Submitted by Rayssa Zanatta (zanatta.rayssa@gmail.com) on 2017-01-20T11:01:00Z No. of bitstreams: 1 Rayssa Zanatta_tese final.pdf: 4306038 bytes, checksum: 1af4bc826fba07fc01cc2419f5a0c51d (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-01-24T16:33:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 zanatta_rf_dr_sjc.pdf: 4306038 bytes, checksum: 1af4bc826fba07fc01cc2419f5a0c51d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-24T16:33:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 zanatta_rf_dr_sjc.pdf: 4306038 bytes, checksum: 1af4bc826fba07fc01cc2419f5a0c51d (MD5) Previous issue date: 2016-12-08 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A erosão dental é um processo multifatorial que envolve a desmineralização do esmalte/dentina pela ação química de ácidos extrínsecos ou intrínsecos. A película adquirida é um filme, livre de bactérias, que cobre os dentes e atua como barreira de difusão ou membrana permeável seletiva, prevenindo o contato direto de ácidos com a superfície dos dentes. Os dentifrícios, normalmente usados no controle do biofilme bucal, possuem agentes tensoativos, que podem influenciar na adsorção de proteínas salivares, e atuar diretamente na formação da película adquirida e na liberação de fluoretos para o meio bucal. Assim, verificou-se a ação destes agentes na formação e proteção da película adquirida, sua interação com fluoreto de sódio (NaF) no esmalte, e consequentemente sua interferência na proteção contra a erosão dental. Foram testados três tensoativos (Lauril Sulfato de Sódio - LSS, Tween 20 – T20 e Cocoamidopropil Betaína - CAPB), em duas concentrações (1,0% e 1,5%). A água foi utilizada como controle negativo. Amostras de esmalte bovino foram submetidas a um modelo de des/remineralização com ácido cítrico durante 5 dias, imersão em saliva humana para formação de película adquirida e em soluções com os tensoativos testados, associados ou não ao NaF (275 ppm). A solução de NaF foi utilizada como controle positivo. A análise da energia de superfície do esmalte foi determinada por goniometria e a formação de película adquirida quantificada por espectroscopia (FTIR). A erosão inicial foi determinada por microdureza no primeiro dia (mensurada após o primeiro ácido, após o tratamento e após o segundo ácido) e a perda de estrutura de esmalte foi definida por perfilometria ao final de cinco dias de ciclo. Ainda, foi quantificado o flúor solúvel em KOH adsorvido na superfície do esmalte com eletrodo específico. Os resultados de goniometria mostraram que apenas o LSS e o CAPB em ambas concentrações diminuíram o ângulo de contato entre a água e o esmalte. Quanto à quantificação da formação de película, não foi possível verificar diferença significante entre os grupos testados. Com relação à erosão, os dados de dureza mostraram que os tensoativos, independente da concentração, não interferiram no reendurecimento do esmalte, porém o LSS a 1% e 1,5% interferiu no potencial de proteção do NaF, e o T20 a 1% e 1,5% e o CAPB a 1,5% protegeram o esmalte, porém não foram superiores ao efeito do NaF. Já a análise perfilometria mostrou que o T20 a 1% resultou em menores valores de perda que a 1,5%, e ainda que o CAPB 1% e 1,5% foi capaz de proteger comparado ao controle negativo, no entanto nenhum agente associado ao NaF protegeu mais do que o controle positivo. Os dados da concentração de flúor KOH-solúvel indicaram que os tensoativos reduziram a adsorção do CaF2 ao esmalte. Conclui-se que os tensoativos testados reduziram o ângulo de contato da água com o esmalte (exceção do T20). O LSS reduziu o potencial protetor do NaF e da película na erosão inicial e nenhum agente testado interferiu na capacidade protetora do NaF contra a progressão do desgaste erosivo. / Dental erosion can be defined as a multifactorial process that induces tooth dissolution by intrinsic or extrinsic acids. Acquired pellicle is a film, free from bacteria, that covers all tooth tissues, and acts as a selective membrane that prevents direct contact of the acids with enamel/dentin surface. Dentifrices, frequently used in the biofilm control, have some constituents, such as surfactant agents, which influence on the adsorption of salivary proteins, and may directly affect the formation of salivary pellicle and the fluoride release on oral environment. Thus, it was verified the influence of surfactants over the protective effect of the acquired pellicle, and on the interaction of fluoride with enamel. Three different surfactants were tested (Sodium Lauryl Sulphate - SLS, Tween 20 – T20 and Cocoamidopropyl Betaine - CAPB), in 2 different concentrations (1.0% and 1.5%). Water was used as negative control. Bovine enamel samples were selected and submitted to an in vitro des/remineralization model with citric acid during 5 days, immersion in human saliva for acquired pellicle formation and immersion in the surfactant solutions, associated or not with sodium fluoride (NaF – 275ppm). A NaF solution was used as positive control. The surface wettability was determined by contact angle between water and the enamel using a tensiometer, and the acquired enamel pellicle formation was assessed using a spectrophotometer (FTIR). Initial erosion was defined by microhardness at the first cycle day (measured after the first acid, after treatment and after the second acid), and the structure loss was determined by profilometry. The KOH-soluble fluoride was also quantified after the end of the cycle. The surface energy analysis showed that only SLS and CAPB in both concentrations decreased the contact angle between enamel and water. Regarding the proteins quantification, no differences were found between the groups. Concerning initial erosion, microhardness data showed that all surfactants, in both concentrations, did not interfered with enamel remineralization, but 1% and 1,5% SLS interfered on NaF protective effect. 