Submitted by Biblioteca Central (biblioteca@unicap.br) on 2018-06-06T18:35:42Z No. of bitstreams: 2 claudia_maria_rocha_moura.pdf: 1212429 bytes, checksum: 64bbf58e7633e49f0648b0ef6ed9e0ab (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-06T18:35:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 claudia_maria_rocha_moura.pdf: 1212429 bytes, checksum: 64bbf58e7633e49f0648b0ef6ed9e0ab (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-04-06 / Microbial enzymes are one of the bioactive products have increased their production in recent decades, due to its widespread use in many existing industrial and environmental sectors. There are numerous applications of microbial enzymes in various sectors of biotechnology. Due to its widespread use, several studies have been undertaken to isolate and identify new producers microorganisms, especially those isolated from poorly studied environments and with an immense microbial biodiversity as the northeastern Caatinga. Studies have been conducted with filamentous Penicillium isolated from soil samples of the fungi of Pernambuco Caatinga to produce tannase. Initially enzyme production was performed using selection on solid medium 4 samples. The results showed that the samples called SIS 24 and 25 show the formation of the characteristic halos higher production of enzyme at 37°C, with values of 4.0 and 4.5 cm, respectively. Then molecular and morphological tests for identification of the samples were made which had the largest halos production of tannase and the sample identified as Talaromyces (SIS 24) and Penicillium chrysogenum (SIS 25). The tannase production assays were performed with samples SIS 24 and 25 by submerged fermentation using 4 production media with different compositions at 37 °C, 150 rpm, 168 hours. The results show that the SIS 25 showed the highest enzyme production at 96 hours of production 0.1555 U / mL obtained in the medium 1. Continuing to production studies were performed new production using a 23 full factorial design for alternative media formulation containing organic residues (coffee, grape and orange wastes) under the same conditions used in the previous test. The results showed that the assay 3, which showed a pH 4.8, containing coffee 5g, 12g of grape and orange 5g, presented a lipase activity of 0.210 U / mL. The use of agro-industrial waste emerges as a viable alternative for the development of biotechnology products bioactive media of production. / As enzimas microbianas são um dos produtos bioativos que têm aumentado sua produção nas últimas décadas, devido a sua grande utilização em diversos setores industriais e ambientais existentes. São inúmeras as aplicações das enzimas microbianas em diversos setores da biotecnologia. Devido a sua grande utilização, vários estudos têm sido realizados no sentido de isolar e identificar novos micro-organismos produtores, principalmente aqueles isolados de ambientes pouco estudados e com uma imensa biodiversidade microbiana como a Caatinga nordestina. Foram realizados estudos com fungos filamentosos do gênero Penicillium isolados de solo da Caatinga de Pernambuco para produção de tanase. Inicialmente foi realizada uma seleção de produção da enzima utilizando 4 isolados em meio sólido. Os resultados revelaram que os isolados denominadas de SIS 24 e 25, apresentaram a formação dos maiores halos característicos de produção da enzimas à 37oC, com valores de 4,0 e 4,5 cms, respectivamente. Em seguida, foram realizados ensaios moleculares e morfológicos para identificação das amostras selecionadas (SIS 24) identificada como Talaromyces e a (SIS 25) como Penicillium chrysogenum. Em seguida, foram realizados ensaios de produção da tanase com os isolados SIS 24 e SIS 25 através de fermentação submersa, utilizando 4 meios de produção com diferentes composições, à 37oC, 150 rpm, 168 horas. Os resultados revelaram que a amostra SIS 25 apresentou a maior produção enzimática com 96 h de produção de 0,1555 U/mL obtida no meio 1. Ensaios de produção utilizando um planejamento fatorial de 23 completo para formulação de meios alternativos contendo resíduos agroindustriais (casca de café, casca de uva e resíduo de laranja) nas mesmas condições utilizadas no ensaio anterior. Os resultados obtidos evidenciaram que o ensaio denominado 3, que apresentou um valor de pH 4,8, contendo resíduos de café 5g, de uva 12g e de laranja 5g, apresentou uma atividade tanalitica de 0,210 U/mL. A utilização de resíduos agroindustriais surge como uma alternativa viável na elaboração de meios de produção de produtos biotecnológicos bioativos.

