Die Zahl der physiologischen Prozesse in Pflanzen, die scheinbar durch NO reguliert werden, hat in den letzten Jahren stark zugenommen. NO übernimmt wichtige Rollen für die Steuerung von Wachstum und Entwicklung, für die Pathogenresistenz und bei abiotischem Stress, sowohl in unterirdischen als auch in oberirdischen Organen. In Pflanzen wurden bisher eine Reihe verschiedener enzymatischer und einige wenige nichtenzymatische Synthesewege für NO vorgeschlagen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand nun darin, die NO Produktion von Pflanzen und speziell von Wurzeln möglichst quantitativ zu erfassen und die beteiligten Enzyme zu identifizieren. Dieses Ziel sollte vor allem durch Chemilumineszenz-Messung von NO in der Gasphase (= direkte Chemilumineszenz) erreicht werden, aber auch durch die indirekte Chemilumineszenz, bei welcher Spuren von NO-Oxidationsprodukten wie Nitrat und Nitrit erfasst werden. Als Versuchspflanzen wurden verwendet: Wildtypen von Nicotiana tabacum cv. Xanthi oder cv. Gatersleben; Nitratreduktase-freie, auf Ammonium-N angezogene Mutanten, die keine Nitratreduktase (NR) induzieren; WT Pflanzen, die auf Wolframat angezogen wurden um die Synthese funktionaler MoCo-Enzyme zu unterbinden; eine NO-überproduzierende, Nitritreduktase (NiR)-freie Transformante, sowie gelegentlich Gerste, Reis und Erbsen. Eine hypersensitive Reaktion (HR) von Tabak wurde erzeugt durch Druckinfiltration von avirulenten Bakterien des Stammes Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Bei Sauerstoffkonzentrationen &#8804;1% wurde exogenes Nitrit auch von völlig NR-freien Wurzeln zu NO reduziert. Folglich war NR nicht die einzige NO-Quelle von Wurzeln. Im Gegensatz dazu waren NR-freie Blattstreifen nicht in der Lage, Nitrit zu NO umzusetzen. Die NO-Bildung von Wurzeln wurde außerdem durch Hemmstoffe des mitochondrialen Elektronentransportes, Myxothiazol und Salicylhydroxamsäure (SHAM) gehemmt, während die NO-Produktion von NR-exprimierenden Blattstreifen gegen diese Inhibitoren unempfindlich war. Damit stimmte auch überein, dass gereinigte Mitochondrien aus Wurzeln, aber nicht die aus Blättern Nitrit mit Hilfe von NADH zu NO reduzieren konnten. Die Inhibitor-Wirkung lässt darauf schließen, dass in Wurzelmitochondrien beide terminalen Oxidasen and der NO-Bildung beteiligt sind, und dass selbst in NR-haltigen Wurzeln ein großer Teil der Reduktion von Nitrit zu NO durch die Mitochondrien bewerkstelligt wird, und weniger durch NR selbst. Die Unterschiedliche Fähigkeit von Blatt-und Wurzelmitochondrien zur anaeroben Nitrit:NO-Reduktion wurde nicht nur bei Tabak, sondern auch bei Arabidopsis, Gerste und Erbse gefunden. Sie scheint also eine generelle Eigenschaft höherer Pflanzen zu sein. Die Nitrit:NO Reduktion wurden auch direkt als Nitrit- bzw. NADH-Verbrauch gemessen. Die Reaktion war außerdem exklusiv mit der Membranfraktion der Mitochondrien assoziert, ohne jede Beteiligung von Matrixkomponenten. Es wurde auch geprüft, ob Wurzelmitochondrien und- gereinigte Membranen NO ausschließlich aus Nitrit produzierten, oder eventuell auch über eine NO-Synthase (NOS). Außerdem wurde untersucht, ob und in welchem Umfang die NO-Messungen durch eine NO-Oxidation verfälscht werden konnten. Zusätzlich zur Chemilumineszenz wurden Fluoreszenzmessungen mit Diaminofluoreszeinen (DAF) zum Vergleich herangezogen. In Luft produzierten Mitochondrien ja kein Nitrit-abhängiges NO, und eine NOS-Aktivität konnte weder durch direkte noch durch indirekte Chemilumineszenz nachgewiesen werden. Mit DAF-2 oder DAR-4M wurde jedoch eine L-Arginin-abhängige Fluoreszenzerhöhung beobachtet. Diese scheinbare NOS-Aktivität wurde mit kommerzieller iNOS verglichen und zeigte dabei sehr untypische Antworten auf NOS-Inhibitoren, Substrate und Kofaktoren. Sie wird deshalb als Artefakt beurteilt. Bei Verwendung von iNOS wurden ca. 2/3 des insgesamt produzierten NO zu (Nitrit+Nitrat) oxidiert. Mitochondrien scheinen NO zu verbrauchen, ohne jedoch die Oxidation von NO zu (Nitrit+Nitrat) zu erhöhen. Vermutlich wird dabei ein flüchtiges Intermediat gebildet (eventuell N2O3). In unserer Gruppe wurde kürzlich gezeigt, dass der pilzliche Elicitor Cryptogein eine hypersensitive Reaktion (HR) bei Tabak hervorrief, die völlig unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit von NR war. Eine Schlussfolgerung daraus war, dass die NR-abhängige NO-Bildung für die HR keine Rolle spielte. Hier präsentieren wir Hinweise darauf, dass dieses Szenario Cryptogein-spezifisch sein könnte. Pseudomonas syringae pv phaseolicola wurde in Tabakblätter des Wildtyps und derNiR-defizienten, NO-überproduzierenden Mutante (clone 271) infiltriert, die entweder auf Ammonium oder auf Nitrat angezogen waren. Es wurde die Entwicklung der Läsionen, das Bakterienwachstum und die Zuckerkonzentrationen in den Blättern und im Blattapoplasten verfolgt. Die Läsionen-Entwicklung war positiv, und das Bakterienwachstum negativ korreliert mit der Nitrat-Ernährung und einer eventuellen NO-Produktion. Das Bakterienwachstum war positiv korreliert mit einer Ammonium-Ernährung und mit apoplastischen Zuckerkonzentrationen. Der Gesamtgehalt an freier + konjugierter Salicylsäure (SA) war durch bakterielle Infektion immer drastisch gesteigert, aber ohne klare Korrelation mit einer NO-Produktion. In Gegenwart von Cryptogein war das Wachstum von Pseudomonas fast völlig gehemmt. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die vermutete gegenseitige Abhängigkeit von Bakterienwachstum, NO-Produktion und der HR sehr komplex ist und nicht auf einfache unifaktorielle Beziehungen reduziert werden kann. / During the last few years an increasing number of physiological processes in plants have been shown to be regulated by NO. NO plays important roles in growth and development, plant disease resistance, abiotic stress, and in above and underground plant organs. In recent years several enzymatic pathways and few non-enzymatic pathways were proposed for nitric oxide production in plants. The major goal of this work was to quantify NO production by plants and especially by roots, and to identify the enzymes responsible for NO production. As a major method, NO production by roots was followed through on-line measurement of NO emission into the gas phase by chemiluminescence (= direct chemiluminescence), and also by indirect chemiluminescence where trace amounts of oxidized products like NO2- and NO3- can be easily measured. Plants used were tobacco wild-type (N. tabacum cv Xanthi or cv Gatersleben), NR-free mutants grown on ammonium in order to prevent NR induction, plants grown on tungstate to inhibit synthesis of functional MoCo-enzymes, and a NO-overproducing nitrite reductase (NiR)-deficient transformant as well as barley, rice and pea. Induction of a hypersensitive response (HR) in tobacco leaves was achieved by using avirulent Pseudomonas syringae pv phaseolicola. At oxygen concentrations of <1%, even completely nitrate reductase (NR)-free root tissues reduced added nitrite to NO, indicating that in roots, NR was not the only source for nitrite-dependent NO formation. By contrast, NR-free leaf slices were not able to reduce nitrite to NO. Root NO formation was blocked by inhibitors of mitochondrial electron transport (Myxothiazol and SHAM), whereas NO formation by NR containing leaf slices was insensitive to the inhibitors. Consistent with that, mitochondria purified from roots, but not those from leaves, reduced nitrite to NO at the expense of NADH. The inhibitor studies suggest that, in root mitochondria, both terminal oxidases participate in NO formation, and they also suggest that even in NR-containing roots, a large part of the reduction of nitrite to NO was catalysed by mitochondria, and less by NR. The differential capacity of root and leaf mitochondria to reduce nitrite to NO appears to be common among higher plants, since it was observed with Arabidopsis, barley, pea, and tobacco. Nitrite and NADH consumption by mitochondria were also measured. Anaerobic, nitrite-dependent NO emission was exclusively associated with the membrane fraction, without participation of matrix components. It was also examined whether root mitochondria and mitochondrial membranes produce nitric oxide (NO) exclusively by reduction of nitrite or also via a nitric oxide synthase (NOS),- and to what extent direct NO measurements could be falsified by NO oxidation. In addition to chemiluminescence, Diaminofluoresceins (DAF) were used as an NO indicators for comparison. In air, mitochondria apparently produced no nitrite-dependent NO, and no NOS activity was detected by direct or indirect chemiluminescence. In contrast, with DAF-2 and DAR-4M an L-arginine-dependent fluorescence increase took place. However, the response of this apparent NOS activity to inhibitors, substrates and cofactors was untypical when compared with commercial iNOS and is considered an artefact. With iNOS, about 2/3 of the NO were oxidized to (nitrite + nitrate). Mitochondria also appear to consume NO without increasing oxidation to (nitrite+ nitrate). We therefore assume formation of NO to a volatile intermediate (eventually N2O3). It was recently shown that the hypersensitive response (HR) of tobacco triggered by the fungal elicitor cryptogein occurred independent of the presence or absence of nitrate reductase (NR). One conclusion was that NR-dependent NO formation played no role in the HR. Here we present evidence that the described scenario may be specific for cryptogein. Pseudomonas syringae pv. phaseolicola was infiltrated into tobacco leaves from WT plant and from the NiR-deficient NO-overproducing clone 271, grown either on nitrate or ammonium. Lesion development as well as bacterial growth and sugar concentrations in leaves and in the leaf apoplast was monitored. Lesion development was positively and bacterial growth was negatively correlated with nitrate nutrition and eventually with NO formation. Bacterial growth was positively correlated with ammonium nutrition and apoplastic sugar concentrations. Total (free and conjugated) SA content were always drastically increased by bacterial infection, but there was no clear correlation with NO production. In the presence of cryptogein, Pseudomonas growth was drastically reduced. This shows that the assumed interdependence of bacterial growth, NO production and the HR is complex and not unifactorial.