1% and 1,5% T20 and 1,5%, CAPB despite presenting some protective effect against new acid challenge, did not promote the same protection as NaF. Profilometry results showed that the 1% T20 promoted lower surface loss than at 1.5%, while 1% and 1.5% CAPB protected enamel compared to negative control group. However, no agent associated with NaF showed higher protection than the positive control. KOH-soluble fluoride analysis showed that all surfactants reduced the CaF2 adsorption over enamel surface. It can be concluded that the surfactants tested reduced the enamel contact angle (except for T20). The SLS decreased the protective potential of NaF associated with the pellicle in initial erosion and no agent tested interfered with the protective effect of NaF on enamel erosive wear. / FAPESP: 2013/12069-5

Determinação da composição da Película Adquirida formada sobre o esmalte humano in vivo e da sua modificação após estimulação química e mecânica do fluxo salivar: estudo proteômico. Todas as superfícies sólidas expostas na cavidade bucal são cobertas por uma camada proteinácea denominada película adquirida do esmalte. Trata-se de um filme orgânico, livre de bactérias, que recobre os tecidos dentários e é composto basicamente por proteínas. Diversos trabalhos têm se concentrado na caracterização e no impacto protetor da película adquirida formada sobre a superfície do esmalte. Porém tanto para a película adquirida formada sobre o esmalte in situ quanto in vivo, as considerações sobre o tipo de saliva que contribuiu para sua formação são bastante limitadas, senão inexistentes. Com base nisto, o objetivo deste estudo foi comparar o perfil proteico em películas adquiridas formadas in vivo sobre o esmalte humano em condições de repouso, bem como analisar as películas formadas após estimulação salivar mecânica e química, através de espectrometria de massa. Os experimentos foram realizados por três dias consecutivos, seguindo um delineamento cruzado. Em cada dia, os voluntários (n=9) receberam uma meticulosa profilaxia dentária. Em seguida, aguardaram por duas horas para que a película adquirida fosse formada naturalmente sobre o esmalte (saliva não estimulada Grupo 1, controle). Após o período em questão, cada quadrante da boca foi enxaguado, seco e a película adquirida foi então coletada com auxílio de um papel filtro de eletrodos (electrode wick filter paper, Bio-Rad) embebido em ácido cítrico 3%. Os procedimentos descritos acima foramrepetidos em outros dois dias consecutivos para cada voluntário, sendo que em um dos dias os voluntários estimularam o fluxo salivar mecanicamente (saliva com estimulação mecânica Grupo 2), através da mastigação de Parafilm®, durante o mesmo período de tempo. Em outro dia, o fluxo salivar foi estimulado através de gotejamento de ácido cítrico 2% (p/v) em ambas as bordas laterais da língua, em intervalos de 1 minuto, durante o mesmo período de tempo. O restante dos procedimentos foi repetido como descrito. Para cada grupo, foi feito um pool com os papéis de filtro dos 9 voluntários. Após extração e digestão das proteínas presentes nos papéis, foi realizada a separação dos peptídeos por nano-HPLC (nano- Cromatografia Líquida de Alta Performace) interligada a um espectrômetro de massa (LC-ESI-MS/MS). Os dados MS/MS obtidos foram processados e pesquisados junto ao banco de dados de proteínas humanas (UniProt and TrEMBL, Swiss Institute of Bioinformatics) utilizando algorítimo SEQUEST no software Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Scientific). Foram detectadas no total 115 proteínas/peptídeos identificados por pelo menos dois peptídeos. Todos apareceram em pelo menos três corridas de cada Grupo, sendo que 51 proteínas apareceram nos três grupos. O perfil protéico da película adquirida foi semelhante em todos os grupos, embora tenham sido detectadas proteínas específicas para cada grupo. Utilizando a tecnologia de quantificação SIEVE, foi observado que a concentração de proteínas foi maior nos grupos nos quais houve estimulação salivar (2 e 3). Os resultados sugerem que a estimulação do fluxo salivar, tanto mecânica quanto química, promove a formação de película adquirida com maior concentração de proteínas protetoras como anidrase carbônica, mucinas, cistatinas e imunoglobulinas, o que pode resultar num maior caráter protetor para o esmalte dentário. Contudo, são necessários mais estudos para se compreender por completo o complexo processo de formação (mediante variadas condições) e as dinâmicas funções deste importante