Mutações do tipo ganho de função em FGFR2 causam a síndrome de Apert, uma doença rara caracterizada por craniossinostose e defeitos ósseos nos membros devidos a anormalidades na diferenciação e remodelamento ósseos. Apesar do periósteo ser uma importante fonte de células durante o remodelamento ósseo, seu papel nas craniossinostoses ainda é pouco conhecido. A S. de Apert é causada por mutações (p.S252W ou p.P253R) que levam a perda de especificidade de FGFR2 por seus ligantes e causam a ativação exacerbada do mesmo. Sabe-se que FGFR2 ativa vias de sinalização intracelulares como MEK/ERK, PI3-K e PLC. Nossa hipótese é que as células tronco mesenquimais (MSCs) e fibroblastos de pacientes com S. de Apert tem fenótipos celulares e vias de sinalização alterados que contribuem para o fechamento recorrente das suturas coronais. MSCs e fibroblastos foram obtidos do periósteo de pacientes portadores da S. de Apert (S252W) e indivíduos controles (WT). Nós analisamos a proliferação, migração e diferenciação osteogênica dessas células. A mutação S252W teve efeitos opostos em tipos celulares diferentes: MSCs S252W proliferaram menos que as S252W controle, enquanto fibroblastos S252W proliferaram mais que fibroblastos controle, além de terem aumento da migração. A presença da mutação S252W aumentou a diferenciação osteogênica in vitro e in vivo em ambos os tipos celulares estudados. Esse aumento de diferenciação osteogênica foi revertido pela inibição de JNK. Nós demonstramos que fibroblastos S252W podem induzir a diferenciação osteogênica em MSCs de periósteo, porém não em MSCs de outras fontes. Trabalhos anteriores mostraram que o gene da fosfatase DUSP2 está mais expresso em fibroblastos do periósteo de pacientes portadores da S. de Apert do que em controles. DUSP2 é capaz de desfosforilar membros das MAPKs, dentre estes p-JNK. Nesse trabalho mostramos que a ativação de FGFR2 regula os níveis proteicos de DUSP2 tanto em pacientes quanto em controles, porém por vias diferentes em cada caso, e que DUSP2 está regulando negativamente a fosforilação de JNK.Nós propomos que células do periósteo tem um papel mais importante no fechamento precoce das suturas cranianas do que se imaginava anteriormente e que moléculas da via JNK são fortes candidatas para o tratamento de pacientes da S. de Apert. / Apert Syndrome is cause by gain of Function mutations in FGFR2, a rare condition characterized by craniosynostosis and bone limb defects due to abnormalities in osteogenic differentiation and cone remodeling. Even though the periosteum acts as an important cell source during bone remodeling, its role in craniosynostosis is yet unknown. Apert syndrome is caused by one of two mutations (p.S252W or p.P253R) leading to loss of specificity of FGFR2 by its ligands leading to increased activation of the receptor. It is known that FGFR2 activates the MEK/ERK, PI3-K and PLC signaling pathways. Our hypothesis is that Apert syndrome patients\'\' Mesenchimal Stem Cells (MSCs) and fibroblasts have altered cellular phenotye and signaling pathways which may contribute to the premature closure of the coronal sutures. MSCs and fibroblasts were obtained from the periosteum of Apert syndrome patients bearing the p.S252W mutation and from wild-type (WT) individuals. The p.S252W mutation had opposite effects on different cell types: MSCs p.S252W proliferated less than WT, while p.S252W fibroblasts showed increased proliferation and migration when compared to WT fibroblasts. The presence of the p.S252W mutation increased the osteogenical differentiation in vitro and in vivo in both cell types. We also demonstrated that p.S252W fibroblasts can increase the osteogenic differentiation of MSCs from the periosteum, but not from other sources. is negatively controlling the phosphorylation of JNK. We propose that cells from the periosteum have a more significant role in the premature closure of the cranial sutures than previously thought and that molecules of the JNK pathway are strong candidates for the treatment of Apert syndrome. Previous works have shown that the DUSP2 gene had increased expression in periosteum derived fibroblasts of Apert syndrome patients then in WT. DUSP2 is a phosphatase capable of dephosphorylate members of the MAPK family, including p-JNK. In this work we have shown that FGFR2 activation regulates the proteic levels of DUSP2 in both patients and control derived fibroblasts, however this control is exercised by different pathways in each case. We also demonstrated that DUSP2