O objetivo desse trabalho foi estudar o potencial de xilanases presentes no filtrado de cultura e de xilanases purificadas de Penicillium chrysogenum no processo de branqueamento de polpa celulósica de pseudocaule de bananeiras frutíferas. Inicialmente, estabeleceu-se o meio e o tempo de cultivo ótimos para a produção de xilanase pelas linhagens IFO-4626 e M-85 de Penicillium chrysogenum. Ambas as linhagens apresentam, além da alta atividade de xilanase, alta atividade de pectinases e baixa atividade de celulases, características que contribuem para seu emprego no processamento de polpa e(ou) fibras celulósicas. Para a linhagem IFO-4626, a melhor produção de xilanase foi obtida no meio Ferreira após 60h de cultivo, usando como indutor xilana de oat spelt. O desempenho da linhagem M-85 só se iguala ao da IFO-4626 no tempo 72h, no meio Haas. Como fontes de carbono, palha de cana-de-açúcar e fibra de coco podem substituir a xilana de oat spelt na produção de xilanase pela linhagem IFO-4626. Xilose pode induzir a síntese de xilanase quando nenhuma fonte de xilana é adicionada ao meio. A inibição da atividade de xilanase foi observada nos meios com xilana e glicose (1%) ou galactose (1%). Nos experimentos de purificação da xilanase foi usado o filtrado de cultura obtido após 72h de cultivo da linhagem IFO-4626 no meio Ferreira. Dois picos com atividade de xilanase foram obtidos após a eluição em uma coluna de troca aniônica DEAE-Sephacel. A xilanase I, com massa molecular de 12,6 kDa, Km = 12,14 mg/mL e Vmáx = 7,75 U/µg de proteína, não se ligou à resina e a xilanase II, com massa molecular de 20 kDa, Km = 39,32 mg/mL e Vmáx = 1579,62 mg/mL, foi eluída com 100 mM de NaCl. Tanto as xilanases presentes no filtrado de cultura como as xilanases I e II, apresentaram boa estabilidade térmica a 40°C e 50°C e em valores de pH de 3,5 a 9,0. Porém, além de não possuírem boa estabilidade a 60°C, suas temperaturas e pH ótimos de reação são baixos. As xilanases presentes no filtrado de cultura foram ativadas pela presença de Fe+2, Mn+2, Ca+2 e ditiotreitol (DTT) e inibidas pela presença de Zn+2, dodecil sulfato de sódio (SDS), Pb+2 e Hg+2. A atividade da xilanase I foi estimulada por DTT, Ca+2 e Mn+2 e inibidas por Cu+2, Zn+2, SDS e Hg+2. Já a xilanase II foi inibida por Hg+2 e ativada por diversos íons: Mn+2, Co+2, Fe+2, Ba+2, Ca+2, Cu+2, Mg+2 e por NH4+ e DTT. As xilanases presentes no filtrado de cultura da linhagem IFO-4626 e as xilanases purificadas I e II favoreceram a liberação de cromóforos a 237nm e de açúcares redutores. Porém, as enzimas presentes no filtrado de cultura mostraram-se mais adequadas para liberação de cromóforos com absorção em diferentes comprimentos de onda. Ou seja, constatou-se que as enzimas presentes no filtrado de cultura possuem melhor potencial do que as xilanases purificadas I e II, para favorecer o posterior branqueamento da polpa kraft de pseudocaules de bananeiras frutíferas. / The aim of this work was to study the potential of xylanases present in culture filtrate of Penicillium chrysogenum and of this xylanases purified in favor of the pre-bleaching of pseudo-stem cellulosic pulp of banana trees. Early, it was established the optimal media and time of culture to production of xylanases by IFO-4626 and M-85 Penicillium chrysogenum strains. Both strains have presented such characteristics as to contribute to their use in pulp and/or cellulosic fibers industrial process, besides the high activity of pectinases and the low activity of cellulases. To the IFO-4626 strain, the best production of xylanases using as inductor oat spelt xylan was obtained in the Ferreira medium, after 60h of culture. The performance of M-85 strain only was equal to that at the 72 hours in the Haas medium. As carbon sources, both sugar-cane straw and coconut fiber can substitute the oat spelt xylan in the production of xylanase by IFO-4626 strain. Xylose can induce the synthesis of xylanase when no xylan source was added to the culture medium. The inhibition of activity of xilanase was observed in medium with xylan plus glycose (1%) or galactose (1%). In the essays about xylanase purification, it was used the culture filtrate of IFO-4626 strain, obtained after 72 hours