tegumento. / All solid surfaces exposed in the oral cavity are covered by a closely adherent protein film termed the acquired enamel pellicle (AEP). It is an organic, bacteria-free film that overlies the hard dental tissues and is basically composed by glycoproteins and proteins. Recently, many studies have focused on the characterization and the protector impact of the acquired pellicle formed over the enamel surface. However either for the in situ or in vivo formed AEP, information regarding the type of saliva which has contributed for its formation is quite limited, or even inexistent. Based on this, the aim of the present study was to compare the protein profile of acquired pellicles formed in vivo over the human enamel surfaces under resting condition and also to analyze the protein profile of the pellicles formed after mechanical and chemical salivary flow stimulation using mass spectrometry. The experiments were performed on three consecutive days, following a crossover design. On each day, the volunteers (n=9) received a meticulous dental prophylaxis and then waited for two hours to allow the AEP formation (non stimulated saliva - group 1). After the time span, each quadrant of the mouth was rinsed with water, dried by air spray and then the collection of the AEP was carried out using a filter paper (electrode wick filter paper, Bio-Rad) presoaked in 3% citric acid The procedures described above were repeated on two other consecutive days for each volunteer. However, in one day their salivary flow was mechanically stimulated (mechanical stimulation Group 2) by chewing on Parafilm® during the same period of time. In another day, the salivary flow was chemically stimulated (Chemical stimulation Group 3) by 2% citric acid drops on each side of the tongue, once per minute, for the same period of time. For each group, a pool with the wick filters from all 9 volunteers was made. After the extraction and digestion of the proteins from the paper strips, peptide separation and mass spectrometric analyses were carried out with a nano-HPLC Proxeon linked to mass spectrometer (LC-ESI-MS/MS). The obtained MS/MS spectra were searched against human protein databases (UniProt and TrEMBL, Swiss Institute of Bioinformatics) using SEQUEST algorithm in Proteome Discoverer 1.3 software (Thermo Scientific). The combination of all 3 experiments yielded a total of 115 proteins/peptides identified by at least two peptides. All proteins were identified in at least three runs at each Group fifty-one proteins were found in all three Groups. The protein profile of the AEP observed in each study group was similar, but all groups presented specific proteins. Using the SIEVE quantification technology, it was observed that the amount of proteins that compose the AEP was greater in the groups in which the salivary stimulation was performed (2 and 3). The data suggest that salivary flow stimulation, either mechanical or chemical/gustatory, promotes the formation of AEP with higher concentration of protective proteins, such as carbonic anhydrase, mucins, cystatins and immunoglobulins, which may result with a greater protective character for the tooth enamel. However, further studies are necessary to fully understand the complex process of formation (under various conditions) and the dynamic functions of this important integument.

Determinação da composição da Película Adquirida formada sobre o esmalte humano in vivo e da sua modificação após estimulação química e mecânica do fluxo salivar: estudo proteômico. Todas as superfícies sólidas expostas na cavidade bucal são cobertas por uma camada proteinácea denominada película adquirida do esmalte. Trata-se de um filme orgânico, livre de bactérias, que recobre os tecidos dentários e é composto basicamente por proteínas. Diversos trabalhos têm se concentrado na caracterização e no impacto protetor da película adquirida formada sobre a superfície do esmalte. Porém tanto para a película adquirida formada sobre o esmalte in situ quanto in vivo, as considerações sobre o tipo de saliva que contribuiu para sua formação são bastante limitadas, senão inexistentes. Com base nisto, o objetivo deste estudo foi comparar o perfil proteico em películas adquiridas formadas in vivo sobre o esmalte humano em condições de repouso, bem como analisar as películas formadas após estimulação salivar mecânica e química, através de espectrometria de massa. Os experimentos foram realizados por três dias consecutivos, seguindo um delineamento cruzado. Em cada dia, os voluntários (n=9) receberam uma meticulosa profilaxia dentária. Em seguida, aguardaram por duas horas para que a película adquirida fosse formada naturalmente sobre o esmalte (saliva não estimulada Grupo 1, controle). Após o período em questão, cada quadrante da boca foi enxaguado, seco e a película adquirida foi então coletada com auxílio de um papel filtro de eletrodos (electrode wick filter paper, Bio-Rad) embebido em ácido cítrico 3%. Os procedimentos descritos acima foramrepetidos em outros dois dias consecutivos para cada voluntário, sendo que em um dos dias os voluntários estimularam o fluxo salivar mecanicamente (saliva com estimulação mecânica Grupo 2), através da