Die Methodik und Technik der Gaswechselmessung von Pflanzen wurde für den Modellorganismus Arabidopsis thaliana optimiert und für Untersuchungen zur Beteiligung des Aquaporins PIP1b an Wassertransportvorgängen während der Stomaöffnung verwendet. Die Messungen der Transpirationsraten von PIP1b-Antisense-Pflanzen ergaben keine Hinweise auf Veränderungen des zeitlichen Verlaufs der Stomaöffnung. Die Wasserpermeabilitäten von Schließzell-Plasmamembranen scheinen somit nicht von der Expression des Aquaporins PIP1b beeinflußt zu sein. - Gaswechselmessungen an Nicotiana tabacum NtAQP1-Antisense-Pflanzen zeigten eine Verringerung der Transpirationsraten im Licht und eine geringere Grundtranspiration im Dunkeln. Dies deutet auf eine Beteiligung von NtAQP1 am Wassertransport hin. - Ausgewählte Arabidopsis thaliana-Mutanten wurden hinsichtlich ihrer stomatären Antwort auf Rot- und Rot-/Blaulicht-Bestrahlung analysiert. Hierfür wurde ein Doppelbestrahlungs-Protokoll entwickelt. Vergleiche mit den Wildtypen ergaben signifikante Unterschiede bei der Phytochrom-Mutante phyA-103, der Abscisinsäure-Mutante aba3-2 und der Auxin-resistenten Mutante axr1-3. Ferner zeigte die Mutante npq1-2 nicht die beschriebene Abweichung der stomatären Antwort auf Blaulicht. - Die Expressionsmuster eines PIP1b-GFP-Reportergens in transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurden analysiert. Hohe Promotor-Aktivitäten konnten in meristematischen Bereichen von Wurzel und Sproß, in Elementen der Leitbündel, in jungen Kotyledonen und in Staubblättern beobachtet werden. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen PIP1b-Promotoraktivität und Streckungswachstum. - Eine Sequenzanalyse des NtAQP1-Promotors ergab Übereinstimmungen mit spezifischen Bindungsmotiven von MYB-ähnlichen Transkriptionsfaktoren. Mit Promotor-Reportergenen konnte die Beteiligung eines dieser Sequenzmotive an der GA- und ABA-induzierten Aktivierung des NtAQP1-Promotors gezeigt werden. Zur Analyse der Phytohormon-Wirkungen auf deletierte Promotorbereiche wurde ein duales Vektorsystem entwickelt und bei der transienten Transformation von BY2-Protoplasten eingesetzt. - Die Expression eines GFP::NtAQP1-Fusionsgens in BY2-Zellen zeigte die subzelluläre Lokalisation des Aquaporins in der Zytoplasmamembran. Ferner wurde Fusionsprotein in Vesikel-ähnlichen Strukturen beobachtet. / Gas exchange measurement of plants was optimized for the model organism Arabidopsis thaliana. Consequently, studies on the participation of aquaporin PIP1b in water transport processes became possible. The transpiration rates obtained for PIP1b anti-sense plants revealed no differences in the time course of stomatal opening. Thus, water permeabilities of guard cell plasma membranes seem not to be influenced by the extend of PIP1b expression. - Gas exchange measurement of the Nicotiana tabacum NtAQP1 anti-sense plants showed a reduced transpiration in response to light and a reduced basal transpiration in the dark. This indicates the participation of NtAQP1 in water movement. - Selected Arabidopsis thaliana mutants were analyzed with regard to their stomatal response to red, red/blue light irradiation. For that, a dual beam protocol was developed. A comparison of the mutant lines to the wild-type revealed significant differences for the phytochrome A (phyA-103), the abscisic acid (aba3-2) and the auxin resistent (axr1-3) mutants. Furthermore, the mutant line npq1-2 did not show the abnormal stomatal response to blue light reported previously. - The expression patterns of a PIP1b-GFP-reporter gene in transgenic Arabidopsis thaliana plants were analyzed. High promotor activities were obtained in areas of meristematic tissue in roots and shoot, in vascular elements, in young cotyledons and in stamina. A close correlation between PIP1b-promoter activity and cell elongation was obvious. - Sequence analysis of the NtAQP1 promoter discovered DNA-motifs that correspond to specific binding sites of MYB-related transcriptional activators. By using promotor-reporter constructs, the involvement of one of this motifs in a GA- and ABA-induced increase of NtAQP1-promoter activity could be shown. In order to elucidate the effects of phytohormones on deleted promoter elements a dual vector system has been created, which was employed in the transient transfection of BY2-protoplasts. - The expression of a GFP::NtAQP1 translational fusion in BY2-cells revealed a subcellular location in the cytoplasmic membrane. Furthermore, the protein-fusion was recorded in small vesicle-like structures.

