Το ριβόσωμα παρέχει την πλατφόρμα πάνω στη οποία το mRNA αναγνωρίζεται και αποκωδικοποιείται από τα μεταφορικά RNAs. Δρα καταλυτικά ως ριβοένζυμο και συνθέτει την αντίστοιχη αλληλουχία αμινοξέων. Σημαντικά λειτουργικό κομμάτι του ριβοσώματος αποτελεί το τούνελ εξόδου, το οποίο βρίσκεται στη μεγάλη υπομονάδα του ριβοσώματος και αποτελεί το κανάλι, μέσω του οποίου οι νεοσυντιθέμενες πεπτιδικές αλυσίδες εξέρχονται στο κυτταροδιάλυμα. Νεότερες ερμηνείες προσδίδουν στο τούνελ εξόδου έναν πιο ενεργό ρόλο, καταδεικνύοντας τη σπουδαιότητά του όχι μόνο ως διάδρομος εξόδου της πεπτιδικής αλυσίδας, αλλά και ως λειτουργική περιοχή του ριβοσώματος με σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Το δίκτυο επικοινωνίας μεταξύ τούνελ και πεπτιδυλοτρανσφεράσης δεν έχει ακόμα χαρτογραφηθεί και μελετηθεί πλήρως, υπάρχουν όμως μέχρι στιγμής πολυπληθείς αναφορές που επιβεβαιώνουν ότι μέρος του αποτελούν κυρίως βάσεις του 23S rRNA, συστατικά του τοιχώματος της εισόδου στο τούνελ, και βάσεις ευρισκόμενες στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, συντηρημένες εξελεικτικά, γνωστές από την αλληλεπιδρασή τους με αναστολείς της πεπτιδυλοτρανσφεράσης και κυρίως με αναστολείς της οικογένειας των μακρολιδίων. Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε την αλληλεπίδραση των χαρακτηριστικών αυτών βάσεων που συγκροτούν το δίκτυο επικοινωνίας μεταξύ του τούνελ εξόδου και της πεπτιδυλοτρανσφεράσης με τη βοήθεια νέων μακρολιδίων τρίτης γενιάς, των κετολιδίων, που φέρουν επί πλέον και άτομα φθορίου, παρέχοντας έτσι στο μόριο μεγαλύτερη συγγένεια για φορτισμένες ομάδες. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, αποτελούν εξαιρετικά υποσχόμενους αντιμικροβιακούς θεραπευτικούς παράγοντες, και αναστέλλουν ισχυρά την μετάφραση. Παράλληλα καταλαμβάνουν αμοιβαία αποκλειόμενες θέσεις στο ριβόσωμα, στην είσοδο του τούνελ, αλληλεπιδρώντας με τις βάσεις Α2058, Α2059, Α2062 και Α752. Επειδή όλες οι παραπάνω βάσεις αποτελούν μέρος του δικτύου επικοινωνίας τούνελ-πεπτιδυλοτρανσφεράσης, θα μπορούσαμε να συμπληρώσουμε τον ήδη υπάρχοντα μηχανισμό δράσης των μακρολιδίων (drop-off, λόγω αύξησης της koff) με την επικοινωνία του τούνελ με την πεπτιδυλοτρανσφεράση, ώστε να απενεργοποιηθεί η τελευταία με τελική κατάληξη τη διακοπή της πρωτεϊνικής σύνθεσης και την επαγωγή του drop-off. Για την περαιτέρω μελέτη της αλληλεπίδρασης του τούνελ με την νεοσυντιθέμενη πεπτιδική αλυσίδα, σχεδιάσθηκαν νέα πεπτιδυλο παράγωγα της χλωραμφανικόλης, τα οποία προσομοιάζουν πεπτιδυλο-tRNAs προσδεδεμένα στην Α-θέση του ριβοσώματος, με την ολιγοπεπτιδική αλληλουχία να εκτείνεται βαθύτερα στο τούνελ, υιοθετώντας μία ανοικτή διαμόρφωση. Όπως διαπιστώσαμε με συναγωνιστικές μελέτες με ραδιενεργό ερυθρομυκίνη, τα συγκεκριμένα ανάλογα καταλαμβάνουν την Α-θέση στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, ενώ η συγγένεια του κάθε αναλόγου ως αναστολέα της λειτουργίας του ριβοσώματος, είναι απόλυτα ιδιοσυγκρατική, καθώς εξαρτάται από την αλληλουχία των αμινοξέων που συγκροτούν το πεπτίδιο. Μελετώντας το αποτύπωμα των ενώσεων αυτών στο ριβόσωμα, διαπιστώσαμε ότι ενώ η βάση της χλωραμφαινικόλης διατηρεί τη θέση της στη περιοχή Α, το πεπτίδιο εισέρχεται βαθειά στην είσοδο του τούνελ, αλληλεπιδρώντας με την βάση Α752. Συνεπώς τα πεπτιδυλο ανάλογα της χλωραμφαινικόλης, τα οποία συμπεριφέρονται ως