mastigação de Parafilm®, durante o mesmo período de tempo. Em outro dia, o fluxo salivar foi estimulado através de gotejamento de ácido cítrico 2% (p/v) em ambas as bordas laterais da língua, em intervalos de 1 minuto, durante o mesmo período de tempo. O restante dos procedimentos foi repetido como descrito. Para cada grupo, foi feito um pool com os papéis de filtro dos 9 voluntários. Após extração e digestão das proteínas presentes nos papéis, foi realizada a separação dos peptídeos por nano-HPLC (nano- Cromatografia Líquida de Alta Performace) interligada a um espectrômetro de massa (LC-ESI-MS/MS). Os dados MS/MS obtidos foram processados e pesquisados junto ao banco de dados de proteínas humanas (UniProt and TrEMBL, Swiss Institute of Bioinformatics) utilizando algorítimo SEQUEST no software Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Scientific). Foram detectadas no total 115 proteínas/peptídeos identificados por pelo menos dois peptídeos. Todos apareceram em pelo menos três corridas de cada Grupo, sendo que 51 proteínas apareceram nos três grupos. O perfil protéico da película adquirida foi semelhante em todos os grupos, embora tenham sido detectadas proteínas específicas para cada grupo. Utilizando a tecnologia de quantificação SIEVE, foi observado que a concentração de proteínas foi maior nos grupos nos quais houve estimulação salivar (2 e 3). Os resultados sugerem que a estimulação do fluxo salivar, tanto mecânica quanto química, promove a formação de película adquirida com maior concentração de proteínas protetoras como anidrase carbônica, mucinas, cistatinas e imunoglobulinas, o que pode resultar num maior caráter protetor para o esmalte dentário. Contudo, são necessários mais estudos para se compreender por completo o complexo processo de formação (mediante variadas condições) e as dinâmicas funções deste importante tegumento. / All solid surfaces exposed in the oral cavity are covered by a closely adherent protein film termed the acquired enamel pellicle (AEP). It is an organic, bacteria-free film that overlies the hard dental tissues and is basically composed by glycoproteins and proteins. Recently, many studies have focused on the characterization and the protector impact of the acquired pellicle formed over the enamel surface. However either for the in situ or in vivo formed AEP, information regarding the type of saliva which has contributed for its formation is quite limited, or even inexistent. Based on this, the aim of the present study was to compare the protein profile of acquired pellicles formed in vivo over the human enamel surfaces under resting condition and also to analyze the protein profile of the pellicles formed after mechanical and chemical salivary flow stimulation using mass spectrometry. The experiments were performed on three consecutive days, following a crossover design. On each day, the volunteers (n=9) received a meticulous dental prophylaxis and then waited for two hours to allow the AEP formation (non stimulated saliva - group 1). After the time span, each quadrant of the mouth was rinsed with water, dried by air spray and then the collection of the AEP was carried out using a filter paper (electrode wick filter paper, Bio-Rad) presoaked in 3% citric acid The procedures described above were repeated on two other consecutive days for each volunteer. However, in one day their salivary flow was mechanically stimulated (mechanical stimulation Group 2) by chewing on Parafilm® during the same period of time. In another day, the salivary flow was chemically stimulated (Chemical stimulation Group 3) by 2% citric acid drops on each side of the tongue, once per minute, for the same period of time. For each group, a pool with the wick filters from all 9 volunteers was made. After the extraction and digestion of the proteins from the paper strips, peptide separation and mass spectrometric analyses were carried out with a nano-HPLC Proxeon linked to mass spectrometer (LC-ESI-MS/MS). The obtained MS/MS spectra were searched against human protein databases (UniProt and TrEMBL, Swiss Institute of Bioinformatics) using SEQUEST algorithm in Proteome Discoverer 1.3 software (Thermo Scientific). The combination of all 3 experiments yielded a total of 115 proteins/peptides identified by at least two peptides. All proteins were identified in at least three runs at each Group fifty-one proteins were found in all three Groups. The protein profile of the AEP observed in each study group was similar, but all groups presented specific proteins. Using the SIEVE quantification technology, it was observed that the amount of proteins that compose the AEP was greater in the groups in which the salivary stimulation was performed (2 and 3). The data suggest that salivary flow stimulation, either mechanical or chemical/gustatory, promotes the formation of AEP with higher concentration of protective proteins, such as carbonic anhydrase, mucins, cystatins and immunoglobulins, which may result with a greater protective character for the tooth enamel. However, further studies are necessary to fully understand the complex process of formation (under various conditions) and the dynamic functions of this important integument.