Isoprostane F2 sind Autoxidationsprodukte der Arachidonsäure, die über radikal-katalysierte Oxidation entstehen. Bei einigen Erkrankungen im Tier konnte gezeigt werden, daß die Konzentration von Isoprostanen F2 mit dem verstärkten Vorkommen von freien Radikalen korreliert, weshalb Isoprostane heute als Marker des oxidativen Streß genutzt werden. Darüber hinaus weisen einige Isoprostane eine biologische Aktivität auf, weshalb sie heute als Signalstoffe des oxidativen Streß im Tier diskutiert werden. Pflanzen hingegen können keine Isoprostane F2 synthetisieren, da ihnen der Precursor Arachidonsäure fehlt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, daß analog zu den Isoprostanen F2 Phytoprostane F1 in Pflanzen aus Linolensäure gebildet werden. Hierfür wurden HPLC- und Gaschromatographie-Massenspektroskopie-Methoden entwickelt, die eine Quantifizierung von Phytoprostanen F1 in Pflanzen ermöglichten. In frischen Pflanzenorganen wurden Phytoprostane F1 sowohl in freier als auch in veresterter Form detektiert. Darüber hinaus stieg die Konzentration sowohl freier als auch veresterter Phytoprostane F1 in Pfefferminzblättern nach Verwundung und in pflanzlichen Zellkulturen nach Zusatz von Agentien, von denen bekannt ist, daß sie pflanzliche Zellen oxidativ schädigen, an. In getrockneten Pflanzenmaterialien wurden extrem hohe Konzentrationen an Phytoprostanen F1 quantifiziert. Daher steht die Vermutung nahe, daß Phytoprostane F1 ähnlich wie die Isoprostane F2 im Tier als sensitiver Marker der oxidativen Zellverletzung in der Pflanze eingesetzt werden können. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß der Zusatz von Phytoprostanen F1 zu Eschscholzia californica-, Crotalaria cobalticola- and Thalictrum tuberosum-Zellsuspensionskulturen zu einer Phytoalexinakkumulation führte. / Isoprostanes F2 are arachidonate autoxidation products in mammals that have been shown to be induced during several human disorders associated with enhanced free-radical generation. Isoprostanes F2 represent not only extremely reliable markers of oxidative stress in vivo but also exert potent biological effects. Therefore, it has been postulated that isoprostanoids are mediators of oxidant injury in vivo. Plants, however, do not generate isoprostanes since they since they are generally unable to synthesize arachidonic acid. Here we show that a series of isoprostane F2 analogs termed phytoprostanes F1 are formed by an analogous pathway from a-linolenate in plants. HPLC and gas chromatography-mass spectrometry methods have been developed to quantify phytoprostanes F1. In fresh plant organs, phytoprostanes F1 were found in free and esterified form in lipids. In addition, wounding of peppermint leaves and oxidative stress, which was triggered by the addition oxidative agents to plant cell cultures significantly increased levels of free and esterified phytoprostanes F1. Extremely high levels of phytoprostanes F1 were found in autoxidised plant material. Thus, phytoprostanes F1 represent a sensitive measure of oxidative damage in plants similar to isoprostanes in animals and men. The addition of phytoprostanes F1 to Eschscholzia californica-, Crotalaria cobalticola- and Thalictrum tuberosum-cell suspension cultures triggered a phytoalexine accumulation .

Lipidperoxidation kann entweder durch Lipoxygenasen oder reaktive Sauerstoffspezies ausgelöst werden. Enzymatische Oxidation von alpha-Linolensäure kann zur Biosynthese von zyklischen Oxylipinen vom Typ der Jasmonate führen, wohingegen durch freie Radikal-katalysierte Oxidation von alpha-Linolensäure mehrerere Klassen zyklischer Oxylipine, den Phytoprostanen entstehen können. Eine dieser Phytoprostanklassen, Phytoprostane E1 (PPE1), kommen ubiquitär in Pflanzen vor. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass PPE1 in planta in neuartige Cyclopentenon-Phytoprostane, die PPA1 und PPB1 umgewandelt werden. Eine gesteigerte Bildung von PPE1, PPA1 und PPB1 wurde sowohl nach Peroxid-Behandlung von Tabak-Zellkulturen als auch nach Behandlung von Tomatenpflanzen mit dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea beobachtet. Darüberhinaus besitzen PPA1 und PPB1 biologische Wirkung. Sie stimulierten beispielsweise die Bildung von Phytoalexinen in mehreren Zellkulturen. Diese Daten implizieren, dass die Bildung von Phytoprostanen eine Folge von oxidativem Stress in Pflanzen ist und dass Phytoprostane pflanzliche Abwehrmechanismen induzieren können. / Lipid peroxidation may be initiated by lipoxygenases or by reactive oxygen species. Enzymatic axidation of alpha-linolenic acid can result in the biosynthesis of cyclic oxylipins of the jasmoate type while free-radical-catalyzed oxidation of alpha-linolenate may yield several classes of cyclic oxylipins termed phytoprostanes in vivo. One of these classes, the E1-phytoprostanes (PPE1) occur ubiquitously in plants. In this work it is shown that PPE1 are converted to novel cyclopentenone A1- and B1-phytoprostanes in planta. Enhanced formation of PPE1, PPA1 and PPB1 is observed after peroxide stress in tobacco cell cultures as well as after infection of tomato plants with a necrotrophic fungus botrytis cinerea. Furthermore PPA and PPB1 display powerfull biological activity, i.e. they stimulate biosynthesis of phytoalexins in several cell cultures. Data collected so far infer that enhanced phytoprostane formation is a general consequence of oxidative stress in plants. Futhermore phytoprostanes are potent inducers of plant defens mechanisms.