O crânio é composto de estruturas que interagem entre si formando um sistema complexo, como os ossos da caixa craniana unidos por tecido fibroso (sutura), o qual exerce função importante durante o desenvolvimento do indivíduo até a idade adulta. Ao fenômeno de fusão prematura das suturas dá-se o nome de craniossinostose que, em 32% dos casos com diagnóstico molecular, são causados por mutações no gene FGFR2. A via de sinalização por FGF já foi implicada tanto em processos biológicos mitogênicos, regulatórios, morfológicos quanto em processos endócrinos. A síndrome de Apert representa 4% de todos os casos de craniossinostose e as duas mutações mais frequentes encontradas nestes pacientes, S252W (64%) e P253R (26%), aumentam a afinidade de ligação dos receptores das isoformas epiteliais e mesenquimais do receptor por quase todos os FGFs e levam à perda de especificidade aos ligantes. Entretanto, a literatura acerca das características celulares aberrantes causadas por mutações desta síndrome é controversa. Atualmente, muitos estudos têm apontado a importância do periósteo, tecido fibroso rico em células que recobre os ossos, na regeneração óssea, não só através de sinalização parácrina, mas também como fonte de células osteoprogenitoras. Neste contexto, há poucos trabalhos na literatura. Nossa hipótese principal é verificar se o periósteo contribui para a fusão, prematura e pós-cirúrgica, das suturas coronais na Síndrome de Apert. Neste caso, a nossa expectativa é as células que compõem este tecido, como por exemplo, fibroblastos e células-tronco mesenquimais, tenham funções celulares como proliferação, migração e diferenciação anômalas em resposta a vias de sinalização intracelulares alteradas. Assim sendo, nossos objetivos foram verificar se a mutação S252W tem um efeito funcional/celular semelhante em duas diferentes potenciais células osteoprogenitoras: fibroblasto e células-tronco mesenquimais; e verificar se diferentes ligantes a FGFR2, os FGFs, atuam diferentemente nas funções destas mesmas células com mutação S252W. De forma geral, nossos resultados revelaram as diferenças funcionais entre fibroblastos e células-tronco mesenquimais (MSCs) provenientes de pacientes com síndrome de Apert, sendo que as funções dos fibroblastos mutados estão mais comprometidas do que as funções das MSCs. Além disso, os fibroblastos S252W têm efeito positivo sobre as MSCs, selvagem ou mutadas, enquanto que o oposto não ocorre. A inibição da fosforilação da JNK anula o efeito da mutação no processo de diferenciação osteogênica atípica de fibroblastos. Também mostramos que FGF2, FGF10 e FGF19 têm diferentes influências sobre o fenótipo de células com a mutação, que também difere entre os tipos celulares. O FGF19 é o fator que mais interfere no processo de ossificação nas células S252W. Nossa análise de perfil de expressão gênica mostrou que os FGFs modulam diferentes vias de sinalização em fibroblastos de pacientes com síndrome de Apert: o FGF2 está ligado a genes do sistema nervoso central, corroborado pelo estudo no modelo animal; o FGF10, a resposta imune e o FGF19 à ossificação. O estudo de células com mutação atípica mostra que a expressão ectópica da isoforma epitelial de FGFR2 está associada ao fenótipo clínico da Síndrome de Apert e parece ser também responsável pelo fenótipo atípico associado à transição epitélio-mesenquimal. Estes resultados nos possibilitaram inferir que o periósteo contribui para o processo de reossificação das suturas na Síndrome de Apert, e que tanto fibroblastos como células-tronco mesenquimais podem estar envolvidos neste processo. / The skull is composed of structures that interact with each other forming a complex system, sucha as the bones of the skull that are united by fibrous tissue (suture), which plays important role during the development of the individual until adulthood. The phenomenon of premature fusion of sutures is named as craniosynostosis, which are caused by mutations in the FGFR2 gene in 32% of the cases with molecular diagnosis. The FGF signaling pathway has been implicated in both mitogenic biological processes, regulatory, morphological and endocrine processes. Apert syndrome accounts for 4% of all cases of craniosynostosis and the two most frequent mutations found in these patients, S252W (64%) and P253R (26%), increase the binding affinity in mesenchymal and epithelial isoforms of the receptor for nearly all FGFs and lead to loss of ligand specificity. However, literature concerning the aberrant cellular characteristics caused by Apert syndrome mutations is controversial. Currently, many studies have highlighted the importance of the periosteum (a fibrous tissue rich in cells that covers the bones) in bone regeneration, not only through paracrine signaling, but also as a source of osteoprogenitor cells. In this regard, there are few studies in literature. Our main hypothesis is to verify whether the periosteum contributes to premature and post-surgical fusion of the coronal sutures in Apert syndrome. In this case, we expect that the cells that compose this tissue, such as fibroblasts and mesenchymal stem have abnormal cell functions such as proliferation, migration and differentiation in response to altered intracellular signaling pathways. Our objectives were to verify if the S252W mutation has a similar functional/cellular effect in two different potential osteoprogenitor cells: fibroblasts and mesenchymal stem cells; and to verify whether different ligands to FGFR2, the FGFs, act differently in these cells with S252W mutation. Overall, our results reveal functional differences between fibroblasts and mesenchymal stem cells (MSCs) from patients with Apert syndrome, and that these functions are more impaired in the mutant fibroblasts. Moreover, the S252W fibroblasts have positive effect on the osteogenic differentiation of MSCs (wild-type and mutant) whereas the opposite does not occur. Inhibition of JNK phosphorylation nullifies the effect of atypical osteogenic differentiation of mutant fibroblasts. We also show that FGF2, FGF10 and FGF19 have different influences on the phenotype of mutant cells, which also differs between cell types. The FGF19 is the main factor that interferes with the process of ossification of S252W cells. Our analysis of gene expression profile showed that FGFs modulate different signaling pathways in fibroblasts from Apert syndrome patients: while FGF2 gene is linked to the central nervous system, supported by studies in animal model, FGF10 is associated to immune response and FGF19, to ossification. The study of cells with atypical mutation shows that the ectopic expression of the epithelial isoform of FGFR2 generates the clinical phenotype of Apert syndrome, but also leads to an atypical phenotype associated with epithelial-mesenchymal transition. These results enabled us to infer that the periosteum contributes to the process of suture reossification in Apert syndrome, and that both fibroblast and mesenchymal stem cells may be involved in this process.

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A displasia coxo-femoral tem sido descrita como moléstia de origem genética, caracterizada por incongruência articular, com alterações dos tecidos conectivos da articulação. Podendo afetar qualquer raça, é particularmente prevalente em raças grandes e gigantes e está apontada como a principal causa do desenvolvimento de osteoartrite em cães. Muitas técnicas são apontadas para o tratamento destes quadros, e novas pesquisas têm sido desenvolvidas no intuito de se obter técnicas mais eficazes e menos cruentas, diminuindo também o tempo de recuperação. Destas, a denervação da articulação coxo-femoral surge como técnica simples e eficaz que recupera a atividade funcional dos membros afetados em tempo significativamente menor em relação às demais. Esta técnica consiste em remoção do periósteo acetabular, eliminando as fibras nervosas sensitivas da região com conseqüente promoção da analgesia. Este estudo visou quantificar as fibras nervosas presentes na região descrita, relacionando a densidade encontrada com a técnica cirúrgica, na intenção de torná-la mais precisa e eficaz. Foram utilizados 30 acetábulos, provenientes de 15 cães, machos e fêmeas, com peso variando entre 22,0 Kg e 62,0 Kg. A dissecção macroscópica revelou simetria bilateral com variação individual da enervação regional, com ramos originados dos nervos glúteo cranial, isquiático e femoral. A enervação do periósteo acetabular foi estudada por método de impregnação pela prata e os resultados obtidos apontam uma diferença estatística significativa entre a densidade (fibras/mm2) da região crânio-lateral em relação à região caudo-lateral do acetábulo. Demonstraram ainda haver simetria entre os antímeros estudados. As fibras nervosas apresentam disposição quase vertical no periósteo acetabular, em direção à cápsual articular, o que sugere a densidade nervosa também presente na região. / Hip dysplasia has been described as a genetic disease, caracterized by articular incongruence with alterations in the articular connective tissues. It may affect all breeds, prevailing in large and very large ones and it is supposedly the main cause in the development of osteoarthrites in dogs. Many techniques are indicated for the treatment of this disease, and new researches are being developed in the meaning of obtaining more efficient and less traumatic techniques, keeping the post operative time as short as possible. Among these, the denervation of the hip joint capsule comes as a simple and effective technique, that recovers the functional activity of the affected limbs in significantly less time then the others. This surgical procedure consists in removing the acetabular periosteum, eliminating the nervous fibers with consequent analgesy This study tried to quantify the nervous fibers present in the mentioned region, relating the density found with the surgical technique, intending to make it more efficient. Thirty acetabular fragments, from 15 dogs, both male and female, weighting between 22,0 and 62,0 Kg, were used. Macroscopic dissection showed bilateral symmetry, with individual variation of regional innervation, and branches from the cranial gluteal, ischiaticus and femoral nerves. The acetabular periosteal innervation was studied by silver staining and the results showed a significatn difference between the nervous fiber density (fibers/mm2) of the cranial lateral portion and caudal lateral portions of the acetabulum. They also showed both antimeres are symmetric. Nervous fibers are positioned almost in a vertical position in the acetabular periosteum, running directed to the joint capsule, suggesting nervous density also in that region.

Les troubles musculo-squelettiques représentent la deuxième cause d'invalidité dans le monde et des millions de personnes subissent une fracture chaque année. Bien que la régénération osseuse soit un processus efficace permettant à l'os de récupérer sa structure et ses fonctions initiales, 10% des fractures ne guérissent pas correctement et peuvent entraîner un retard de régénération ou une non-consolidation osseuse. Le processus de régénération osseuse repose sur l'activation de cellules souches squelettiques (CSS), dont les origines et les mécanismes d'action sont encore mal caractérisés. De nombreuses études se sont concentrées sur les cellules stromales de la moelle osseuse (CSM) comme source principale de CSS pour le processus de régénération osseuse endogène et les thérapies cellulaires. Cependant, notre laboratoire et d'autres équipes ont récemment montré que le périoste est une source majeure de cellules qui contribuent à la formation de cartilage et d’os dans le cal alors que les CSM ont une contribution minimale et restreinte au compartiment de moelle osseuse pendant la régénération. Le but de ce projet est de caractériser les cellules souches squelettiques du périoste et comparer leur potentiel de régénération in vitro et in vivo avec les cellules stromales de la moelle osseuse. Nous avons mis au point des cultures primaires de cellules issues du périoste (CPs) et de la moelle (CSMs) de souris. Les CPs et les CSMs expriment des marqueurs communs et peuvent se différencier dans les trois lignages mésenchymateux (ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes) in vitro. In vitro les CPs ont un potentiel clonogénique et une croissance cellulaire plus élevés que les CSMs. Malgré l’origine embryonnaire commune des CPs et CSMs, les CPs n’ont pas les mêmes fonctions aux stades postnatal et adulte. Après transplantation au site de fracture, les CPs ont un meilleur potentiel d’intégration au centre du cal dans le cartilage et l’os comparé aux CSMs. Les CPs persistent dans le cal à long terme et peuvent reconstituer un pool de CPs dans le périoste nouvellement formé après régénération, permettant d’être mobilisées à nouveau après des blessures successives. Par des analyses transcriptomiques des CPs et CSMs isolées avant et après fracture, nous avons caractérisé les profiles moléculaires des CPs et des CSMs et mis en évidence une réponse à la blessure plus importante chez les CPs. Le gène Periostin (Postn) et d’autres gènes codant pour des protéines de la matrice extracellulaire liées à Postn sont surexprimées dans les CPs activées par la fracture. L’expression de POSTN est détectée dans le périoste et dans le cal pendant tout le processus de régénération osseuse. Les souris invalidées pour Postn ont un phénotype de régénération osseuse anormale marqué par la formation de fibrose et une absence de consolidation osseuse. Ce phénotype est dû à une déficience du périoste et des CPs chez les souris Postn mutantes. En absence de Postn, le reconstitution du périoste et du pools de CPs à long terme est abolie entraînant une incapacité du périoste mutant à participer à la réparation osseuse après une seconde blessure. En conclusion, ce travail a mis en évidence que le périoste contient une population de CSS avec un potentiel de régénération élevé pour la réparation osseuse endogène comparé aux CSMs. Nous montrons que Périostine est une protéine clé du périoste, régulant la capacité des CPs à répondre aux blessures et permettant de maintenir l’intégrité du périoste et le pool de CPs à long terme. Le périoste et les cellules souches du périoste pourraient donc être une meilleure cible pour augmenter la régénération osseuse cliniquement. / Musculoskeletal disorders represent the second cause of disability worldwide. Among them, bone repair defects occur in 10% of patients that sustain a fracture causing delayed union or non-union. Bone regeneration is normally an efficient process allowing bone to recover its proper shape and functions, and relying on the activation of skeletal stem cells (SSCs), that are still poorly characterized. Numerous studies have concentrated on bone marrow stromal cells/skeletal stem cells (BMSCs) to understand the role of SSCs in bone regeneration and for cell-based therapies. Recently, our laboratory and others have shown that the periosteum is a major source of cells that contribute to cartilage and bone formation in the fracture callus while BMSC’s contribution to the endogenous repair process is minimal and restricted to the bone marrow compartment. Here, we aimed to characterize skeletal stem cells within periosteum and compare their in vitro and in vivo regenerative potential with BMSCs. We established primary cultures of periosteal cells (PCs) and BMSCs in mice and showed that PCs and BMSCs express similar markers by FACS and qRT-PCR and can differentiate into the three mesenchymal lineages (osteoblasts, adipocytes and chondrocytes) in vitro. We show that although PCs and BMSCs have common embryonic origins, PCs exhibit superior bone regenerative potential in mature bones with higher CFU-F activity, cell growth and migration capacity in vitro compared to BMSCs. By lineage tracing after transplantation at fracture sites in vivo, we show that PCs can better contribute to cartilage and bone and integrate long-term in the callus compared to BMSCs. Using a periosteum graft approach, we show that PCs can repopulate the periosteum after injury and are mobilized again after subsequent injuries to repair bone. Microarray analyses of PCs and BMSCs isolated from intact and injured tibias 3 days post fracture show an enhanced molecular response to injury of PCs. Periostin (Postn) and other genes encoding extracellular matrix (ECM) proteins linked to Postn were up-regulated in activated PCs. Postn expression was detected in the periosteum and the callus through all stages of bone regeneration and Postn deficient mice have impaired bone regeneration leading to fibrosis and non-union. This phenotype is due to a deficient periosteum and PCs as shown by in vitro and in vivo experiments. Moreover, the capacity of PCs to repopulate the newly formed periosteum and contribute to repair after a second injury is abolished in the absence of Periostin. In conclusion, this work shows that periosteum comprises SSCs with high bone regenerative potential for endogenous bone repair compared to BMSCs. We show that Periostin is a key ECM component of the periosteum regulating the ability of PCs to respond to injury, participate in skeletal repair and maintain the pool of PCs in the periosteum. SSCs within periosteum are therefore a promising target to augment bone regeneration clinically.

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A displasia coxo-femoral tem sido descrita como moléstia de origem genética, caracterizada por incongruência articular, com alterações dos tecidos conectivos da articulação. Podendo afetar qualquer raça, é particularmente prevalente em raças grandes e gigantes e está apontada como a principal causa do desenvolvimento de osteoartrite em cães. Muitas técnicas são apontadas para o tratamento destes quadros, e novas pesquisas têm sido desenvolvidas no intuito de se obter técnicas mais eficazes e menos cruentas, diminuindo também o tempo de recuperação. Destas, a denervação da articulação coxo-femoral surge como técnica simples e eficaz que recupera a atividade funcional dos membros afetados em tempo significativamente menor em relação às demais. Esta técnica consiste em remoção do periósteo acetabular, eliminando as fibras nervosas sensitivas da região com conseqüente promoção da analgesia. Este estudo visou quantificar as fibras nervosas presentes na região descrita, relacionando a densidade encontrada com a técnica cirúrgica, na intenção de torná-la mais precisa e eficaz. Foram utilizados 30 acetábulos, provenientes de 15 cães, machos e fêmeas, com peso variando entre 22,0 Kg e 62,0 Kg. A dissecção macroscópica revelou simetria bilateral com variação individual da enervação regional, com ramos originados dos nervos glúteo cranial, isquiático e femoral. A enervação do periósteo acetabular foi estudada por método de impregnação pela prata e os resultados obtidos apontam uma diferença estatística significativa entre a densidade (fibras/mm2) da região crânio-lateral em relação à região caudo-lateral do acetábulo. Demonstraram ainda haver simetria entre os antímeros estudados. As fibras nervosas apresentam disposição quase vertical no periósteo acetabular, em direção à cápsual articular, o que sugere a densidade nervosa também presente na região. / Hip dysplasia has been described as a genetic disease, caracterized by articular incongruence with alterations in the articular connective tissues. It may affect all breeds, prevailing in large and very large ones and it is supposedly the main cause in the development of osteoarthrites in dogs. Many techniques are indicated for the treatment of this disease, and new researches are being developed in the meaning of obtaining more efficient and less traumatic techniques, keeping the post operative time as short as possible. Among these, the denervation of the hip joint capsule comes as a simple and effective technique, that recovers the functional activity of the affected limbs in significantly less time then the others. This surgical procedure consists in removing the acetabular periosteum, eliminating the nervous fibers with consequent analgesy This study tried to quantify the nervous fibers present in the mentioned region, relating the density found with the surgical technique, intending to make it more efficient. Thirty acetabular fragments, from 15 dogs, both male and female, weighting between 22,0 and 62,0 Kg, were used. Macroscopic dissection showed bilateral symmetry, with individual variation of regional innervation, and branches from the cranial gluteal, ischiaticus and femoral nerves. The acetabular periosteal innervation was studied by silver staining and the results showed a significatn difference between the nervous fiber density (fibers/mm2) of the cranial lateral portion and caudal lateral portions of the acetabulum. They also showed both antimeres are symmetric. Nervous fibers are positioned almost in a vertical position in the acetabular periosteum, running directed to the joint capsule, suggesting nervous density also in that region.