A película adquirida (PA) é um filme formado pela adsorção seletiva de proteínas, glicoproteínas e lipídeos à superfície dentária. A presença de proteínas na PA forma uma interface protetora sobre a superfície do dente, participando em todos os eventos interfaciais que ocorrem na cavidade bucal, tais como des- e remineralização, lubrificação das superfícies dos dentes, e aderência bacteriana. Com o advento da proteômica, tem havido um aumento considerável no conhecimento acerca do perfil proteico de PAs adquiridas formadas sobre o esmalte dentário, em diferentes situações, mas nenhum trabalho até o momento descreveu o perfil proteômico de PAs formadas sobre a dentina. Este estudo foi pioneiro em comparar o perfil proteico de PAs formadas in situ sobre o esmalte e a dentina, nos tempos de 10 minutos e 2 horas, utilizando análise proteômica quantitativa livre de marcadores. Os experimentos foram realizados por três dias consecutivos. Em cada dia, os 9 voluntários receberam profilaxia dentária e em seguida utilizaram um aparelho vestibular com 6 blocos de esmalte e 6 de dentina humanos por 10 minutos ou 2 horas. Após esses períodos, a PA formada era coletada com auxílio de um papel filtro de eletrodos embebido em ácido cítrico 3%. Para as análises foi realizado um pool com os papéis dos 9 voluntários de todos os dias, para cada substrato e tempo de formação. Após a extração e digestão das proteínas, a separação dos peptídeos foi realizada por nano-HPLC (nano-Cromatografia Líquida de Alta Performace), interligada a um espectrômetro de massa (nLC-ESI-MS/MS). Os dados MS/MS obtidos foram processados e pesquisados em bancos de dados de proteínas humanas (UniProt e TrEMBL), utilizando o algoritmo SEQUEST no software Proteome Discoverer 1.3. Para a PA formada sobre o esmalte, foram identificadas 160 e 64 proteínas, nos tempos de formação de 10 minutos e 2 horas, respectivamente. Os respectivos números de proteínas identificadas para a dentina foram 86 e 52, respectivamente. Nos tempos de 10 minutos e 2 horas, respectivamente, 25 e 11 proteínas foram comuns a ambos os substratos e foram submetidas à quantificação livre de marcadores (SIEVE), revelando que a maioria das proteínas com diferença de expressão entre os dois substratos teve sua expressão aumentada na dentina. Foram identificadas ainda, no tempo de 10 minutos de formação da PA, 135 e 61 proteínas exclusivas ao esmalte ou à dentina, respectivamente. O número correspondente de proteínas exclusivas para o tempo de 2 horas foi de 53 e 41 proteínas, para o esmalte e dentina, respectivamente. Dentre as proteínas exclusivas da dentina, foram identificadas várias proteínas relacionadas ao complexo cálcio/calmodulina, assim como proteínas associadas à tumorigênese e à fosforilação/desfosforilação de proteínas. Em adição, muitas das proteínas identificadas no presente estudo, tanto para o esmalte quanto para a dentina, ainda não foram caracterizadas e, portanto, não têm função conhecida na PA. Sua caracterização e estudos funcionais futuros poderão trazer novos horizontes no entendimento da importância da PA para a proteção da estrutura dentária, bem como do papel da PA como sítio de biomarcadores para doenças bucais e sistêmicas. / The acquired pellicle (AP) is a film that results from selective adsorption of proteins, glicoproteins and lipids on the tooth surface. The presence of proteins in the AP forms a protective interface on the tooth surface that participates in all the surface events occurring in the oral cavity, such as de- and remineralization, lubrification of the tooth surfaces and bacterial adherence. With the advent of Proteomics, considerable increase in the knowledge of the protein profile of the AP formed on tooth enamel, under different circunstances, has been observed. However, so far the proteomic profile of the AP formed on dentin has not been described. This is the first study to compare the proteomic profile of APs formed in situ for 10 minutes and 2 hours, on enamel and dentin, using quantitative label-free proteomics. The experiments were conducted for 3 consecutive days. Each day, 9 volunteers were submitted to dental prophylaxis and in sequence wore a vestibular device containing 6 human enamel and 6 human dentin blocks for 10 minutes or 2 hours. After these periods, the PA formed was collected with an electrode filter paper soaked in 3% citric acid. The papers from the 9 volunteers, for each substrate and time of pellicle formation were pooled and used for analysis. After protein extraction and digestion, peptides were separated by nano-HPLC (High-performance liquid chromatography) coupled to a mass spectrometer (nLC-ESI- MS/MS). The obtained MS/MS spectra were searched against human protein databases (UniProt and TrEMBL) using SEQUEST algorithm in Proteome Discoverer 1.3 software. For the AP formed on enamel, 160 and 64 proteins were identified for the times of pellicle formation of 10 minutes and 2 hours, respectively. The respective numbers of identified proteins for dentin were 86 and 52, respectively. For the times of 10 minutes and 2 hours, respectively, 25 and 11 proteins were common to both substrates. They were submitted to label-free quantification, which revealed that most of the proteins with differential expression were overexpressed in the dentin. For APs formed for 10 minutes, 135 and 61 proteins were identified exclusively for enamel or dentin, respectively. The corresponding number for the 2-hour APs was 53 and 41 proteins, respectively. Among the proteins identified exclusively in dentin, many proteins related with calcium/calmodulin complex, as well as proteins associated with tumorigenesis and protein phosphorylation/dephosphorylation were found. In addition, many of the identified proteins, both for enamel and dentin, remain uncharacterized and, therefore have no described function in the AP. In the future, their characterization and functional studies might open new avenues for the understanding of the importance of the AP for the protection of the dental structure, as well as for the use of the AP as a site for biomarkers of oral and systemic diseases.