Die Spaltung verschiedener Zuckerverbindungen ist ein elementarer Vorgang in allen Lebewesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Enzyme untersucht, die Saccharose, einen wichtigen Energieträger und Botenstoff, in Fructose und Glucose spalten. Sie liefert einen umfassenden Überblick saccharosespaltender Enzyme und deren Inhibitoren, der erstmals die Gebiete der β-Fructofuranosidasen und der α-Glucosidasen vereinigt. Invertasen (β-Fructofuranosidasen, Abspaltung der Fructose) spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden auf vielfältige Art und Weise reguliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Veränderungen in der Aktivität durch verschiedene Einflüsse in vitro untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Temperaturoptima der Invertasen erstaunlich hoch liegen. Das Verhalten der getesteten alkalischen / neutralen Invertase aus Lolium temulentum unterschied sich bei vielen Tests von dem der anderen eingesetzten Invertasen. Auch in Tieren bzw. im Menschen sind saccharosespaltende Enzyme, hier bezeichnet als Sucrasen bzw. α-Glucosidasen (Abspaltung der Glucose), an vielen wichtigen Vorgängen beteiligt, etwa der Glykosilierung von Proteinen oder der Verdauung. Die humane Sucrase-Isomaltase aus dem Dünndarm ist ein Target in der Diabetestherapie. Erstmals konnte die humane Sucrase als aktive Untereinheit in der Hefe Pichia pastoris exprimiert werden. Neben den Enzymen selbst wurden das Wirkspektrum und die Wirkstärke verschiedener Inhibitoren untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass Acarbose, ein Pseudotetrasaccharid, das in der Diabetestherapie verwendet wird, auch pflanzliche Invertasen hemmt. Die in ihrer Struktur zueinander sehr ähnlichen Iminozucker DMDP, Miglitol und Calystegin B2 unterschieden sich erheblich in ihrer Hemmaktivität. DMDP ist dabei am potentesten, Miglitol führt teilweise zu einer erhöhten Invertaseaktivität und Calystegin B2 verfügt nur über ein beschränktes Hemmspektrum. Pflanzliche proteinogene Invertaseinhibitoren hemmten auch die humane Sucrase und die Hefeinvertase; wurden die Inhibitorproteine in P. pastoris exprimiert und dabei glykosiliert, hatten sie keine Hemmaktivität. Als einziger Inhibitor zeigte Miglitol der getesteten alkalischen / neutralen Invertase gegenüber ein Verhalten, das als selektiv bezeichnet werden kann, da die Hemmung mit Konzentrationen, die um den Faktor 1000 niedriger waren als bei anderen Invertasen, eintrat. Für die Suche nach neuen Inhibitoren wurden ein Screening und eine Literaturrecherche zum Thema Pflanzen in der Diabetestherapie bzw. pflanzliche Glucosidasehemmstoffe durchgeführt. Die Literaturrecherche weist darauf hin, dass eine große Anzahl an Pflanzen potentielle Wirkstoffe beinhalten könnte. Das Screening nach neuen Hemmstoffen wurde größtenteils mit Pflanzenextrakten aus der Traditionellen Chinesischen Medizin durchgeführt. Dabei wurden hemmende Extrakte entdeckt, die weiter auf ihre aktiven Komponenten hin untersucht werden sollten. / The cleavage of different sugars is a fundamental process in all living organisms. In this thesis, enzymes which cleave sucrose – an important messenger molecule and energy carrier - in glucose and fructose were analyzed. It shows a broad overview of sucrose cleaving enzymes, which for the first time, combines α-glucosidases and β-fructofuranosidases and their inhibitors. Invertases (β-fructofuranosidases, fructose split-off) play a pivotal role in plant metabolism and are regulated in varied manners. Investigations about the changes in activities of different invertase preparations by different influences were done in vitro. It could be shown that temperature optimum of invertases is impressingly high. The behavior of alkaline / neutral invertase differentiates in many tests from that of others invertases. Also in animals and human beings, sucrose cleaving enzymes, named α-glucosidase or sucrase (glucose split-off), are part of important processes like glycosilation of proteins or digestion. The human sucrase-isomaltase from small intestine is a target in diabetes therapy. As an active subunit the sucrase could be expressed in the yeast Pichia pastoris for the first time. Aside from the enzymes, the spectrum of activity and the potency of different invertase inhibitors were analyzed. It could be shown that acarbose, which is used in diabetes therapy, can also inhibit plant invertases. DMDP, miglitol and calystegine B2, structurally similar imino sugars, differ extensively in their potency. DMDP is the most potent inhibitor, Miglitol partly increases invertase activity and calystegin B2 inhibits only some enzymes. Proteinaceous invertase inhibitors inhibit humane sucrase and yeast invertase as well as plant invertases; in P. pastoris expressed and glycosylated inhibitors showed no potency. As the only inhibitor, miglitol could selectively inhibit the alkaline / neutral invertase, inhibition occured at concentrations 1000 times lower than with other invertases. The search for new invertase inhibitors comprised a screening of different extracts and a literature research dealing with plants in diabetic therapy and plant derived glucosidase inhibitors. A large number of plants with potential active ingredients were investigated. The screening for new invertase inhibitors was mainly conducted with extracts of plants from traditional chinese medicine. As result, inhibitory extracts were found which should be further investigated.

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiges, relativ stabiles Radikal, das in Pflanzen u. a. durch Reduktion aus Nitrit unter Katalyse des Enzyms Nitratreduktase gebildet wird. In tierischen Organismen wird NO dagegen über einen oxidativen Syntheseweg aus der Ami-nosäure L-Arginin katalysiert durch verschiedene Isoformen der NO-Synthasen (NOS) hergestellt. Es besitzt im tierischen System vielfältige Funktionen u. a. als Neurotransmitter sowie Blutfluss und -druck regulierendes Agens. Im Pflanzenreich werden NO u. a. Aufgaben bei der Regulierung von Spaltöffnungen, der Abwehr von Pathogenen sowie der Differenzierung der Xylemelemente zugeschrieben. Die vorliegende Arbeit verfolgte zwei Ziele: - Erforschung alternativer oxidativer Synthesewege von NO in Pflanzen und - Untersuchung der NO-Spezifität der DAF-Fluoreszenzfarbstoffe ausgehend Diskrepanzen zwischen Daten aus Floureszenzanalysen und der Gasphasen-Chemilumineszenz in früheren Arbeiten unserer Arbeitsgruppe und zahlreichen weiteren Publikationen. a) NO-Produktion aus Hydroxylaminen Hydroxylamin ist ein Zwischenprodukt bei der bakteriellen Denitrifizierung und wurde auch als Intermediat bei der Nitratreduktion in Pflanzen diskutiert. Hier wird gezeigt, dass Tabaksuspensionzellen in der Lage waren, exogenes Hydroxylamin schon in sehr niedrigen Konzentrationen (4 µM) zu NO zu oxidieren. Auch ein anderes HA-Derivat, nämlich der Hemmstoff der Alternativen Oxidase (AOX) in Mitochondrien, Salicylhydroxamsäure (SHAM), wurde zu NO oxidiert. Die Vermutung, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) könn-ten bei diesem Oxidationsprozess eine Rolle spielen, wurde überprüft: Nach Einwirkung des ROS-abbauenden Enzyms Superoxid-Dismutase (SOD) konnte aber überraschender-weise keine Verminderung, sondern eher eine Steigerung der NO-Emission beobachtet werden. Die Rolle der SOD in diesem Reaktionsprozess ist daher noch nicht verstanden. b) NO-Detektion mittels Fluoreszenzindikatoren Zur Visualisierung und Lokalisierung von NO in tierischen und pflanzlichen Zellen und Geweben (in situ) mittels mikroskopischer (LSM) oder fluorimetrischer Methoden werden Fluoreszenzfarbstoffe, z. B. DAF-2 oder DAF-FM verwendet. Diese Farbstoffe reagieren mit NO zu stark fluoreszierenden Triazol-Derivaten. Eine Situation, in der Pflanzen u. a. mit NO-Freisetzung reagieren, ist der Pathogenbefall. Wir untersuchten die Reaktion von Tabaksuspensionszellen auf den pilzlichen Elicitor Cryptogein, ein Protein des Oomyceten Phytophthora cryptogea. Im Filtrat der Zellen, die mit Cryptogein behandelt wurden, zeigte sich nach Zugabe von DAF-Farbstoffen ein starker Fluoreszenzanstieg. Um die fluoreszenzerhöhenden Stoffe zu charakterisieren, wurde das Filtrat vor der DAF-Zugabe verschiedentlich behandelt. Bei Zugabe von KCN bzw. Katalase zum Überstand, verringerte sich der Fluoreszenzanstieg. Gleichzeitige Behandlung der Zellen mit Cryptogein sowie dem NADPH-Oxidase-Inhibitor DPI unterband den Fluoreszenzanstieg im Überstand nahezu komplett. Enzym-Assays mit Amplex Rot zeigten die Anhäufung von H2O2 im Filtrat der elicitierten Zellen. Neben ROS werden von Pflanzenzellen auch Peroxidasen in den Apoplasten sekretiert, die mit Hilfe von H2O2 für eine verstärkte Quervernetzung der Zellwand sorgen. Sowohl in unbehandelten Kontrollzellen als auch in elicitierten Zellen wurde Peroxidase-Aktivität nachgewiesen. Nach Zugabe von H2O2 und DAF-2 zum Filtrat von Kontrollzellen ergab sich ein Fluoreszenzanstieg ähnlich dem im Filtrat von behandelten Zellen. Mit Hilfe eines einfachen In-vitro-Systems aus Meerettich-Peroxidase (MR-PO), Wasser-stoffperoxid (H2O2) und DAF-2 konnten noch höhere Fluoreszenzwerte erzielt werden, was die Vermutung der Fluoreszenzerhöhung ohne Anwesenheit von NO erhärtete. Um diese nicht aus einer Reaktion mit NO resultierenden DAF-Produkte näher zu charak-terisieren, wurden Trennungen mittels Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschro-matographie mit Fluoreszenzdetektion (RP-HPLC-FL) und Massenspektrometrie (UPLC-MS) durchgeführt. Dabei wurden tatsächlich zwei neue Reaktionsprodukte festgestellt, die sich eindeutig von DAF-2T unterschieden. Letzteres konnte nur bei Hinzufügen des NO-Donors DEA-NO detektiert werden. Zur Erfassung von intrazellulären Reaktionsprodukten von DAF wurden die chromatogra-phischen Trennmethoden auch auf Extrakte von mit DAF-2 DA aufgeladenen und danach elicitierten Zellen angewandt. Bei dieser Auftrennung tauchten noch mehr DAF-Reaktionsprodukte auf. Die Hauptfluoreszenz, die auch bei nicht inkubierten Zellen auf-trat, konnte auf eine Reihe sehr früh eluierender Substanzen zurückgeführt werden. Die zwei DAF-Derivate aus dem Überstand inkubierter Zellen bzw. der In-vitro-Reaktion (MR-PO+H2O2+DAF-2) tauchten jedoch überhaupt nicht auf. Vorläufige massenspektrometrische Analysen legen nahe, dass es sich bei den in Abwe-senheit