identify the PGCs and their migration route in both species, also producing germ chimeras through transplantation of embryonic cells to host sterile species (3n) in order to produce gametes from the donor species. For this, broodstock of the involved species were hormonally induced to reproduction, and the gametes were stripped and fertilized by dry method. To evaluate the early development, newly fertilized eggs were distributed into aquarium with controlled oxygenation and temperature, collected at pre-established times and analyzed under a stereomicroscope. For the development of micromanipulation protocol of eggs from Astyanax altiparanae, it was initially evaluated the effectiveness of removing the chorion, in aliquots of newly fertilized eggs distributed on Petri dishes containing pronase (0.05%) or trypsin (0.15%) diluted in saline solutions (Holtfreter; Characin; Ringer; Hanks, D-PBS or MEM) and it was observed the most efficient enzymatic solution without affecting the viability of the embryo. After dechorionation, the eggs were submerged the same saline solutions tested for removing the chorion, free of enzymes. To determine the best incubation saline solution, morphology and quantification of the eggs were ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-26Bitstream added on 2014-06-13T19:48:39Z : No. of bitstreams: 1 paes_mcf_me_jabo.pdf: 990222 bytes, checksum: f08cd87c9c978169ebdb4fdbd5287e5d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Astronotus ocellatus é originário da Bacia Amazônica, climatizado e disseminado, desde 1938, em açudes e rios do Nordeste brasileiro, pelo Departamento Nacional de Obras Contra as Secas. Trata-se de um peixe de grande potencial, devido a características adequadas para pesca esportiva, cultivado como ornamental e com uma carne saborosa e apreciada pela população do Norte e Nordeste do Brasil. Existem na literatura atual poucos estudos a respeito da biologia reprodutiva dessa espécie. Embora seja de desova parcelada e se reproduza bem em cativeiro, estudos de reprodução artificial têm suma importância para diversas pesquisas de biologia e desenvolvimento embrionário, cujos eventos devem ser acompanhados numa faixa de tempo conhecida e assim contribuir para uma melhor compreensão do cultivo, manejo e controle da espécie. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a resposta do Astronotus ocellatus a aplicação de dois hormônios estimuladores de reprodução (gonadodropina coriônica humana - HCG e extrato de hipófise de carpa - EHC) e estudar a estrutura, ultraestrutura e morfometria de seus ovos e larvas. Foram utilizados 16 casais de reprodutores pertencentes ao Centro de Aqüicultura da Universidade Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal (SP) e quatro desovas ocorridas naturalmente nos viveiros. Observouse que cinco das dezesseis fêmeas responderam ao estímulo hormonal, sendo três com HCG e duas com EHC. Dos machos, apenas um respondeu positivamente ao HCG. O acará-açu possui ovos demersais, adesivos, pouco resistentes ao tato, de formato ovóide pouco acentuado. “In vivo” apresentaram coloração amarelada, quando fertilizados, e branca opaca, quando não fertilizados, com grande esfera vitelina e pequeno espaço perivitelino. As desovas apresentaram ovos com valores médios variando de 1,75±0,056 a... / Astronotus ocellatus is a fish from the Amazon Basin, adapted and widely reared since 1938 in ponds and rivers of Brazilian northeast region by the Departamento Nacional de Obras Contra as Secas. This fish has a great potential due to appropriate characteristics for sporting fishing, reared as ornamental and owning a very tasty meat being appreciate by the people in north and northeast regions of Brazil. Despite having all these adjectives for aquaculture there are a few studies about reproductive biology of this species. Although spawning does not occur at once and reproduction in captivity is well successful, studies about artificial reproduction are extremely important for several researches in biology and early embryonic development of which events must be followed in a known lack of time and like this to contribute for a better understanding of rear conditions, management and control of the species. Therefore, this present research aimed to assess the Astronotus ocellatus responses to administration of two kinds of reproductive hormones (Human Chorionic Gonadotropin - HCG and carp hypophysis extract – CHE) and studying the structure, ultrastructure and morphometry of its eggs and larvae. Sixteen couples from Centro de Aqüicultura of Universidade Estadual Paulista, Campus of Jaboticabal (SP) and four spawnings occurred naturally in ponds were also catched. Five of sixteen females responded to hormonal stimuli, three of them with HCG and two with CHE. In relation to males, only one responded favorably to HCG. Acará-açu females have demersal and adhesive eggs, somewhat resistant to the touch, discreet egg shape-like, yellowish colour “in vivo” and when fertilized and white opalescent without fertilization, with a large vitelline sphere and a small space between yolk and chorion. The spawnings presented eggs with average values of 1,75±0,056 ...(Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-24Bitstream added on 2014-06-13T20:48:51Z : No. of bitstreams: 1 lopes_ts_me_jabo.pdf: 688516 bytes, checksum: 27e94cbe3ca54f1add6bd864e9eea47c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O objetivo do trabalho foi acompanhar os efeitos durante o resfriamento, em quatro estádios de desenvolvimento embrionário de pacu, Piaractus mesopotamicus, em dois tempos de estocagem, seis e 10 horas. Embriões em quatro estádios de desenvolvimento (blastoderme, 64 células - 1,4-horas pós-fertilização, hpf; 25% do movimento de epibolia - 5,2-hpf; fechamento do blastóporo – 8-hpf e; aparecimento da vesícula óptica - 13,3-hpf) foram expostos a uma solução crioprotetora contendo metanol (10%) e sacarose (0,5M). A seguir, os embriões passaram por curva de resfriamento de 1°C por minuto até -8°C, onde foram mantidos nos dois períodos de estocagem. Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado, as taxas de eclosão dos embriões foram avaliados para cada tratamento, com seis repetições, comparando-se com o controle que não foi resfriado. O número total de larvas estimadas para as duas primeiras fases do desenvolvimento ontogenético (1,4- e 5,2- hpf) foi estatisticamente menor que nas demais fases. Entretanto, os estádios de 8 e 13,3- hpf não diferiram entre si (49,90%±6,71 e 55,24%±6,71), respectivamente, encontrando-se mais próximas ao controle (90,67%±6,56). Além disso, a permeabilidade das membranas, estimada através do diâmetro dos embriões, variou estatisticamente do controle para seis e 10 horas de estocagem, quando utilizado os estádios de 1,4 e 5,2-hpf, enquanto para os demais não houve diferença. Da mesma forma, pode-se verificar que houve correlação negativa entre o número total de larvas e o diâmetro do embrião. Sendo assim, a utilização dos estádios embrionários de 8 e 13,3-hpf são os mais recomendados para o resfriamento de embriões de pacu estocados até 10 horas, a -8°C. / The objective of this research was to verify the effects of cooling of embryos of pacu, Piaractus mesopotamicus, in four stages of development, for two stocking periods. The stages of embryo development were: at blastoderm, ~64 cells - 1.4 hours after fertilization (haf); at 25% of the epiboly movement - 5.2 haf; at blastoporous closing - 8.0 haf; and at optical vesicle appearing - 13.3 haf. Embryos were exposed to a cryoprotectant solution containing methanol (10%) and sucrose (0.5M). After that, embryos were submitted to a cooling curve (-1oC/min) until -8oC and then kept at -8oC for six or ten hours. Also, for each stage of embryo development a control group with not cooled embryos was used to compare the eclosion rates. The total number of larvae estimated for the first two stages of ontogenetic development (1.4 and 5.2-haf) was lower compared to the other stages. There was no difference for the total number of larvae between the stages 8.0 e 13.3-haf (49.90%±6.71 and 55.24%±6.71, respectively). Therefore, the utilization of the embryonary stages of 8.0 and 13.3-haf are recommended for cooling pacu embryos stored up to 10 hours at -8 ° C.

Resumo: O objetivo do trabalho foi acompanhar os efeitos durante o resfriamento, em quatro estádios de desenvolvimento embrionário de pacu, Piaractus mesopotamicus, em dois tempos de estocagem, seis e 10 horas. Embriões em quatro estádios de desenvolvimento (blastoderme, 64 células - 1,4-horas pós-fertilização, hpf; 25% do movimento de epibolia - 5,2-hpf; fechamento do blastóporo - 8-hpf e; aparecimento da vesícula óptica - 13,3-hpf) foram expostos a uma solução crioprotetora contendo metanol (10%) e sacarose (0,5M). A seguir, os embriões passaram por curva de resfriamento de 1°C por minuto até -8°C, onde foram mantidos nos dois períodos de estocagem. Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado, as taxas de eclosão dos embriões foram avaliados para cada tratamento, com seis repetições, comparando-se com o controle que não foi resfriado. O número total de larvas estimadas para as duas primeiras fases do desenvolvimento ontogenético (1,4- e 5,2- hpf) foi estatisticamente menor que nas demais fases. Entretanto, os estádios de 8 e 13,3- hpf não diferiram entre si (49,90%±6,71 e 55,24%±6,71), respectivamente, encontrando-se mais próximas ao controle (90,67%±6,56). Além disso, a permeabilidade das membranas, estimada através do diâmetro dos embriões, variou estatisticamente do controle para seis e 10 horas de estocagem, quando utilizado os estádios de 1,4 e 5,2-hpf, enquanto para os demais não houve diferença. Da mesma forma, pode-se verificar que houve correlação negativa entre o número total de larvas e o diâmetro do embrião. Sendo assim, a utilização dos estádios embrionários de 8 e 13,3-hpf são os mais recomendados para o resfriamento de embriões de pacu estocados até 10 horas, a -8°C. / Abstract: The objective of this research was to verify the effects of cooling of embryos of pacu, Piaractus mesopotamicus, in four stages of