O objetivo deste trabalho foi analisar as mudanças no perfil protéico em películas adquiridas formadas in situ, em diferentes tempos, sobre o esmalte e sobre a dentina humana após a exposição a dois tipos de ácido: lático e cítrico. Foram utilizados 162 blocos de esmalte e 162 blocos de dentina humana (3X3 mm). Os experimentos foram realizados em três dias consecutivos. Em cada dia, os voluntários (n=9) utilizavam um dispositivo mandibular contendo 6 blocos de esmalte e 6 blocos de dentina. Na sequência, os voluntários permaneceram com o dispositivo na cavidade bucal por 10 ou 120 minutos para formação de película adquirida. Os blocos foram então imersos em ácido cítrico (1%, pH 2,5) ou ácido lático (0,1 M pH 4,8) ou água deionizada por 20 segundos. Na sequência, a película foi removida com um papel de filtro umedecido em ácido cítrico a 3%. Este procedimento foi repetido por mais dois dias adicionais e foi confeccionado um pool com os papeis de filtro obtidos dos 9 voluntários, para cada tipo de substrato, tempo de coleta e meio de imersão. Após extração das proteínas, as mesmas foram submetidas à cromatografia líquida de fase reversa interligada a um espectrômetro de massas (nLC-ESI-MS/MS). Os dados obtidos de MS/MS foram processados e submetidos conjuntamente ao programa SEQUEST [Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Scientific)]. As buscas foram feitas utilizando-se os bancos de dados SWISS-PROT e TrEMBL. Para o esmalte, a taxa de identificação de proteínas foi baixa (13 proteínas no total). Já para a dentina, a taxa de identificação de proteínas foi maior (223 proteínas no total), sendo que a exposição ao ácido cítrico reduziu dramaticamente o número de proteínas identificado, o que não aconteceu para o ácido lático. Proteínas ácido-resistentes foram identificadas tanto para o esmalte quanto para a dentina, destacando-se as queratinas e as mucinas, respectivamente. Estas proteínas, ou os peptídeos oriundos delas responsáveis pelo efeito protetor, são candidatas a serem utilizadas para o enriquecimento de produtos odontológicos, visando à prevenção da cárie e erosão dentária. / The purpose of this work was to analyze changes in protein profile in the acquired pellicle formed on enamel and dentine at different times in situ after exposure to lactic and citric acids. Enamel (n=162) and dentin (n=162) blocks (3X3 mm) were be used. The experiments were conducted on three consecutive days. Each day, volunteers (n = 9) used a mandibular device containing 6 blocks of enamel and 6 of human dentin. After the volunteers remained with the device in the oral cavity for 10 or 120 minutes in order to allow the formation of the acquired pellicle, the blocks were immersed in citric acid (1%, pH 2.5) or lactic acid (0.1 M, pH 4,8) or deionized water for 20 seconds. Following, the pellicle was collected with an electrode filter paper soaked in 3% citric acid. This procedure was repeated for two additional days and \'pools\' with the filter papers obtained from the 9 volunteers for each type of substrate, sampling time and type of acid were made. After extraction, proteins were subjected to reverse phase liquid chromatography coupled to mass spectrometry (nLC-ESI-MS/MS). MS/MS data were processed and submitted to SEQUEST software [Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Scientific)]. Searches were done using SWISS-PROT and TrEMBL databases. The rate of protein identification was low for enamel (13 proteins in total). As for dentin, the rte of protein identification was higher (223 proteins in total). Exposure to citric acid dramatically reduced the number of identified proteins, what did not occur for lactic acid. Acid-resistant proteins, especially keratins and mucins were identified for enamel and dentin, respectively. These proteins, or the peptides originated from them that are responsible for the protective effect, are candidates to be used for the enrichment of dental products, aiming to prevent dental caries and erosion.