of culture in Ferreira medium. Two peaks with xylanase activity were obtained after the elution in an anionic-exchange column DEAE-Sephacel. The xylanase I, showed molecular mass of 12.6 kDa, Km = 12.14mg/mL and Vmax = 7.75 U/µg of protein, and it was not bind to the resin, and the xylanase II, with molecular mass of 20 kDa, Km = 39.32 mg/mL and Vmáx = 1579.62 mg/mL, was eluted with NaCl 100 mM. The xylanases in the culture filtrate, and the xylanases I and II, have presented good stability at 40°C and 50°C, and in pH values 3.5 to 9.0, despite of having no good stability at 60°C, their optimal temperatures and pH of reaction are low. The xylanases present in culture filtrate were activated by the presence of Fe+2, Mn+2, Ca+2 and dithiothreitol (DTT) and inhibited by the presence of Zn+2, sodium dodecyl sulphate (SDS), Pb+2 and Hg+2. The xylanase I activity was stimulated by DTT, Ca+2, and Mn+2, and inhibited by Cu+2, Zn+2, SDS, and Hg+2. On the other hand, the xylanase II was inibited by Hg+2, and it was activated by several ions, like as: Mn+2, Co+2, Fe+2, Ba+2, Ca+2, Cu+2, Mg+2, and by NH4+ and DTT. The xylanases from IFO-4626 strain, present in the culture filtrate, and the purified xylanases I and II favored the release of chromophores at 237 nm, and release of reducing sugars. Although, the enzymes present in the culture filtrate show better adequacy than the purified ones in order to release chromophores, they show absorption in different wave lengths. In other words, it was verified that the enzymes present in the culture filtrate have the best potential to favor the further bleaching of the banana tree pseudo-stem kraft pulp.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:01:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SergioDOJ_DISSERT.pdf: 2461924 bytes, checksum: 06030d71a8b1e71249d42850e7384bcc (MD5) Previous issue date: 2014-01-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / The production of enzymes by microorganisms using organic residues is important and it can be associated with several applications such as food and chemical industries and so on. The objective of this work is the production of CMCase, Xylanase, Avicelase and FPase enzymes by solid state fermentation (SSF) using as substrates: bagasse of coconut and dried cashew stem. The microorganisms employed are Penicillium chrysogenum and an isolated fungus from the coconut bark (Aspergillus fumigatus). Through the factorial design methodology and response surface analysis it was possible to study the influence of the humidity and pH. For Penicillium chrysogenum and the isolated fungus, the coconut bagasse was used as culture medium. In another fermentation, it was used the mixture of coconut bagasse and cashew stem. Fermentations were conducted using only the coconut bagasse as substrate in cultures with Penicillium chrysogenum fungus and the isolated one. A mixture with 50% of coconut and 50% of cashew stem was employed only for Penicillium chrysogenum fungus, the cultivation conditions were: 120 hours at 30 ?C in BOD, changing humidity and pH values. In order to check the influence of the variables: humidity and pH, a 2 2 factorial experimental design was developed, and then two factors with two levels for each factor and three repetitions at the central point. The levels of the independent variables used in ascending order (-1, 0, +1), to humidity, 66%, 70.5% and 75% and pH 3, 5 and 7, respectively. The software STATISTICA TM (version 7.0, StatSoft, Inc.) was used to calculate the main effects of the variables and their interactions. The response surface methodology was used to optimize the conditions of the SSF. A chemical and a physic-chemical characterization of the coconut bagasse have determined the composition of cellulose (%) = 39.09; Hemicellulose (%) = 23.80, Total Lignin (%) = 36.22 and Pectin (%) = 1.64. To the characterization of cashew stem, the values were cellulose (g) = 15.91 Hemicellulose (%) = 16.77, Total Lignin (%) = 30.04 and Pectin (%) = 15.24. The results indicate the potential of the materials as substrate for semisolid fermentation enzyme production. The two microorganisms used are presented as good producers of cellulases. The results showed the potential of the fungus in the production of CMCase enzyme, with a maximum of 0.282 UI/mL and the Avicelase enzyme the maximum value ranged from 0.018 to 0.020 UI/ mL, using only coconut bagasse as substrate. The Penicillium chrysogenum fungus has showed the best results for CMCase = 0.294 UI/mL, FPase = 0.058 UI/mL, Avicelase = 0.010 UI/mL and Xylanase = 0.644 UI/ mL enzyme, using coconut bagasse and cashew stem as substrates. The Penicllium chrysogenum fungus showed enzymatic activities using only the coconut as substrate for CMCase = 0.233 UI/mL, FPase = 0.031 to 0.032 UI/ mL, Avicelase = 0.018 to 0.020 UI/mL and Xylanase = 0.735 UI/ mL. Thus, it can be concluded that the used organisms and substrates have offered potential for enzyme production processes in a semi-solid cultivation / A produ??o de enzimas por microrganismos utilizando res?duos agroindustriais ? importante e pode estar associada a diversas aplica??es, tais como ind?strias de alimentos, qu?mica, t?xtil entre outras. O objetivo deste trabalho ? a produ??o de enzimas CMCase, Xilanase, Avicelase e FPase atrav?s da fermenta??o em estado s?lido (FES), usando como substrato o baga?o do coco verde e o ped?nculo de caju seco, utilizando os microrganismos Penicillium chrysogenum e um fungo isolado da casca do coco (Aspergillus fumigatus). A metodologia do planejamento experimental fatorial e an?lise de superf?cie de resposta estudou a influ?ncia da varia??o da umidade e do pH. Foram realizadas fermenta??es usando o baga?o do coco como substrato, nos cultivos utilizando o Aspergillus fumigatus e o fungo Penicillium chrysogenum, e uma mistura com 50% de baga?o do coco e de 50% do ped?nculo de caju com o fungo Penicillium chrysogenum, as condi??es de cultivo foram: 120 horas a 30 ?C em BOD, variando umidade e pH. Com o objetivo de verificar a influ?ncia das vari?veis: umidade e pH, foi elaborado um planejamento experimental fatorial 2 2 , sendo ent?o dois fatores e dois n?veis para cada fator com tr?s repeti??es no ponto central. Os n?veis das vari?veis independentes utilizadas foram, na ordem crescente (-1, 0, +1), para umidade 66%, 70,5% e 75% e para o pH 3, 5 e 7. Foi usado o programa computacional STATISTICA TM (vers?o 7.0, da StatSoft, Inc.) para calcular os efeitos principais das vari?veis e suas intera??es. A metodologia de superf?cie de resposta foi usada para avaliar as condi??es da FES. A caracteriza??o qu?mica e f?sico-qu?mica do baga?o do coco verde determinou as composi??es de Celulose (%) = 39,09; Hemicelulose (%) = 23,80; Lignina Total (%) = 36,22 e de Pectina (%) = 1,64. J? para a caracteriza??o do ped?nculo de caju os valores foram de Celulose (g) =15,91; Hemicelulose (%) = 16,77; Lignina Total (%) = 30,04 e Pectina (%) = 15,24. Os resultados obtidos indicam o potencial dos materiais como substrato para fermenta??o semi s?lida visando produ??o de enzimas. Os dois microrganismos utilizados apresentaram como bons produtores de celulases. Os resultados mostraram o potencial do fungo isolado na produ??o da enzima CMCase, com valor m?ximo de 0,282 UI/mL e para a enzima Avicelase o valor m?ximo variou entre 0,018 0,020 UI/mL, usando apenas o baga?o do coco como substrato. O fungo Penicillium chrysogenum apresentou os melhores resultados para as enzimas CMCase = 0,294 UI/mL, FPase = 0,058 UI/mL, Avicelase = 0,010 UI/mL e Xilanase = 0,644 UI/mL, usando o baga?o do coco e o ped?nculo de caju como sustratos. O fungo Penicllium chrysogenum apresentou atividades enzim?ticas usando apenas o coco como substrato, para CMCase = 0,233 UI/mL, FPase = 0,031 0,032 UI/mL, Avicelase = 0,018 0,020 UI/mL e Xilanase = 0,735 UI/mL. Portanto, concluiu-se que os microrganismos e os substratos utilizados apresentam potencial para processos de produ??o de enzimas em cultivo semi-s?lido

O objetivo desse trabalho foi estudar o potencial de xilanases presentes no filtrado de cultura e de xilanases purificadas de Penicillium chrysogenum no processo de branqueamento de polpa celulósica de pseudocaule de bananeiras frutíferas. Inicialmente, estabeleceu-se o meio e o tempo de cultivo ótimos para a produção de xilanase pelas linhagens IFO-4626 e M-85 de Penicillium chrysogenum. Ambas as linhagens apresentam, além da alta atividade de xilanase, alta atividade de pectinases e baixa atividade de celulases, características que contribuem para seu emprego no processamento de polpa e(ou) fibras celulósicas. Para a linhagem IFO-4626, a melhor produção de xilanase foi obtida no meio Ferreira após 60h de cultivo, usando como indutor xilana de oat spelt. O desempenho da linhagem M-85 só se iguala ao da IFO-4626 no tempo 72h, no meio Haas. Como fontes de carbono, palha de cana-de-açúcar e fibra de coco podem substituir a xilana de oat spelt na produção de xilanase pela linhagem IFO-4626. Xilose pode induzir a síntese de xilanase quando nenhuma fonte de xilana é adicionada ao meio. A inibição da atividade de xilanase foi observada nos meios com xilana e glicose (1%) ou galactose (1%). Nos experimentos de purificação da xilanase foi usado o filtrado de cultura obtido após 72h de cultivo da linhagem IFO-4626 no meio Ferreira. Dois picos com atividade de xilanase foram obtidos após a eluição em uma coluna de troca aniônica DEAE-Sephacel. A xilanase I, com massa molecular de 12,6 kDa, Km = 12,14 mg/mL e Vmáx = 7,75 U/µg de proteína, não se ligou à resina e a xilanase II, com massa molecular de 20 kDa, Km = 39,32 mg/mL e Vmáx = 1579,62 mg/mL, foi eluída com 100 mM de NaCl. Tanto as xilanases presentes no filtrado de cultura como as xilanases I e II, apresentaram boa estabilidade térmica a 40°C e 50°C e em valores de pH de 3,5 a 9,0. Porém, além de não possuírem boa estabilidade a 60°C, suas temperaturas e pH ótimos de reação são baixos. As xilanases presentes no filtrado de cultura foram ativadas pela presença de Fe+2, Mn+2, Ca+2 e ditiotreitol (DTT) e inibidas pela presença de Zn+2, dodecil sulfato de sódio (SDS), Pb+2 e Hg+2. A atividade da xilanase I foi estimulada por DTT, Ca+2 e Mn+2 e inibidas por Cu+2, Zn+2, SDS e Hg+2. Já a xilanase II foi inibida por Hg+2 e ativada por diversos íons: Mn+2, Co+2, Fe+2, Ba+2, Ca+2, Cu+2, Mg+2 e por NH4+ e DTT. As xilanases presentes no filtrado de cultura da linhagem IFO-4626 e as xilanases purificadas I e II favoreceram a liberação de cromóforos a 237nm e de açúcares redutores. Porém, as enzimas presentes no filtrado de cultura mostraram-se mais adequadas para liberação de cromóforos com absorção em diferentes comprimentos de onda. Ou seja, constatou-se que as enzimas presentes no filtrado de cultura possuem melhor potencial do que as xilanases purificadas I e II, para favorecer o posterior branqueamento da polpa kraft de pseudocaules de bananeiras frutíferas. / The aim of this work was to study the potential of xylanases present in culture filtrate of Penicillium chrysogenum and of this xylanases purified in favor of the pre-bleaching of pseudo-stem cellulosic pulp of banana trees. Early, it was established the optimal media and time of culture to production of xylanases by IFO-4626 and M-85 Penicillium chrysogenum strains. Both strains have presented such characteristics as to contribute to their use in pulp and/or cellulosic fibers industrial process, besides the high activity of pectinases and the low activity of cellulases. To the IFO-4626 strain, the best production of xylanases using as inductor oat spelt xylan was obtained in the Ferreira medium, after 60h of culture. The performance of M-85 strain only was equal to that at the 72 hours in the Haas medium. As carbon sources, both sugar-cane straw and coconut fiber can substitute the oat spelt xylan in the production of xylanase by IFO-4626 strain. Xylose can induce the synthesis of xylanase when no xylan source was added to the culture medium. The inhibition of activity of xilanase was observed in medium with xylan plus glycose (1%) or galactose (1%). In the essays about xylanase purification, it was used the culture filtrate of IFO-4626 strain, obtained after 72 hours of culture in Ferreira medium. Two peaks with xylanase activity were obtained after the elution in an anionic-exchange column DEAE-Sephacel. The xylanase I, showed molecular mass of 12.6 kDa, Km = 12.14mg/mL and Vmax = 7.75 U/µg of protein, and it was not bind to the resin, and the xylanase II, with molecular mass of 20 kDa, Km = 39.32 mg/mL and Vmáx = 1579.62 mg/mL, was eluted with NaCl 100 mM. The xylanases in the culture filtrate, and the xylanases I and II, have presented good stability at 40°C and 50°C, and in pH values 3.5 to 9.0, despite of having no good stability at 60°C, their optimal temperatures and pH of reaction are low. The xylanases present in culture filtrate were activated by the presence of Fe+2, Mn+2, Ca+2 and dithiothreitol (DTT) and inhibited by the presence of Zn+2, sodium dodecyl sulphate (SDS), Pb+2 and Hg+2. The xylanase I activity was stimulated by DTT, Ca+2, and Mn+2, and inhibited by Cu+2, Zn+2, SDS, and Hg+2. On the other hand, the xylanase II was inibited by Hg+2, and it was activated by several ions, like as: Mn+2, Co+2, Fe+2, Ba+2, Ca+2, Cu+2, Mg+2, and by NH4+ and DTT. The xylanases from IFO-4626 strain, present in the culture filtrate, and the purified xylanases I and II favored the release of chromophores at 237 nm, and release of reducing sugars. Although, the enzymes present in the culture filtrate show better adequacy than the purified ones in order to release chromophores, they show absorption in different wave lengths. In other words, it was verified that the enzymes present in the culture filtrate have the best potential to favor the further bleaching of the banana tree pseudo-stem kraft pulp.

[ES] El empleo de organismos vivos como biofactorías ha ganado una atención significativa en la industria debido a la creciente demanda de sistemas de producción sostenibles y la escasez de recursos. Entre sus muchas aplicaciones, las biofactorías pueden ser diseñadas para producir feromonas de insectos, las cuales sirven como alternativa ecológica a los pesticidas para el control de plagas en la agricultura. Como prueba de concepto, en esta tesis doctoral se caracterizaron plantas de Nicotiana benthamiana modificadas genéticamente con una ruta multigénica para producir las feromonas de polillas (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) y (Z)-11-hexadecenil acetato (Z11-16OAc). Las plantas resultantes produjeron cantidades moderadas de ambas feromonas (111.4 µg g-1 FW y 11.8 µg g-1 FW para Z11-16OH y Z11-16OAc, respectivamente), y tasas de emisión diarias de ~10 ng g-1 FW para cada feromona. La producción de feromonas afectó negativamente al desarrollo de las plantas, probablemente debido a la sustancial carga metabólica y posible toxicidad de estos productos. Una estrategia para superar estas limitaciones es diseñar un sistema de expresión condicional que permita a las plantas crecer con normalidad antes de inducir la producción de feromonas. Para ello desarrollamos un conjunto de promotores sintéticos personalizables, llamados GB_SynP, activables con dCasEV2.1, un activador transcripcional potente y programable desarrollado recientemente para la inducción de genes en plantas. Los promotores GB_SynP permitieron una regulación precisa de los transgenes, con unos niveles de transcripción robustos y modulables en el estado "encendido" (presencia de dCasEV2.1 y la correspondiente guía de ARN), y una expresión mínima en el estado "apagado". Para implementar el sistema de producción condicional de feromonas en plantas se generó una nueva ruta multigénica para la biosíntesis de feromonas de polilla bajo el control de los promotores GB_SynP. Paralelamente, el activador dCasEV2.1 se reguló transcripcionalmente mediante el módulo CUP2:GAL4 sensible a sulfato de cobre, un inductor químico ampliamente utilizado en la agricultura. La funcionalidad del sistema se probó mediante expresión transitoria en N. benthamiana, resultando en unos rendimientos en el estado "encendido" de 32.7 µg g-1 FW y 25 µg g-1 FW para Z11-16OH y Z11-16OAc, respectivamente, y unos niveles insignificantes en ausencia de cobre. Sin embargo, la expresión en estable de esta ruta en N. benthamiana produjo unos niveles de expresión de los transgenes significativamente menores y una marcada disminución en la producción de feromonas. Esto supone que el sistema en su forma actual resulte inviable como biofactoría de feromonas en términos prácticos. La optimización de este sistema debe centrarse en mejorar la cascada de activación, en el uso de especies de plantas alternativas con mayor biomasa, y/o en incrementar las tasas de emisión en planta. Como alternativa a la producción de feromonas en plantas, la intercambiabilidad de piezas génicas entre plantas y hongos filamentosos puede aprovecharse para crear biofactorías fúngicas de feromonas. En este sentido, nuestro grupo adaptó previamente el sistema GoldenBraid a hongos filamentosos, llamado FungalBraid. En esta tesis ampliamos la colección de FungalBraid incorporando 27 piezas nuevas que incluyen diferentes marcadores de selección y promotores constitutivos e inducibles, los cuales se caracterizaron funcionalmente en Penicillium digitatum y P. chrysogenum. Además, se expresaron con éxito los promotores GB_SynP en P. digitatum, en combinación con el sistema de dCas9 activadora contenido en el vector pAMA18. Aunque los niveles de expresión de GB_SynP en hongos filamentosos fueron menores que los observados previamente en plantas, ésta y otras herramientas disponibles en la colección FungalBraid pueden utilizarse en el futuro para el desarrollo de biofactorías fúngicas que produzcan feromonas de insectos y otras biomoléculas de alto valor. / [CA] L'ús d'organismes vius com biofàbriques ha guanyat una atenció significativa a la indústria a causa de la creixent demanda de sistemes de producció sostenible i l'escassetat de recursos. Entre les seues moltes aplicacions, les biofàbriques poden ser dissenyades per a produir feromones d'insectes, les quals serveixen com a alternativa ecològica als pesticides per al control de plagues a l'agricultura. Com a prova d'aquest concepte, en aquesta tesi doctoral es van caracteritzar plantes de Nicotiana benthamiana modificades genèticament plantes de amb una ruta multigènica per a produir les feromones d'arnes (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) i (Z)-11-hexadecenil acetat (Z11-16OAc). Les plantes resultants van produir quantitats moderades de totes dues feromones (111.4 µg g-1 FW i 11.8 µg g-1 FW per a Z11-16OH i Z11-16OAc, respectivament), i taxes d'emissió diàries d'aproximadament 10 ng g-1 FW per a cada feromona. La producció de feromones en aquestes plantes va afectar negativament el seu desenvolupament, probablement a causa de la substancial càrrega metabòlica i possible toxicitat d'aquests productes. Una estratègia per superar aquestes limitacions és dissenyar un sistema d'expressió condicional que permeta a les plantes créixer amb normalitat abans d'induir la producció de feromones. Per això hem desenvolupat un conjunt de promotors sintètics personalitzables, anomenats GB_SynP, activables amb dCasEV2.1, un activador transcripcional potent i programable desenvolupat recentment per a la inducció de gens en plantes. Els promotors GB_SynP van permetre una regulació precisa des transgens, amb uns nivells de transcripció robustos i modulables a l'estat "encès" (presència de dCasEV2.1 i la corresponent guia d'ARN), i una expressió mínima a l'estat "apagat". Per implementar el sistema de producció condicional de feromones en plantes es va generar una nova ruta multigènica per a la biosíntesi de feromones d'arna sota el control dels promotors GB_SynP. Paral·lelament, l'activador dCasEV2.1 es va regular transcripcionalment al mòdul CUP2:GAL4 sensible al sulfat de coure, un inductor químic àmpliament utilitzat en l'agricultura. La funcionalitat del sistema es va provar mitjançant expressió transitòria en N. benthamiana, resultant en uns rendiments a l'estat "encès" de 32.7 g-1 FW i 25 µg g-1 FW per a Z11-16OH i Z11-16OAc, respectivament, i uns nivells insignificants en absència de coure. No obstant això, l'expressió estable d'aquesta ruta a N. benthamiana va produir uns nivells d'expressió dels transgens significativament menors i una marcada disminució en la producció de feromones. Això suposa que el sistema en la seua forma actual resulte inviable com a biofàbrica de feromones en termes pràctics. L'optimització d'aquest sistema ha de centrar-se en millorar la cascada d'activació, en l'ús d'espècies de plantes alternatives amb major biomassa, i/o en incrementar les taxes d'emissió a la planta. Com a alternativa a la producció de feromones en plantes, la intercanviabilitat de peces gèniques entre plantes i fongs filamentosos pot aprofitar-se per crear biofàbriques fúngiques de feromones. En aquest sentit, el nostre grup va adaptar prèviament el sistema GoldenBraid a fongs filamentosos, anomenat FungalBraid. En aquesta tesi, vam ampliar la col·lecció de FungalBraid incorporant 27 peces noves que inclouen diferents marcadors de selecció i promotors constitutius i induïbles, els quals es van caracteritzar funcionalment a Penicillium digitatum i P. chrysogenum. A més, es van expressar amb èxit els promotors GB_SynP en P. digitatum, en combinació amb el sistema de dCas9 activadora contingut en el vector pAMA18. Encara que els nivells d'expressió de GB_SynP en fongs filamentosos van ser menors que els observats prèviament en plantes, aquesta i altres eines disponibles a la col·lecció FungalBraid poden utilitzar-se en el futur per al desenvolupament de biofàbriques fúngiques que produeixin feromones d'insectes i altres biomolècules de gran valor. / [EN] The use of living organisms as biofactories have gained significant attention in the industry due to the increasing demand for sustainable production systems and the shortage of resources. Among their many applications, biofactories can be engineered to produce insect pheromones, which serve as eco-friendly alternatives to pesticides for pest management in agriculture. As a proof of concept, in this thesis we characterized Nicotiana benthamiana plants engineered with a multigene pathway to produce the moth pheromones (Z)-11-hexadecenol (Z11-16OH) and (Z)-11-hexadecenyl acetate (Z11-16OAc). The resulting transgenic plants produced modest amounts of both pheromones (111.4 µg g-1 FW and 11.8 µg g-1 FW for Z11-16OH and Z11-16OAc, respectively), and daily emission rates of ~10 ng g-1 FW for each pheromone. Pheromone production in these plants significantly affected their fitness, likely due to the substantial metabolic burden and possible toxicity of lipid-derived products. One strategy to address these developmental abnormalities consists of engineering conditional transgene expression systems, thus allowing plants to grow normally before inducing the production of pheromones. To achieve this goal, in this thesis we developed a set of customizable synthetic promoters called GB_SynP, which can be activated by dCasEV2.1, a strong programable transcriptional activator recently developed for plant gene regulation. These GB_SynP promoters enabled tight regulation of single and multiple transgenes, with robust and tunable transcription levels in the ON state (presence of dCasEV2.1 loaded with the corresponding gRNA), and minimal or undetectable expression in the OFF state. To implement a conditional expression system for pheromone production in plants, a newly engineered multigene pathway for the biosynthesis of moth pheromones was constructed under the control of GB_SynP promoters. In parallel, the dCasEV2.1 activator was transcriptionally regulated with the CUP2:GAL4 sensor for copper sulphate, an agronomically-compatible chemical trigger. The functionality of this system was tested transiently in N. benthamiana, resulting in estimated yields of 32.7 µg g-1 FW and 25 µg g-1 FW for Z11-16OH and Z11-16OAc respectively in the ON state, and negligible levels in the absence of copper. However, stable transformation of the same copper-regulated pheromone pathway in N. benthamiana plants resulted in significantly lower transgene expression levels, which translated into a great reduction of pheromone yields. This makes the system in its current form a non-viable pheromone biofactory in practical terms. Further optimization should focus on the improvement of the activation cascade, the use of alternative plant hosts with more biomass, and/or the enhancement of emission rates in planta. As an alternative to pheromone production in plants, the interchangeability of DNA parts between plants and filamentous fungi could also be exploited to create fungal biofactories for pheromone production. In this regard, our research group previously adapted the GoldenBraid system for filamentous fungi, which we named FungalBraid. In this thesis, we expanded the FungalBraid collection by incorporating 27 new DNA parts, including different selection markers and several constitutive and inducible promoters, all of which were functionally characterized in Penicillium digitatum and P. chrysogenum. Furthermore, we successfully expressed the GB_SynP promoters developed for plants in P. digitatum, in combination with the non-integrative pAMA18-derived vector for the expression of a dCas9-based activator. Although further optimization of GB_SynP in filamentous fungi is required, as expression levels were lower than those previously observed in plants, this and the other tools available in the FungalBraid collection can be effectively employed in the future for the development of fungal biofactories that produce insect pheromones and other high value biomolecules. / Este trabajo ha sido financiado mediante la Ayuda para la Formación de Profesorado Universitario FPU18/02019 (Ministerio de Educación, Cultura y Deporte), así como por el proyecto europeo SUSPHIRE (PCI2018-092893, Era- CoBiotech), y los proyectos de Plan Nacional I+D PID2019-108203RB-100 y PID2021-125858OB-100 (Ministerio de Ciencia e Innovación). / Moreno Giménez, E. (2023). Synthetic biology tools for production of insect pheromones in plants and filamentous fungi [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/201180