von NO gebildeten zwei Verbindungen um isomere Dimere von DAF-2 handelt. / Nitric oxide is a diatomic, gaseous, relatively stable radical that is mainly synthesized via a reduction of nitrate/nitrite or via an oxidation of amino groups. The latter pathway has been attributed a major role in NO production from the amino acid L-arginine catalysed by three different isoforms of NO-synthases (NOS). In animals, NO fulfils a variety of well-known functions e. g. as neurotransmitter, blood-flow and -pressure regulating agent. In the plant kingdom, it plays a role in the regulation of stomatal movement, in the defense against pathogens and in xylogenesis. Major aims of this work were: - to search for alternative oxidative pathways for nitric oxide from reduced nitrogen compounds and - to unravel previous inconsistencies described in our group on NO production in plants as detected by gas phase chemiluminescence or by fluorescing NO specific dyes. a) NO production by oxidation of hydroxylamine (HA) Hydroxylamine was discussed as an intermediate in nitrate reduction in plants and appears conjugated to carbonyl compounds as oximes. Here it is shown that tobacco suspension cells are able to oxidize exogenous hydroxylamine to nitric oxide when applied in concen-trations as low as 4 µM. This was also observed after addition of another hydroxylamine, salicylhydroxamic acid (SHAM), which is a frequently applied inhibitor of mitochondrial Alternative Oxidase (AOX). Preliminary observations suggest that reactive oxygen species (ROS) play a role as oxidants. Addition of superoxide dismutase (SOD), an enzyme de-grading ROS, led to an even higher output of NO from hydroxylamine, which may indicate an involvement of H2O2. b) DAF-fluorescence without NO Fluorescent dyes (DAF-2, DAF-FM, DAR-4M) have been used widely to visualize NO production in tissues and single cells, mostly in connection with the LSM technique. By reaction with NO, these dyes form stable and highly fluorescing triazol-derivatives (e. g. DAF-2T). Much of the present knowledge on NO in plants is based on the use of these dyes. One important example out of many is the induction of NO production by treating plants with compounds (elicitors) provoking a hypersensitive response in specific target plants. Here, the system tobacco and the elicitor cryptogein, a peptide secreted from the oomycete Phytophthora cryptogea was used. This elicitor is specific for tobacco, and in-duces programmed cell death in tobacco suspension cells. When DAF-2 was added to a filtrate of cells preincubated with cryptogein, a strong fluo-rescence increase was observed. Addition of potassium cyanide (KCN) or catalase lowered this increase. Simultaneous treatment of cells with cryptogein and DPI, an NADPH-oxidase inhibitor, abolished fluorescence almost completely. Assays using the H2O2-sensitive dye amplex red indicated an accumulation of H2O2 in the filtrate of elicited cells. Besides ROS, plants secrete peroxidase enzymes into the apoplast which catalyze the crosslinking of cell wall polymers using H2O2. Peroxidase activity was observed both in the filtrate of control cells and cryptogein-treated cells. Addition of H2O2 and DAF-2 to the filtrate of untreated cells gave a fluorescence increase similar to that observed after addi-tion of DAF-2 to the filtrate of cryptogein-elicited cells, which was a first hint that fluores-cence could be induced without NO. An in-vitro-system consisting of horseradish-peroxidase (MR-PO), H2O2 and DAF-2 re-sulted in strong fluorescence increase, confirming that fluorescence took place even in the complete absence of NO. To further characterize suspected novel DAF-derivatives not related to NO, they were analysed by reverse-phase high-pressure liquid chromatography with fluorescence detection (RP-HPLC-FL) and mass spectrometry (UPLC-MS). Indeed, two new DAF-reaction products were discovered which could be clearly separated from DAF-2T. The reaction product of DAF-2 and NO was detected only when the NO-donor DEA-NO was added to the reaction mixture of the in-vitro-system (HR-PO + H2O2 + DAF-2), revealing three peaks, the two novel DAF-derivatives and DAF-2T. In order to elucidate intracellular reaction products formed inside DAF-2 DA preloaded cells during elicitation, extracts of suspension cells were also submitted to RP-HPLC-FL. In this case, a larger number of DAF-derivatives were found. Even in non-incubated cells, bulk fluorescence originated from a group of early eluting novel compounds. However, none of them could be matched with the two derivatives found in the cell filtrate or in vitro. Preliminary mass spectrometrical analyses suggest the two novel, highly fluorescing compounds formed in the absence of NO in vitro or the filtrate of elicited cells to represent isomeric dimers of DAF-2 which are linked via the amino-groups after reduction.