O objetivo deste trabalho foi analisar as mudanças no perfil protéico em películas adquiridas formadas in situ, em diferentes tempos, sobre o esmalte e sobre a dentina humana após a exposição a dois tipos de ácido: lático e cítrico. Foram utilizados 162 blocos de esmalte e 162 blocos de dentina humana (3X3 mm). Os experimentos foram realizados em três dias consecutivos. Em cada dia, os voluntários (n=9) utilizavam um dispositivo mandibular contendo 6 blocos de esmalte e 6 blocos de dentina. Na sequência, os voluntários permaneceram com o dispositivo na cavidade bucal por 10 ou 120 minutos para formação de película adquirida. Os blocos foram então imersos em ácido cítrico (1%, pH 2,5) ou ácido lático (0,1 M pH 4,8) ou água deionizada por 20 segundos. Na sequência, a película foi removida com um papel de filtro umedecido em ácido cítrico a 3%. Este procedimento foi repetido por mais dois dias adicionais e foi confeccionado um pool com os papeis de filtro obtidos dos 9 voluntários, para cada tipo de substrato, tempo de coleta e meio de imersão. Após extração das proteínas, as mesmas foram submetidas à cromatografia líquida de fase reversa interligada a um espectrômetro de massas (nLC-ESI-MS/MS). Os dados obtidos de MS/MS foram processados e submetidos conjuntamente ao programa SEQUEST [Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Scientific)]. As buscas foram feitas utilizando-se os bancos de dados SWISS-PROT e TrEMBL. Para o esmalte, a taxa de identificação de proteínas foi baixa (13 proteínas no total). Já para a dentina, a taxa de identificação de proteínas foi maior (223 proteínas no total), sendo que a exposição ao ácido cítrico reduziu dramaticamente o número de proteínas identificado, o que não aconteceu para o ácido lático. Proteínas ácido-resistentes foram identificadas tanto para o esmalte quanto para a dentina, destacando-se as queratinas e as mucinas, respectivamente. Estas proteínas, ou os peptídeos oriundos delas responsáveis pelo efeito protetor, são candidatas a serem utilizadas para o enriquecimento de produtos odontológicos, visando à prevenção da cárie e erosão dentária. / The purpose of this work was to analyze changes in protein profile in the acquired pellicle formed on enamel and dentine at different times in situ after exposure to lactic and citric acids. Enamel (n=162) and dentin (n=162) blocks (3X3 mm) were be used. The experiments were conducted on three consecutive days. Each day, volunteers (n = 9) used a mandibular device containing 6 blocks of enamel and 6 of human dentin. After the volunteers remained with the device in the oral cavity for 10 or 120 minutes in order to allow the formation of the acquired pellicle, the blocks were immersed in citric acid (1%, pH 2.5) or lactic acid (0.1 M, pH 4,8) or deionized water for 20 seconds. Following, the pellicle was collected with an electrode filter paper soaked in 3% citric acid. This procedure was repeated for two additional days and \'pools\' with the filter papers obtained from the 9 volunteers for each type of substrate, sampling time and type of acid were made. After extraction, proteins were subjected to reverse phase liquid chromatography coupled to mass spectrometry (nLC-ESI-MS/MS). MS/MS data were processed and submitted to SEQUEST software [Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Scientific)]. Searches were done using SWISS-PROT and TrEMBL databases. The rate of protein identification was low for enamel (13 proteins in total). As for dentin, the rte of protein identification was higher (223 proteins in total). Exposure to citric acid dramatically reduced the number of identified proteins, what did not occur for lactic acid. Acid-resistant proteins, especially keratins and mucins were identified for enamel and dentin, respectively. These proteins, or the peptides originated from them that are responsible for the protective effect, are candidates to be used for the enrichment of dental products, aiming to prevent dental caries and erosion.

A película adquirida (PA) é um filme formado pela adsorção seletiva de proteínas, glicoproteínas e lipídeos à superfície dentária. A presença de proteínas na PA forma uma interface protetora sobre a superfície do dente, participando em todos os eventos interfaciais que ocorrem na cavidade bucal, tais como des- e remineralização, lubrificação das superfícies dos dentes, e aderência bacteriana. Com o advento da proteômica, tem havido um aumento considerável no conhecimento acerca do perfil proteico de PAs adquiridas formadas sobre o esmalte dentário, em diferentes situações, mas nenhum trabalho até o momento descreveu o perfil proteômico de PAs formadas sobre a dentina. Este estudo foi pioneiro em comparar o perfil proteico de PAs formadas in situ sobre o esmalte e a dentina, nos tempos de 10 minutos e 2 horas, utilizando análise proteômica quantitativa livre de marcadores. Os experimentos foram realizados por três dias consecutivos. Em cada dia, os 9 voluntários receberam profilaxia dentária e em seguida utilizaram um aparelho vestibular com 6 blocos de esmalte e 6 de dentina humanos por 10 minutos ou 2 horas. Após esses períodos, a PA formada era coletada com auxílio de um papel filtro de eletrodos embebido em ácido cítrico 3%. Para as análises foi realizado um pool com os papéis dos 9 voluntários de todos os dias, para cada substrato e tempo de formação. Após a extração e digestão das proteínas, a separação dos peptídeos foi realizada por nano-HPLC (nano-Cromatografia Líquida de Alta Performace), interligada a um espectrômetro de massa (nLC-ESI-MS/MS). Os dados MS/MS obtidos foram processados e pesquisados em bancos de dados de proteínas humanas (UniProt e TrEMBL), utilizando o algoritmo SEQUEST no software Proteome Discoverer 1.3. Para a PA formada sobre o esmalte, foram identificadas 160 e 64 proteínas, nos tempos de formação de 10 minutos e 2 horas, respectivamente. Os respectivos números de proteínas identificadas para a dentina foram 86 e 52, respectivamente. Nos tempos de 10 minutos e 2 horas, respectivamente, 25 e 11 proteínas foram comuns a ambos os substratos e foram submetidas à quantificação livre de marcadores (SIEVE), revelando que a maioria das proteínas com diferença de expressão entre os dois substratos teve sua expressão aumentada na dentina. Foram identificadas ainda, no tempo de 10 minutos de formação da PA, 135 e 61 proteínas exclusivas ao esmalte ou à dentina, respectivamente. O número correspondente de proteínas exclusivas para o tempo de 2 horas foi de 53 e 41 proteínas, para o esmalte e dentina, respectivamente. Dentre as proteínas exclusivas da dentina, foram identificadas várias proteínas relacionadas ao complexo cálcio/calmodulina, assim como proteínas associadas à tumorigênese e à fosforilação/desfosforilação de proteínas. Em adição, muitas das proteínas identificadas no presente estudo, tanto para o esmalte quanto para a dentina, ainda não foram caracterizadas e, portanto, não têm função conhecida na PA. Sua caracterização e estudos funcionais futuros poderão trazer novos horizontes no entendimento da importância da PA para a proteção da estrutura dentária, bem como do papel da PA como sítio de biomarcadores para doenças bucais e sistêmicas. / The acquired pellicle (AP) is a film that results from selective adsorption of proteins, glicoproteins and lipids on the tooth surface. The presence of proteins in the AP forms a protective interface on the tooth surface that participates in all the surface events occurring in the oral cavity, such as de- and remineralization, lubrification of the tooth surfaces and bacterial adherence. With the advent of Proteomics, considerable increase in the knowledge of the protein profile of the AP formed on tooth enamel, under different circunstances, has been observed. However, so far the proteomic profile of the AP formed on dentin has not been described. This is the first study to compare the proteomic profile of APs formed in situ for 10 minutes and 2 hours, on enamel and dentin, using quantitative label-free proteomics. The experiments were conducted for 3 consecutive days. Each day, 9 volunteers were submitted to dental prophylaxis and in sequence wore a vestibular device containing 6 human enamel and 6 human dentin blocks for 10 minutes or 2 hours. After these periods, the PA formed was collected with an electrode filter paper soaked in 3% citric acid. The papers from the 9 volunteers, for each substrate and time of pellicle formation were pooled and used for analysis. After protein extraction and digestion, peptides were separated by nano-HPLC (High-performance liquid chromatography) coupled to a mass spectrometer (nLC-ESI- MS/MS). The obtained MS/MS spectra were searched against human protein databases (UniProt and TrEMBL) using SEQUEST algorithm in Proteome Discoverer 1.3 software. For the AP formed on enamel, 160 and 64 proteins were identified for the times of pellicle formation of 10 minutes and 2 hours, respectively. The respective numbers of identified proteins for dentin were 86 and 52, respectively. For the times of 10 minutes and 2 hours, respectively, 25 and 11 proteins were common to both substrates. They were submitted to label-free quantification, which revealed that most of the proteins with differential expression were overexpressed in the dentin. For APs formed for 10 minutes, 135 and 61 proteins were identified exclusively for enamel or dentin, respectively. The corresponding number for the 2-hour APs was 53 and 41 proteins, respectively. Among the proteins identified exclusively in dentin, many proteins related with calcium/calmodulin complex, as well as proteins associated with tumorigenesis and protein phosphorylation/dephosphorylation were found. In addition, many of the identified proteins, both for enamel and dentin, remain uncharacterized and, therefore have no described function in the AP. In the future, their characterization and functional studies might open new avenues for the understanding of the importance of the AP for the protection of the dental structure, as well as for the use of the AP as a site for biomarkers of oral and systemic diseases.