ισχυροί αναστολείς της μετάφρασης, αποτελούν κατάλληλα εργαλεία μελέτης της αλληλεπίδρασης μεταξύ της νεοσυντιθέμενης πεπτιδικής αλληλουχίας και στοιχείων του τούνελ εξόδου του ριβοσώματος. / Ribosomes translate the genetic code into proteins in all living cells with extremely high efficiency, owing to their inherent flexibility and to their spectacular architecture. These large ribonucleoprotein particles synthesize proteins in all cells, using messenger RNA as the template, confirming that the ribosome is indeed a ribozyme, and aminoacyl-transfer RNAs as substrates. As the nascent polypeptide chain is being synthesized, it passes through a tunnel within the large ribosomal subunit and emerges at the solvent side where protein folding occurs. New studies indicate that in some cases, the tunnel plays a more active role. Accumulated evidence had definitely concluded that ribosomal tunnel is not only a passive conduit for the nascent chains but a rather functionally important compartment, where specific peptide sequences establish direct interactions with the tunnel, talking back to the ribosome in order to regulate peptide synthesis, leading to translational stalling. In this study, we have investigated functional interactions between distinct locations of the ribosomal tunnel and specific residues of the peptidyltransferase, using new macrolides, known as ketolides, which carry also fluorine attached to the lactone ring either directly or indirectly. According to our results, the new antibiotics exhibited better antimicrobial activity, inhibiting strongly the translational apparatus and could be useful tools in the future for treatment of bacterial infections. Binding studies with radiolabeled erythromycin revealed that these drugs bound competitively with erythromycin at the large ribosomal subunit, with extremely low dissociation constants. In parallel, RNA footprinting indicated that the new ketolides occupy the main macrolide binding site in the ribosome, which is located at the entrance of the exit tunnel adjacent to the peptidyltransferase center. These drugs interact with A2058, A2059 and A2062, as well as their extended heteroaromatic alkyl-aryl side chain penetrates deeper in the tunnel protecting A752 of Helix 35, interacting with basepair A752-U2609. To explore further this interaction, we have synthesized new peptidyl conjugates of chloramphenicol, which resemble nascent peptidyl-tRNA chains bound to the A-site of the ribosome, with their peptide sequence located deeper within tunnel, adopting an extended configuration. According to our data, these compounds did indeed bind to the peptidyl transferase center, competing with radiolabelled- chloramphenicol for binding to the ribosome. The binding of each analog, as well as its inhibitory activity of ribosomal function, is absolutely idiosyncratic, depending on the sequence of amino acid of peptide moiety. Studying the footprinting pattern of these compounds on the ribosome, we confirmed that while the chloramphenicol base maintains its position on the A-site, the peptide moiety penetrates deeper in the entrance of the exit tunnel, interacting with nucleotide A752. Therefore, we believe that these chloramphenicol peptides could be useful tools for probing nascent polypeptide chain interaction with the ribosome.

Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. / Στα βακτήρια, η μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα αποτελείται από δύο είδη RNA, το 23S και το 5S rRNA, καθώς και 33 πρωτεΐνες. Ο σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού και η απελευθέρωση της πεπτιδικής αλυσίδας επιτελούνται στη μεγάλη υπομονάδα, όπου εδράζεται το καταλυτικό κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (PTase). Εκτός αυτού, η μεγάλη υπομονάδα περιλαμβάνει το κέντρο προσδέσεως των μεταφραστικών παραγόντων, το οποίο πυροδοτεί τη GTPase δραστηριότητα των G-πρωτεϊνικών παραγόντων, που εμπλέκονται στη μετατόπιση των υποστρωμάτων και άλλες ριβοσωματικές λειτουργίες. Έχει υποτεθεί ότι το 5S rRNA παίζει ουσιώδη ρόλο στη συγκρότηση του κέντρου της PTase και στη μετάδοση σημάτων μεταξύ του καταλυτικού κέντρου και των ριβοσωματικών συστατικών που διεκπεραιώνουν τη μετατόπιση των υποστρωμάτων. Το ιοντικό περιβάλλον φαίνεται να επηρεάζει καθοριστικά τη διαμόρφωση του 5S rRNA. Για παράδειγμα, έχει βρεθεί ότι οι πολυαμίνες δεσμεύονται εκλεκτικά στο 5S rRNA και επηρεάζουν τη δραστικότητα του έναντι του διμεθυλο-θεϊκού, ενός αντιδραστηρίου-ιχνηθέτη της τριτοταγούς δομής του RNA. Αρχικά ελέγξαμε αν υπάρχουν εξειδικευμένες θέσεις πρόσδεσης των πολυαμινών στο 5S rRNA. Στη συνέχεια, με σκοπό να ελέγξουμε αν η πρόσδεση των πολυαμινών επηρεάζει τη λειτουργία του 5S rRNA, 70S ριβοσώματα προγραμματισμένα με πολύ-ουριδυλικό σχηματίσθηκαν από 50S υπομονάδες, ολικά ή εκλεκτικά φωτοσημασμένες με ένα φωτοδραστικό ανάλογο της σπερμίνης και από 30S ακατέργαστες υπομονάδες. Αυτά τα ριβοσώματα είχαν την ικανότητα να δεσμεύουν AcPhe-tRNA ελαφρώς ισχυρότερα, σε σύγκριση με ριβοσώματα συγκροτημένα από φυσικά συστατικά, μη περιέχοντα πολυαμίνες. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι η πρόσδεση πολυαμινών στο 5S rRNA επηρεάζει, σε μικρό βαθμό, τη λειτουργία του παράγοντα επιμήκυνσης EF-Tu. Συζευγμένα, όμως, τα εν λόγω ριβοσώματα με tRNAPhe στην Ε-θέση και AcPhe-tRNAστην Ρ-θέση, επέδειξαν ισχυρότερη καταλυτική δραστικότητα και αυξημένη ικανότητα για μετατόπιση των υποστρωμάτων. Τα αποτελέσματα αυτά εισηγούνται σημαντική εμπλοκή των πολυαμινών στο λειτουργικό ρόλο του 5S rRNA κατά την κατάλυση και μετατόπιση των υποστρωμάτων. / In bacteria, the large ribosomal subunit comprises two RNA species, 23S and 5S rRNA, and 33 proteins. Peptide bond formation and peptide release are catalyzed by the large subunit, where the peptidyltransferase (PTase) center is located. In addition to this center, which triggers the GTPase activities of G-protein factors involved in translocation and other ribosomal functions. It has been hypothesized that 5S rRNA plays essential role in assembling the PTase center and mediating signal transmissions between this center and the translocation machinery. Furthermore, the ionic environment seems to affect the conformation of 5S rRNA. For instance, polyamines have been found to bind specifically to 5S rRNA and influence the 5S rRNA reactivity towards dimethyl-sulfate (DMS), a chemical probe of RNA tertiary structure. Initially we examined whether there are specific sites for binding of polyamines. To test whether the binding of polyamines influence the function of 5S rRNA poly(U)-programmed 70S ribosomes were reconstituted from 50S subunits, totally or specifically photolabelled in their 5S rRNA with a photoreactive analogue of spermine, and native 30S subunits. These ribosomes were found to enzymatically bind AcPhe-tRNA better than ribosomes reconstituted from native components. This means, that furnishing 5S rRNA with spermine slightly influences the elongation factor EF-Tu function. However, equipped with tRNAPhe at the A-site and AcPhe-tRNA at the P-site, these ribosomes exhibited higher catalytic activity and enhanced tRNA translocation efficiency. These results suggest an essential impact of polyamines on the functional role of 5S rRNA in catalysis and translocation of translation substrates.