development, for two stocking periods. The stages of embryo development were: at blastoderm, ~64 cells - 1.4 hours after fertilization (haf); at 25% of the epiboly movement - 5.2 haf; at blastoporous closing - 8.0 haf; and at optical vesicle appearing - 13.3 haf. Embryos were exposed to a cryoprotectant solution containing methanol (10%) and sucrose (0.5M). After that, embryos were submitted to a cooling curve (-1oC/min) until -8oC and then kept at -8oC for six or ten hours. Also, for each stage of embryo development a control group with not cooled embryos was used to compare the eclosion rates. The total number of larvae estimated for the first two stages of ontogenetic development (1.4 and 5.2-haf) was lower compared to the other stages. There was no difference for the total number of larvae between the stages 8.0 e 13.3-haf (49.90%±6.71 and 55.24%±6.71, respectively). Therefore, the utilization of the embryonary stages of 8.0 and 13.3-haf are recommended for cooling pacu embryos stored up to 10 hours at -8 ° C. / Orientadora: Elizabeth Romagosa / Coorientador: DaniloPedro Streit Junior / Banca: Luis David Solis Murgas / Banca: Sérgio Ricardo Batlouni / Mestre

Orientador: Laura Satiko Okada Nakaghi / Banca: Hugo Pereira Godinho / Banca: Alexandre Ninhaus Silveira / Resumo: O Astronotus ocellatus é originário da Bacia Amazônica, climatizado e disseminado, desde 1938, em açudes e rios do Nordeste brasileiro, pelo Departamento Nacional de Obras Contra as Secas. Trata-se de um peixe de grande potencial, devido a características adequadas para pesca esportiva, cultivado como ornamental e com uma carne saborosa e apreciada pela população do Norte e Nordeste do Brasil. Existem na literatura atual poucos estudos a respeito da biologia reprodutiva dessa espécie. Embora seja de desova parcelada e se reproduza bem em cativeiro, estudos de reprodução artificial têm suma importância para diversas pesquisas de biologia e desenvolvimento embrionário, cujos eventos devem ser acompanhados numa faixa de tempo conhecida e assim contribuir para uma melhor compreensão do cultivo, manejo e controle da espécie. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a resposta do Astronotus ocellatus a aplicação de dois hormônios estimuladores de reprodução (gonadodropina coriônica humana - HCG e extrato de hipófise de carpa - EHC) e estudar a estrutura, ultraestrutura e morfometria de seus ovos e larvas. Foram utilizados 16 casais de reprodutores pertencentes ao Centro de Aqüicultura da Universidade Estadual Paulista, Campus de Jaboticabal (SP) e quatro desovas ocorridas naturalmente nos viveiros. Observouse que cinco das dezesseis fêmeas responderam ao estímulo hormonal, sendo três com HCG e duas com EHC. Dos machos, apenas um respondeu positivamente ao HCG. O acará-açu possui ovos demersais, adesivos, pouco resistentes ao tato, de formato ovóide pouco acentuado. "In vivo" apresentaram coloração amarelada, quando fertilizados, e branca opaca, quando não fertilizados, com grande esfera vitelina e pequeno espaço perivitelino. As desovas apresentaram ovos com valores médios variando de 1,75±0,056 a ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Astronotus ocellatus is a fish from the Amazon Basin, adapted and widely reared since 1938 in ponds and rivers of Brazilian northeast region by the Departamento Nacional de Obras Contra as Secas. This fish has a great potential due to appropriate characteristics for sporting fishing, reared as ornamental and owning a very tasty meat being appreciate by the people in north and northeast regions of Brazil. Despite having all these adjectives for aquaculture there are a few studies about reproductive biology of this species. Although spawning does not occur at once and reproduction in captivity is well successful, studies about artificial reproduction are extremely important for several researches in biology and early embryonic development of which events must be followed in a known lack of time and like this to contribute for a better understanding of rear conditions, management and control of the species. Therefore, this present research aimed to assess the Astronotus ocellatus responses to administration of two kinds of reproductive hormones (Human Chorionic Gonadotropin - HCG and carp hypophysis extract - CHE) and studying the structure, ultrastructure and morphometry of its eggs and larvae. Sixteen couples from Centro de Aqüicultura of Universidade Estadual Paulista, Campus of Jaboticabal (SP) and four spawnings occurred naturally in ponds were also catched. Five of sixteen females responded to hormonal stimuli, three of them with HCG and two with CHE. In relation to males, only one responded favorably to HCG. Acará-açu females have demersal and adhesive eggs, somewhat resistant to the touch, discreet egg shape-like, yellowish colour "in vivo" and when fertilized and white opalescent without fertilization, with a large vitelline sphere and a small space between yolk and chorion. The spawnings presented eggs with average values of 1,75±0,056 ...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre