Orientador: Vera Lúcia Mores Rall / Abstract: Salmonella spp. é uma bactéria entérica, responsável por graves doenças de origem alimentar e um dos principais agentes envolvidos em surtos no mundo todo. A contaminação ocorre, principalmente pelo consumo de carne de frango e ovos, uma vez que esses animais podem ser portadores de vários sorovares patogênicos para o homem. O objetivo do estudo foi avaliar o potencial patogênico de 40 cepas de Salmonella spp., isoladas de esteiras de um abatedouro de aves, por testes fenotípicos de adesão, invasão e produção de biofilme e análise genotípica da presença de vários genes relacionados com fatores de virulência, além de verificar sua persistência no ambiente e sua susceptibilidade a antimicrobianos por disco-difusão. Foi observada resistência à tetraciclina (17,5%) ampicilina (10%), cefotaxima (7,5%), cotrimoxazol (5%) e cloranfenicol (2,5%). Todas as cepas apresentaram os genes invA, sipB, sipD, ssaR, sifA, sitC, iroN, tolC, flgK, fljB e flgL. Os genes sopB e sipA estavam presentes em 92,5% dos isolados, enquanto sopD e spvB foram observados em 90% e 32,5% das cepas, respectivamente. Todos os isolados aderiram e invadiram células HeLa, com índice de invasão variando de 1,4 a 73,8%. Com relação à produção de biofilme, 31 (77,5%) cepas foram capazes de produzir biofilme em microplacas de poliestireno. Pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), detectou-se a persistência de clones no ambiente por até 18 semanas, entre as 20 amostradas. Não foi possível o estabelec... (Complete abstract click electronic access below) / Resumo: Salmonella spp. is an enteric bacterium responsible for serious foodborne disease, being one of the main agents involved in outbreaks worldwide. Contamination occurs mainly by poultry and egg consumption once these animals carry some pathogenic serotypes for the human being. Our aim was to evaluate the pathogenic potential of 40 strains of Salmonella spp., isolated from poultry slaughterhouse mats, by adhesion and invasion phenotypic tests, and biofilm production, and genotypic analysis to identify genes related to virulence factors, besides we verified its environment persistence and its antimicrobial susceptibility by disc-diffusion. We observed resistance to tetracycline (17.5%), ampicillin (10%), cefotaxime (7.5%), cotrimoxazole (5%) and chloramphenicol (2.5%). All strains possessed invA, sipB, sipD, ssaR, sifA, sitC, iroN, tolC, flgK, fljB and flgL genes. The genes sopB and sipA was present in 92.5% of the isolates, while sopD and spvB were observed in 90% and 32.5% of the strains, respectively. All strains adhered and invaded HeLa cells, with invasion index varying from 1.4 to 73.8%. Regarding to biofilm production, 31 (77.5%) strains were able to produce biofilm on polystyrene microplates. The Pulsed-field gel electrophoresis technique (PFGE) detected the existence of clones in the environment for up to 18 weeks, among de 20 sampled. It was not possible to establish a correlation between adhesion and invasion rates and the presence/absence of effector protein coding ge... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

A aplicação de métodos de tipificação baseados na caracterização fenotípica e genotípica em vários pontos da cadeia de produção de suínos pode ser uma importante ferramenta para identificar a principal fonte de contaminação por Salmonella sp. A partir disso, o trabalho propôs tipificar uma coleção de 97 amostras de Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium (ST) isolada de suínos levados ao abate em três diferentes frigoríficos no Rio Grande do Sul, por meio de fagotipificação, hibridização com IS200, resistência a antimicrobianos, amplificação da região spvR, amplificação de sequências repetitivas (rep-PCR) e PFGE. Paralelamente, os isolados de ST foram avaliados frente a dois desinfetantes (amônia quaternária e iodofor) pela técnica da diluição em tubo. Os isolados foram classificados em 12 fagotipos distintos, sendo o DT177 o mais freqüentemente identificado. Houve o predomínio de um padrão único de hibridização com o IS200 e em apenas três isolados, a região spvR foi detectada. Um alto número de amostras resistentes à tetraciclina, sulfonamida e estreptomicina foi encontrado, sendo o perfil de resistência relacionado ao frigorífico de origem dos isolados. No rep-PCR, usando seqüências iniciadoras para REP e ERIC, um único padrão de bandas foi gerado entre os isolados de ST. A análise por PFGE mostrou doze diferentes padrões de bandas. Sessenta e quatro isolados apresentaram um padrão idêntico no PFGE. Todas amostras foram inibidas pelo composto quaternário de amônio, na concentração recomendada pelo fabricante e numa concentração inferior à indicada. Frente ao iodofor, quatro amostras mostraram-se resistentes na concentração indicada e 59 na sub-concentração. A combinação da fagotipificação e do perfil de PFGE permitiu alcançar uma melhor discriminação das amostras, sendo essas técnicas consideradas as mais adequadas. Por outro lado, a presença de linhagens clonais parecem estar presentes na região, indicando possíveis pontos comuns de infecção.

A aplicação de métodos de tipificação baseados na caracterização fenotípica e genotípica em vários pontos da cadeia de produção de suínos pode ser uma importante ferramenta para identificar a principal fonte de contaminação por Salmonella sp. A partir disso, o trabalho propôs tipificar uma coleção de 97 amostras de Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium (ST) isolada de suínos levados ao abate em três diferentes frigoríficos no Rio Grande do Sul, por meio de fagotipificação, hibridização com IS200, resistência a antimicrobianos, amplificação da região spvR, amplificação de sequências repetitivas (rep-PCR) e PFGE. Paralelamente, os isolados de ST foram avaliados frente a dois desinfetantes (amônia quaternária e iodofor) pela técnica da diluição em tubo. Os isolados foram classificados em 12 fagotipos distintos, sendo o DT177 o mais freqüentemente identificado. Houve o predomínio de um padrão único de hibridização com o IS200 e em apenas três isolados, a região spvR foi detectada. Um alto número de amostras resistentes à tetraciclina, sulfonamida e estreptomicina foi encontrado, sendo o perfil de resistência relacionado ao frigorífico de origem dos isolados. No rep-PCR, usando seqüências iniciadoras para REP e ERIC, um único padrão de bandas foi gerado entre os isolados de ST. A análise por PFGE mostrou doze diferentes padrões de bandas. Sessenta e quatro isolados apresentaram um padrão idêntico no PFGE. Todas amostras foram inibidas pelo composto quaternário de amônio, na concentração recomendada pelo fabricante e numa concentração inferior à indicada. Frente ao iodofor, quatro amostras mostraram-se resistentes na concentração indicada e 59 na sub-concentração. A combinação da fagotipificação e do perfil de PFGE permitiu alcançar uma melhor discriminação das amostras, sendo essas técnicas consideradas as mais adequadas. Por outro lado, a presença de linhagens clonais parecem estar presentes na região, indicando possíveis pontos comuns de infecção.

Orientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha / Resumo: Indivíduos colonizados podem contribuir para disseminação de Staphylococcus aureus, que se destaca por sua patogenicidade e alta frequência, capaz de produzir doenças tanto em indivíduos sadios quanto em imunocomprometidos, sendo esse risco aumentado na imunodeficiência humana (HIV/aids). Esse estudo teve como objetivos determinar a relação clonal de MRSA (Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina) e MSSA (Staphylococcus aureus Sensível à Meticilina) entre as cepas isoladas de pessoas vivendo com HIV/aids (PVHA) e seus contactantes domiciliares, e os fatores de virulência que podem contribuir para o carreamento desses micro-organismos. S. aureus foram isolados da nasofaringe e orofaringe de 368 PVHA do Serviço de Ambulatórios Especializados de Infectologia “Domingos Alves Meira” (SAE/DAM) do complexo da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB) e Fundação para o Desenvolvimento Médico Hospitalar (FAMESP), sendo 112 residentes em Botucatu e 256 provenientes de cidades da região. A técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) foi utilizada para detecção do gene mecA, genes das enterotoxinas (sea, seb, e sec-1), esfoliatinas A e B (eta e etb), toxina 1 da síndrome do choque tóxico (tst), leucocidina Panton–Valentine (lukS-PV e lukF-PV), hemolisinas alfa e delta (hla and hld) e biofilme (icaA e icaD) e para tipagem do SCCmec. Para a tipagem molecular foi utilizado a técnica de Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Multilocus Sequence Typing (MLST) e spa Typing. Os pacient... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Colonized individuals may contribute to the dissemination of Staphylococcus aureus, which stands out for its pathogenicity and high frequency, capable of producing diseases in both healthy and immunocompromised individuals, with an increased risk of human immunodeficiency (HIV/AIDS). This study aimed to determine the clonal relationship between MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus) and MSSA (Methicillin-Sensitive Staphylococcus aureus) between strains isolated from people living with HIV/aids (PLHA) and their home contacts, and virulence factors which may contribute to the transport of these microorganisms. S. aureus were isolated from the nasopharynx and oropharynx of 368 PLHA from the Specialized Outpatient Services “Domingos Alves Meira” (SAE/DAM) of the Botucatu Medical School (FMB) and Hospital Medical Development Foundation (FAMESP), of which 112 were residents in Botucatu and 256 from cities in the region. The PCR (Polymerase Chain Reaction) technique was used to detect the mecA gene, enterotoxin genes (sea, seb, and sec-1), esfoliatins A and B (eta and etb), toxic shock syndrome toxin 1 (tst), Panton-Valentine leukocidin (lukS-PV and lukF-PV), alpha and delta hemolysins (hla and hld) and biofilm (icaA and icaD) and for typing SCCmec. For molecular typing were used techniques of the Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), Multilocus Sequence Typing (MLST) and spa Typing. The patients residing in Botucatu were invited to more two collections with the inclu... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by ANNY LUCIA DEL PILAR CELIS ESTUPIÑAN (annycelismvz@gmail.com) on 2016-09-21T02:37:36Z No. of bitstreams: 1 dissertação_anny final.pdf: 1389696 bytes, checksum: d3ced47a06c0e72bc76157c5c15980a8 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-09-22T20:57:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 celisestupinan_alp_me_jabo.pdf: 1389696 bytes, checksum: d3ced47a06c0e72bc76157c5c15980a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-22T20:57:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 celisestupinan_alp_me_jabo.pdf: 1389696 bytes, checksum: d3ced47a06c0e72bc76157c5c15980a8 (MD5) Previous issue date: 2016-04-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Salmonella Gallinarum (SG) é o agente etiológico do tifo aviário (TA), uma doença sistêmica grave responsável por perdas econômicas para a indústria avícola em todo o mundo. TA foi considerado sob controle no Brasil e em países desenvolvidos. No entanto, nos últimos anos, inúmeros surtos dessa enfermidade têm sido identificados em lotes de aves de vários estados do Brasil. Com intuito de investigar fatores que pudessem ajudar a compreender a epidemiologia destes surtos, o presente estudo foi realizado. Foram avaliadas: (i) as possíveis alterações na patogenicidade de uma estirpe de SG isolada de um dos surtos recentes de TA, para as aves de linhagens comerciais utilizadas atualmente no Brasil; (ii) as possibilidades de transmissão de SG por via vertical e durante a incubação de ovos; (iii) a influência do uso antimicrobianos na persistência de SG na ave e consequente transmissão vertical; (iv) os perfis genéticos das estirpes isoladas anteriormente e, recentemente, por PFGE. No presente estudo, aves de linhagens mais suscetíveis infectadas por SG apresentaram alterações patológicas de maior intensidade e altas taxas de mortalidade, enquanto que as aves de linhagens mais resistentes apresentaram a mortalidade e sinais clínicos de forma mais branda. No entanto, foram capazes de manter SG por períodos mais longos que as aves de linhagens susceptíveis. SG não foi recuperada dos ovos produzidos por aves suscetíveis ou resistentes. A transmissão vertical não foi observada, embora aves recém-eclodidas foram infectadas por contato durante a incubação. Antibióticoterapia foi eficaz na redução da mortalidade, mas não foi capaz de eliminar a infecção e nem favoreceu a transmissão de SG via ovo. Estirpes de SG exibiram perfis genéticos muito semelhantes, sugerindo que eles vêm circulando nos lotes brasileiros há mais de 20 anos. Falhas em componentes do programa de biossegurança, provavelmente, podem ser responsáveis pela propagação FT no Brasil. / Salmonella Gallinarum (SG) causes fowl typhoid (FT) a severe systemic disease responsible for economic losses to the poultry industry worldwide. FT was considered under control in Brazil and in developed countries. Nonetheless, in recent years has been identified on farms in several states of Brazil. In order to investigate the epidemiological reasons behind this large FT outbreak, the present study was carried out to assess: (i) possible changes in the patogenicity of a strain of SG isolated from a recent outbreak to chickens of white and brown lines of layers; (ii) transmission through eggs and hatching; (iii) the interference of antibiotic to the persistence of SG in the bird and to vertical transmission; (iv) the genetic profiles of strains isolated previously and recently by PFGE. Susceptible lines showed extensive pathological changes and high mortality rates, whereas in resistant lines mortality and clinical signs were almost absent. Although, they could maintain SG for longer periods than the susceptible lines did. SG was not recovered from any egg laid by birds from susceptible or resistant either. Vertical transmission was not observed although newborn chicks were infected due the contact during incubation. Antibiotic therapy was effective at reducing mortality but was not able to clear the infection and neither to favour vertical transmission. Strains did exhibit very similar genetic profiles, suggesting they have been circulating in Brazilian flocks for more than 20 years. Failures in components of biosecurity programs, probably, would be the responsible for the FT spread in Brazil. / CNPq: 190778/2013-0

A aplicação de métodos de tipificação baseados na caracterização fenotípica e genotípica em vários pontos da cadeia de produção de suínos pode ser uma importante ferramenta para identificar a principal fonte de contaminação por Salmonella sp. A partir disso, o trabalho propôs tipificar uma coleção de 97 amostras de Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium (ST) isolada de suínos levados ao abate em três diferentes frigoríficos no Rio Grande do Sul, por meio de fagotipificação, hibridização com IS200, resistência a antimicrobianos, amplificação da região spvR, amplificação de sequências repetitivas (rep-PCR) e PFGE. Paralelamente, os isolados de ST foram avaliados frente a dois desinfetantes (amônia quaternária e iodofor) pela técnica da diluição em tubo. Os isolados foram classificados em 12 fagotipos distintos, sendo o DT177 o mais freqüentemente identificado. Houve o predomínio de um padrão único de hibridização com o IS200 e em apenas três isolados, a região spvR foi detectada. Um alto número de amostras resistentes à tetraciclina, sulfonamida e estreptomicina foi encontrado, sendo o perfil de resistência relacionado ao frigorífico de origem dos isolados. No rep-PCR, usando seqüências iniciadoras para REP e ERIC, um único padrão de bandas foi gerado entre os isolados de ST. A análise por PFGE mostrou doze diferentes padrões de bandas. Sessenta e quatro isolados apresentaram um padrão idêntico no PFGE. Todas amostras foram inibidas pelo composto quaternário de amônio, na concentração recomendada pelo fabricante e numa concentração inferior à indicada. Frente ao iodofor, quatro amostras mostraram-se resistentes na concentração indicada e 59 na sub-concentração. A combinação da fagotipificação e do perfil de PFGE permitiu alcançar uma melhor discriminação das amostras, sendo essas técnicas consideradas as mais adequadas. Por outro lado, a presença de linhagens clonais parecem estar presentes na região, indicando possíveis pontos comuns de infecção.

Les bactéries pathogènes opportunistes (BPO) sont responsables d'une grande part de la pathologie infectieuse bactérienne. Les BPO d'origine environnementale doivent subir des changements profonds de mode de vie pour s'adapter et coloniser l'homme. Comprendre les conditions de cette adaptation permettra de préciser la notion d'opportunisme infectieux et le rôle des BPO environnementales dans l'émergence des pathogènes.Les genres Ochrobactrum et Agrobacterium regroupent des bactéries présentant une grande variété de modes de vie et établissant différentes relations avec la cellule eucaryote. Ces bactéries connues pour vivre dans l'environnement sont par ailleurs des pathogènes opportunistes de l'homme principalement responsables d'infections chez les individus immunodéprimés. Dans le cadre de ce travail nous avons entrepris une étude populationnelle par une approche de génétique multilocus sur des collections de souches cliniques et environnementales de différentes origines géographiques. Les structures de population obtenues ont été confrontées à divers caractères phénotypiques reliés à la virulence et/ou l'adaptation chez l'homme, la température de croissance, la formation de biofilm et la virulence vis-à-vis des modèles Caenorhabditis elegans et macrophages humains.Ochrobactrum anthropi et Ochrobactrum intermedium sont les deux principales espèces d'intérêt médical du genre Ochrobactrum. La population d'O. anthropi est de type épidémique qui s'organise en deux complexes clonaux (CCs). Si le CC1 regroupe à la fois des souches de diverses origines, le CC4 ne contient que des souches cliniques. Cette sous-population apparait associée à l'homme même si les caractères phénotypiques étudiés ne révèlent pas de différences entre ces deux sous populations. De la même façon, ces deux CCs ne se distinguent pas par leur comportement en modèle macrophage ou par leur diversité génomique. O. intermedium, tout comme O. anthropi, présente une forte diversité génétique toutefois, aucun regroupement des souches en fonction de leur origine n'est mis en évidence pour cette espèce. La diversité des souches cliniques apparait aussi importante que celle de l'ensemble de la population. Plusieurs arguments suggèrent une niche étroite pour cette espèce, notamment une faible diversité génomique. Par ailleurs, le faible nombre de souches environnementales associé à une meilleure croissance planctonique à 37°C qu'à 25°C et 30°C suggèrent que l'homme pourrait constituer cette niche. L'étude de la virulence d'O. intermedium en modèle macrophage ou C. elegans met en évidence différents comportements, pour autant ceux-ci ne semblent pas liés à la structure de population. Certaines souches sont capables de se multiplier dans le modèle macrophage.L'étude du genre Agrobacterium par une approche multilocus sur une collection représentative des différents modes de vie de ces bactéries met en évidence, tout comme pour O. anthropi, une sous population clinique qui regroupe près de 80% des souches de cette origine. D'autres arguments tels que la croissance à 42°C confirment que le génovar A7 peut correspondre à une sous-population associée à l'homme. Les données obtenues seront confrontées aux connaissances sur d'autres bactéries pathogènes opportunistes d'origine environnementale comme Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia et les bactéries du complexe Burkholderia cepacia qui présentent également des sous populations associées à l'homme et/ou à certaines pathologies humaines. L'existence de ces sous populations suggère une spécialisation qui sera discutée dans le contexte de la spéciation des bactéries pathogènes afin de revisiter le concept d'opportunisme infectieux. / The opportunistic bacterial pathogens (OBP) cause the main part of bacterial infectious diseases. Environmental-borne OBP should encounter dramatic changes in lifestyle in order to colonize human beings. The conditions of this adaptation should precise concepts about OBP and emerging pathogens.The genera Ochrobactrum and Agrobacterium groups bacteria with versatile lifestyles that establish diverse relationships with the eukaryotic cells. These environmental-borne OBP caused diverse infectious diseases in immune-compromised patients. In this study, we undertook an approach of multilocus genetic on large population of environmental and clinical strains of Ochrobactrum and Agrobacterium. The population structures were compared to phenotypic traits related to adaptation and virulence in man, such as growth temperature, biofilm formation and virulence tested in Caenorhabditis elegans and human macrophages models.Ochrobactrum anthropi and Ochrobactrum intermedium are the two main Ochrobactrum species to be involved in human diseases. O. anthropi displays an epidemic population structure organized in two large clonal complexes (CCs). CC4 groups only human associated strains whereas CC1 contain environmental and clinical strains. Population genetics suggested that CC4 is a human-associated clone although phenotypic, genomic and virulence traits do not differ between CC1 and CC4 strains.As O. anthropi, O. intermedium displays a high genetic diversity without correlation between the genetic structure and the origin of strains. The level of genetic diversity among clinical strains appears as high as observed in the whole population. Several data such as a low level of genomic diversity suggested that O. intermedium is associated to a narrow ecological niche. The low number of environmental strains described for this species as well as an optimal growth at 37°C suggested that human beings could be the main niche for O. intermedium. Virulence in macrophage and C. elegans models showed diverse behaviour whereas some strains are able to survive and multiply in macrophages model.Multilocus genetics in a population of Agrobacterium spp. that displays diverse lifestyles, revealed a human associated population as observed for O. anthropi. The clinical genovar A7 groups 80% of the clinical strains included in the study, this strains growing at 42°C. Data obtained in this study will be confronted to the knowledge about other environmental-borne OBP such as Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia and bacteria belonging to the species complex Burkholderia cepacia. All these bacteria displayed sub-populations associated to man or to a particular human disease. These sub-populations suggest a specialization process that will be described in the context of the speciation of bacterial pathogen in order to revisite the concept of « opportunisme infectieux ».

Prince William County, located in the rapidly developing Northern Virginia region, contains watersheds of mixed rural and urban/suburban uses. As part of Virginia regulations, recreational waters must be tested and remain under a certain standard for levels of fecal indicator bacteria (FIB). The sources of fecal pollution in neighboring watersheds within the county were determined over the 12 months previous to this project by performing Antibiotic Resistance Analysis (ARA, a microbial source tracking protocol) on Enterococcus and Escherichia coli (E. coli). This study indicated that multiple sources of pollution were present at all sampling locations and that the dominant sources of contamination were related to the land-use patterns and human activities that were adjacent to each location. The goal of the current project was to monitor and identify the sources of fecal pollution in eight streams in the Occoquan Basin (OQB) that have been classified as impaired waters due to high E. coli concentrations. Project objectives were i) employ microbial source tracking technology to identify the categories of sources that were responsible for the bacterial impairments; ii) develop and analyze appropriate Known Source Libraries (KSL's) to determine the best design for identifying the sources of water-sample isolates; and iii) evaluate the use of optical brighteners in freshwater by fluorometry as an indicator for human-origin pollution. One site on each of six streams and two sites on the remaining two (ten total) were selected for E. coli and Enterococcus monitoring and microbial source tracking. Repeated sampling of the ten locations for thirteen months assessed the concentrations of the bacteria over time, while comparison of monthly bacterial concentrations to the U.S. standards was used to verify the impaired water designation. Three thousand, four hundred and eighty-eight Enterococcus and 969 E. coli water-sample isolates were collected and evaluated to determine their sources. These isolates were compared to several known source libraries (KSL's) comprised of host-origin isolates collected from the Northern Virginia region. Linear discriminant analysis (LDA) using a KSL of unique isolates determined wildlife were the dominant source of fecal pollution. Results based on ARA were cross-validated through fluorometry of the water samples (to detect optical brighteners in detergents as human-derived pollution) and pulsed-field gel electrophoresis (PFGE, a DNA fingerprinting technique) of select E. coli isolates. In order to determine the best method to classify the water-sample isolates, variation in antibiotic resistance data representation, known source isolate inclusion, and LDA processing were compared. The KSL that used the most antibiotic resistance datapoints, contained no conflicting data, and performed most of the parameters associated with standard LDA, classified water-sample isolates the most successfully. This project involves the first thorough testing of fluorometry for the detection of human signatures in freshwaters. Monitoring results showed consistent Enterococcus and E. coli contamination in all eight streams, demonstrating that each had been correctly placed on Virginia's impaired waters list by state regulatory agencies. Counts between Enterococcus and E. coli did not correlate well, although concentrations of both indicator organisms were higher during dry months. Source tracking results determined a dominant wildlife signature at all sites. Few Enterococcus water-source isolates were classified as human and fluorescence at all sites was consistently low. KSL's with antibiotic resistance data represented as binary values classified isolates the best. Removal of conflicting isolates improved the KSL's rate of correct classification (RCC). Creation of an unknown category, clustering of the KSL, and only accepting results above a threshold did not appreciably improve the RCC. The KSL with the binary representation was not used to classify isolates because it violates the normal distribution assumption of LDA. Differences in the results of Enterococcus and E. coli source classifications indicated that contributing sources vary in frequency. Human fecal matter was shown to be of little concern because both Enterococcus ARA and fluorometry indicated low presence. The positive predictive value (PPV) statistic was found to be preferable to the minimum detectable percentage (MDP) because it does not depend on KSL size. Establishing confidence intervals to determine completeness of KSL allows one to determine whether particular methods to refine the KSL will be helpful. This project was successfully completed and the monitored streams were correctly identified by state authorities as impaired waters. Source tracking results often conflicted, although wildlife and pets were indicated as the major sources of impairment by ARA. More local source samples need to be taken to verify this result. The best ARA library design used only unique isolates, all pattern data points, and removed conflicting isolates. Continuing examination of the representation of library data as binary is necessary to determine whether the statistical assumptions in LDA prevent meaningful results. Evaluation of fluorometry was partially successful as the absence of "hotspots" of high fluorescent brighteners agreed with ARA results that indicated little contamination form human sources. The fluorometer continues to have potential as a metric of waste in freshwater although more work needs to be done to fully prove its utility. / Master of Science

Um total de 107 S. aureus isolados de casos de mastite, glândulas portadoras, pele do úbere, ordenhadores e insufladores, em rebanhos de São Paulo e Pernambuco, foram tipados por técnicas moleculares PCR-RFLP do gene coa e PCR de spa distinguiram seis perfis. Todas as amostras amplificaram genes coa, spa, icaA e 69% produziram biofilme glicose-induzido in vitro. PFGE identificou 31 perfis e 12 linhagens. Uma linhagem foi predominante (P < 0,0001) e amplamente disseminada em ambas as regiões. Um mesmo perfil foi isolado de mastite clínica, subclínica e portadoras. Houve heterogeneidade genética entre isolados de fazenda. Isolados de origem humana e animal constituíram populações distintas. Poucos isolados de leite, insufladores e pele do úbere tiveram igual perfil. Uma amostra extramamária, 77% dos isolados de leite e. 99% de S. aureus de portadoras produziram biofilme. Não foi detectada correlação entre produção de biofilme e CCS. O isolamento sucessivo do mesmo perfil de PFGE de glândulas assintomáticas por mais de 16 dias caracterizou o estágio de portador. / A total of 107 S. aureus isolated from bovine milk, udder skin, milkers and milking machine, from São Paulo and Pernambuco herds was typed by molecular techniques. PCR-RFLP coa gene and PCR spa gene distinguished six amplicons. All strains amplified coa, spa, icaA genes and, 69% produced in vitro glucose-induced biofilm. PFGE identified 31 pulsotypes, 12 lineages. One of the lineages was predominantly isolated (P<0.0001) and widely disseminated. A same pulsotype was isolated from clinical and, subclinical mastitis as well as from carriers. There was genetic heterogeneity among isolates from the herds. Strains from human and animal origin were genetically different. Few isolates from milk, milking machine and udder skin showed similar pulsotype. An extramammary strain, 77% of the milk isolates and, 99% of the S. aureus isolated from carriers produced biofilm. It was not detected any correlation between SCC and biofilm production. The successive isolation during more than 16 days of a same pulsotype from the asymptomatic glands characterized the carrier status.

Campylobacter spp., principalmente as espécies C. coli e C. jejuni, são a causa mais comum de doença bacteriana veiculada por alimentos na Europa, Estados Unidos e alguns outros locais do mundo. No Brasil, há uma escassez de estudos de C. coli, o que dificulta avaliar a dimensão do envolvimento dessa bactéria como causadora de doença nos seres humanos e em animais, bem como, determinar o impacto de sua presença em alimentos e no meio ambiente. O objetivo desse trabalho foi caracterizar molecularmente linhagens de C. coli isoladas de origens diversas no Brasil pela pesquisa da presença de genes relacionados à virulência por PCR, perfil de sensibilidade a antimicrobianos e pela análise da similaridade genotípica por métodos de tipagem molecular. Adicionalmente, o Índice de Discriminação (D) de tais metodologias foi verificado. Foram estudadas 63 linhagens de C. coli, isoladas de humanos (12), animais (21), alimentos (10) e ambiente (20), entre os anos de 1995 e 2011, nos Estados do Rio de Janeiro, São Paulo e Minas Gerais. Todas as linhagens apresentaram os genes flaA, cadF e sodB. O gene cdtB foi detectado em 20 (31,7%) linhagens, o gene flhA foi detectado em 11 (17,5%) linhagens, o gene dnaJ foi encontrado em 10 (15,9%) linhagens, o gene pldA foi detectado em sete (11,1%) linhagens, o gene iamA foi detectado em três (4,8%) linhagens, os genes cdtC e docA foram encontrados em duas (3,2%) linhagens, os genes cdtA e crsA foram encontrados em uma (1,6%) linhagem e os genes ciaB, wlaN, virB11 e racR não foram detectados. Dentre as 63 linhagens estudadas, 42 foram susceptíveis a todos os antimicrobianos testados. Das 21 linhagens resistentes, 10 (15,9%) foram resistentes a tetraciclina e doxaciclina, seis (9,5%) foram resistentes a ciprofloxacina e uma (1,6 %) foi resistente a eritromicina. Somente quatro (6,3%) linhagens foram resistentes a pelo menos duas diferentes classes de antibióticos testados simultaneamente. O dendrograma de similaridade genética de Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) agrupou as 63 linhagens estudadas em dois grupos principais denominados PFGE-A e PFGE-B com similaridade genômica de 44,9% entre eles. Entretanto, algumas linhagens isoladas de humanos, animais, ambiente e alimentos apresentaram uma alta similaridade genotípica acima de 80% entre elas e, foram agrupadas em sete subgrupos denominados PFGE-A1 a PFGE-A7. O dendrograma de similaridade genômica das sequências da SVR do gene flaA agrupou as linhagens ii estudadas em dois grupos principais designados SVR-A e SVR-B, com similaridade acima de 83,1 % entre eles. Ademais, o depósito das sequências da SVR do gene flaA no banco de dados online demonstrou que os alelos 30 e o 1647 foram os mais frequentemente encontrados e permitiu a comparação das linhagens estudadas com os alelos descritos no banco de dados. Sete alelos, dentre os 22 encontrados, não haviam sido previamente descritos. A análise do locus CRISPR por HRMA dividiu as linhagens de C. coli em quatro diferentes perfis de melting. O Multilocus sequence typing (MLST) foi utilizado para tipar 20 linhagens de C. coli e foram obtidos 18 STs diferentes dos quais apenas dois já haviam sido previamente descritos. O D das metodologias de PFGE, sequenciamento da SVR do gene flaA, análise do locus CRISPR por HRMA e MLST foi de 0,986, 0,916, 0,550 e 0,989, respectivamente. Pode- se concluir que o potencial patogênico das linhagens de C. coli não foi evidenciado o que pode estar relacionado ao fato da maioria dos estudos envolvendo patogênese terem sido realizados para a espécie C. jejuni. Algumas linhagens apresentaram-se resistentes aos antimicrobianos testados, o que é preocupante uma vez que tais linhagens podem disseminar genes de resistência a outras isoladas de diversas fontes. Os resultados gerados pelos métodos de tipagem molecular por PFGE e sequenciamento da pequena região variável (SVR) do gene flaA demonstraram uma alta similaridade genotípica entre algumas linhagens de C. coli, sugerindo que uma possível contaminação tenha ocorrido entre linhagens isoladas de fontes clínicas e não clínicas ao longo de 16 anos no Brasil. Ademais, a análise dos alelos da SVR do gene flaA nos permitiu concluir que os alelos prevalentes nas linhagens estudadas diferem daqueles encontrados nos países Europeus. Os dados obtidos por MLST sugerem que as linhagens estudadas possuem uma grande diversidade genética entre si e em comparação com as linhagens isoladas em diferentes locais do mundo. Finalmente, as técnicas de MLST e PFGE foram as mais eficientes e adequadas na genotipagem das linhagens de C. coli estudadas. / Campylobacter spp., mainly the C. coli and C. jejuni species, are the most common cause of bacterial disease conveyed by food in Europe, United States, and other places worldwide. In Brazil, there is a paucity of studies on C. coli, which makes it difficult to evaluate the involvement of this bacterium as a cause of diseases in humans and animals, as well as to determine the impact of its presence in food and the environment. The aim of this study was to molecularly characterize C. coli strains isolated from diverse origins in Brazil by searching for the presence of virulence-related genes by PCR, antimicrobial sensitivity profile, and analysis of the genotypic similarity by molecular typing methods. Addicionaly, the Discriminatory Index (D) of those methodologies was acessed. Sixty-three C. coli strains isolated from humans (12), animals (21), food (10), and the environment (20) between 1995 and 2011, in the States of Rio de Janeiro, São Paulo, and Minas Gerais were studied. All strains presented the flaA, cadF and sodB genes. The cdtB gene was detected in 20 (31.7%) strains; the flhA gene was detected in 11 (17.5%) strains; the dnaJ gene was detected in 10 (15.9%) strains; the pldA gene was detected in 7 (11.1%) strains ; the iamA gene was detected in three (4.8%) strains; the cdtC and docA genes were found in two (3.2%) strains; the cdtA and crsA were found in one (1.6%) strain and the ciaB, wlaN, virB11 and racR genes were not detected. Among the 63 strains studied, 42 were susceptible to all antimicrobials tested. Of the 21 resistant strains, 10 (15.9%) were resistante to tetracycline and doxaciclyne, six (9.5%) showed resistance to ciprofloxacin, and one (1.6%) was resistant to erythromycin. Only four (6.3%) strains were simultaneously resistant to at least two different classes of the antibiotics tested. The dendrogram of genetic similarity of Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) grouped the 63 strains studied into two groups namely PFGE-A and PFGE-B with a genomic similarity of 44.9% among them. However, some strains isolated from humans, animals, the environment and food presented a high genotypic similarity above 80% and were subdivided into seven groups designated as PFGE-A1 to PFGE-A7. The dendrogram of genetic similarity of the SRV-flaA gene sequences grouped the strains studied into two groups namely SVR-A and SVR-B, with similarity above 83.1% among them. Besides, the deposit of the SVR sequences of the flaA gene in the online database showed that the alleles 30 and 1647 were the iv most frequently found and allowed the comparison between the strains studied with the alleles described in the database. Seven alleles, among the 22 found have never been described before. The CRISPR locus analysis divided the C. coli strains into four different melting profiles. The Multilocus sequence typing (MLST) was used to type 20 C. coli strains and revealed 18 different STs among which just two had been previously described. The D of PFGE, SVR- flaA sequence, HRMA of CRISPR locus analysis and MLST was 0.986, 0.916, 0.550 and 0.989, respectively. In conclusion, the pathogenic potential of the C. coli strains was not highlighted, which could be related to the fact that the majority of the pathogenicity studies were performed with C. jejuni species. Some strains showed resistance to the antibiotics tested what is a concern once those strains may spread the resistance genes to other strains isolated from different sources. The results obtained by PFGE and SVR-flaA sequence showed a high genomic similarity among some C. coli strains which may suggest that a possible contamination may have occurred among clinical and non-clinical sources during 16 years in Brazil. Furthermore, the analysis of SVR- flaA alleles allowed the conclusion that the prevalent alleles in the strains studied were different from those found in European countries. The data obtained by MLST suggests that the strains studied had a high genomic diversity among them and in comparison with strains isolated from different places worldwide. Finally, the MLST and PFGE technicques were the most efficient and adequate in genotyping the C. coli strains studied.