Ο σκοπός της παρούσας διατριβής εστιάζεται στη διερεύνηση της λειτουργίας και της δομής του ευκαρυωτικού ριβοσώματος. Συγκεκριμένα, ερευνά την επίδραση ορισμένων συστατικών του ριβοσωματικού RNA (rRNA) της μεγάλης και της μικρής υπομονάδας του ριβοσώματος αλλά και ορισμένων εξωριβοσωματικών συστατικών επί της πιστής αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας, επί της ικανότητας κατάλυσης του σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού, αλλά και επί της μετατόπισης του πεπτιδυλο-tRNA από την Α στην Ρ ριβοσωματική περιοχή. Τέλος, διερευνήθηκε για πρώτη φορά σε ευκαρυωτικά κύτταρα, η πιθανότητα συσχέτισης της πιστότητας με την οποία επιτελούν τα κύτταρα τη μετάφραση με την οξειδωτική τους κατάσταση. Η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε περιλαμβάνει α) τον προσδιορισμό της συχνότητας λάθους (E.F) in vitro, η οποία αποτελεί μέτρο της πιστότητας της μετάφρασης, β) τον προσδιορισμό της ταχύτητας κατάλυσης του σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού που αποτελεί μέτρο της ενεργότητας της ριβοσωματικής πεπτιδυλοτρανσφεράσης και γ) την εξάρτηση του σταδίου μετατόπισης από την συγκέντρωση των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων και του κυκλοεξιμιδίου. Επιπλέον, διερευνήθηκε η επίδραση ορισμένων αντιβιοτικών, κυρίως της παρομομυκίνης και του κυκλοεξιμιδίου, in vivo και in vitro. Επίσης, προσδιορίστηκε η ικανότητα συγκρότησης των ριβοσωματικών υπομονάδων, των ακέραιων ριβοσωμάτων και των πολυσωμάτων. Τέλος, προσδιορίστηκαν χαρακτηριστικοί δείκτες της οξειδωτικής κατάστασης του κυττάρου. Παρά το γεγονός ότι συστατικά του rRNA είναι κυρίως υπεύθυνα για τη ριβοσωματική λειτουργία, τα αποτελέσματα της πρώτης ενότητας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η πιστότητα της μετάφρασης, η καταλυτική ενεργότητα αλλά και το στάδιο μετατόπισης της μετάφρασης καθορίζονται ως ένα βαθμό και από εξωριβοσωματικά συστατικά όπως είναι η φωσφατάση σερίνης/θρεονίνης SAL6 και το προϊόν του γονιδίου ASU9. Τα συμπεράσματα της δεύτερης θεματικής ενότητας δίνουν έμφαση στην συνεχή ενδοεπικοινωνία που υφίσταται μεταξύ των δυο ριβοσωματικών υπομονάδων. Πράγματι, ορισμένες μεταλλάξεις στο rRNA της μικρής υπομονάδας του ριβοσώματος επηρεάζουν εκτός από την κύρια λειτουργία αυτής, δηλαδή την αποκωδικοποίηση, και την ταχύτητα σχηματισμού πεπτιδικών δεσμών. Αντίστροφα, ορισμένες μεταλλάξεις στο rRNA της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος επηρεάζουν εκτός από την κύρια ενεργότητα αυτής, δηλαδή την ενεργότητα πεπτιδυλοτρανσφεράσης, και την πιστότητα της αποκωδικοποίησης. Ορισμένες εξ αυτών των μεταλλάξεων επηρεάζουν επίσης και το στάδιο της μετατόπισης. Στην τρίτη ενότητα αποδεικνύουμε ότι οι επιρρεπείς σε λάθη μεταλλάξεις παρουσιάζουν χαμηλότερο οξειδωτικό στρες ενώ οι υπερακριβείς μεταλλάξεις παρουσιάζουν υψηλότερο οξειδωτικό στρες. Μια ελκυστική ερμηνεία των αποτελεσμάτων είναι ότι όσο πιο υπερακριβές είναι ένα κύτταρο κατά τη μετάφραση τόσο περισσότερο είναι το ποσό της ενέργειας που πρέπει να καταναλώσει ώστε να εξασφαλίσει την αποφυγή λαθών κατά τη πρωτεϊνοσύνθεση, ελαττώνοντας κατά αυτό τον τρόπο το ποσό ενέργειας με το οποίο θα αντιμετωπίζονταν οι ελεύθερες ρίζες. / The aim of the present diatribe focuses on the function and the structure of the eukaryotic ribosome. Specifically, the influence of several ribosomal RNA (rRNA) residues from the small and the large ribosomal subunit as well as the influence of several extra-ribosomal elements on the accurate decoding of the genetic information, on the catalysis of peptide bond formation and on the translocation of peptidyl-tRNA from the A to the P ribosomal site, is investigated. In the last part, the possible correlation between translational fidelity and the cell’s oxidative status is determined for the first time in eukaryotic cells. The methodology that was applied includes a) the error frequency (E.F) determination that measures translational fidelity, b) the determination of the catalytic rate constant for peptide bond formation that reflects the ribosomal peptidyltransferase activity and c) the dependence of the translocation step on soluble protein factors concentration and on cycloheximide concentration. Moreover, we studied the effects of the antibiotics paromomycin and cycloheximide in vivo and in vitro. The assembly of ribosomal subunits, of ribosomes and of polysomes was also investigated. Finally, typical markers of the cell’s oxidative status were determined. Despite the fact that rRNA residues are mainly responsible for ribosomal function, the results from the first part of the thesis lead to the conclusion that the translational fidelity, the catalytic activity and the translocation step of translation are determined up to a certain level by extra-ribosomal elements such as the serine/threonine phosphatase SAL6 as well as the ASU9 gene product. The conclusions drawn from the second part of the diatribe point to the constant intercommunication between the two ribosomal subunits. Indeed, several mutations in the small ribosomal subunit rRNA not only affect its major function, i.e. the decoding process, but they also affect the rate of peptide bond formation. Reversely, several mutations in the large ribosomal subunit rRNA not only affect its major activity, i.e. the peptidyltransferase activity, but they also affect the accuracy of decoding. Some of these mutations influence also the translocation step of protein synthesis. In the third part, we prove that error-prone mutations display lower oxidative stress whereas the hyperaccurate mutations display higher oxidative stress. An attractive interpretation of these results is that a cell might spend more energy in order to achieve hyperaccuracy during translation thus reducing the amount of energy left in order to combat free radicals.

Escherichia coli ribosomal RNA (rRNA) is post-transcriptionally modified by site-specific enzymes. The role of most modifications is not known and little is known about how these enzymes recognize their target substrates. In this thesis, we have structurally and functionally characterized two S-adenosyl-methionine (SAM) dependent 23S rRNA methyltransferases (MTases) that act during the early stages of ribosome assembly in E. coli. RlmM methylates the 2'O-ribose of C2498 in 23S rRNA. We have solved crystal structures of apo RlmM at 1.9Å resolution and of an RlmM-SAM complex at 2.6Å resolution. The RlmM structure revealed an N-terminal THUMP domain and a C-terminal catalytic Rossmann-fold MTase domain. A continuous patch of conserved positive charge on the RlmM surface is likely used for RNA substrate recognition. The SAM-binding site is open and shallow, suggesting that the RNA substrate may be required for tight cofactor binding. Further, we have shown RlmM MTase activity on in vitro transcribed 23S rRNA and its domain V. RlmJ methylates the exocyclic N6 atom of A2030 in 23S rRNA. The 1.85Å crystal structure of RlmJ revealed a Rossmann-fold MTase domain with an inserted small subdomain unique to the RlmJ family. The 1.95Å structure of the RlmJ-SAH-AMP complex revealed that ligand binding induces structural rearrangements in the four loop regions surrounding the active site. The active site of RlmJ is similar to N6-adenine DNA MTases. We have shown RlmJ MTase activity on in vitro transcribed 23S rRNA and a minimal substrate corresponding to helix 72, specific for adenosine. Mutagenesis experiments show that residues Y4, H6, K18 and D164 are critical for catalytic activity. These findings have furthered our understanding of the structure, evolution, substrate recognition and mechanism of rRNA MTases.