I. Global climate change directly and indirectly influences biotic and abiotic components of ecosystems. Changes in abiotic ecosystem components caused by climate change comprise temperature increases, precipitation changes and more frequently occurring extreme events. Mediated by these abiotic changes, biotic ecosystem components including all living organisms will also change. Expected changes of plants and animals are advanced phenologies and range shifts towards higher latitudes and altitudes which presumably induce changes in species interactions and composition. Altitudinal gradients provide an optimal opportunity for climate change studies, because they serve as natural experiments due to fast changing climatic conditions within short distances. In this dissertation two different approaches were conducted to reveal species and community responses to climate change. First, species richness and community trait analyses along an altitudinal gradient in the Bavarian Alps (chapters II, III) and second, climate change manipulation experiments under different climatic contexts (chapters IV, V, IV). II. We performed biodiversity surveys of butterfly and diurnal moth species on 34 grassland sites along an altitudinal gradient in the National Park Berchtesgaden. Additionally, we analysed the dominance structure of life-history traits in butterfly assemblages along altitude. Species richness of butterflies and diurnal moths decreased with increasing altitude. The dominance of certain life-history-traits changed along the altitudinal gradient with a higher proportion of larger-winged species and species with higher egg numbers towards higher altitudes. However, the mean egg maturation time, population density and geographic distribution within butterfly assemblages decreased with increasing altitude. Our results indicate that butterfly assemblages were mainly shaped by environmental filtering. We conclude that butterfly assemblages at higher altitudes will presumably lack adaptive capacity to future climatic conditions, because of specific trait combinations. III. In addition to butterfly and diurnal moth species richness we also studied plant species richness in combination with pollination type analyses along the altitudinal gradient. The management type of the alpine grasslands was also integrated in the analyses to detect combined effects of climate and management on plant diversity and pollination type. Plant species richness was highest at intermediate altitudes, whereby the management type influenced the plant diversity with more plant species at grazed compared to mown or non-managed grasslands. The pollination type was affected by both the changing climate along the gradient and the management type. These results suggest that extensive grazing can maintain high plant diversity along the whole altitudinal gradient. With ongoing climate change the diversity peak of plants may shift upwards, which can cause a decrease in biodiversity due to reduced grassland area but also changes in species composition and adaptive potential of pollination types. IV. We set up manipulation experiments on 15 grassland sites along the altitudinal gradient in order to determine the combined effects of extreme climatic events (extreme drought, advanced and delayed snowmelt) and elevation on the nutritional quality and herbivory rates of alpine plants. The leaf CN (carbon to nitrogen) ratio and the plant damage through herbivores were not significantly affected by the simulated extreme events. However, elevation influenced the CN ratios and herbivory rates of alpine plants with contrasting responses between plant guilds. Furthermore, we found differences in nitrogen concentrations and herbivory rates between grasses, legumes and forbs, whereas legumes had the highest nitrogen concentrations and were damaged most. Additionally, CN ratios and herbivory rates increased during the growing season, indicating a decrease of food plant quality during the growing season. Contrasting altitudinal responses of grasses, legumes and forbs presumably can change the dominance structure among these plant guilds with ongoing climate change. V. In this study we analysed the phenological responses of grassland species to an extreme drought event, advanced and delayed snowmelt along the altitudinal gradient. Advanced snowmelt caused an advanced beginning of flowering, whereas this effect was more pronounced at higher than at lower altitudes. Extreme drought and delayed snowmelt had rather low effects on the flower phenology and the responses did not differ between higher and lower sites. The strongest effect influencing flower phenology was altitude, with a declining effect through the season. The length of flowering duration was not significantly influenced by treatments. Our data suggest that plant species at higher altitudes may be more affected by changes in snowmelt timing in contrast to lowland species, as at higher altitudes more severe changes are expected. However, the risk of extreme drought events on flowering phenology seems to be low. VI. We established soil-emergence traps on the advanced snowmelt and control treatment plots in order to detect possible changes in abundances and emergence phenologies of five arthropod orders due to elevation and treatment. Additionally, we analysed the responses of Coleoptera species richness to elevation and treatment. We found that the abundance and species richness of Coleoptera increased with elevation as well as the abundance of Diptera. However, the abundance of Hemiptera decreased with elevation and the abundances of Araneae and Hymenoptera showed no elevational patterns. The advanced snowmelt treatment increased the abundances of Araneae and Hymenoptera. The emergence of soil-hibernating arthropods was delayed up to seven weeks at higher elevations, whereas advanced snowmelt did not influence the emergence phenology of arthropods immediately after snowmelt. With climate change earlier snowmelt will occur more often, which especially will affect soil-hibernating arthropods in alpine regions and may cause desynchronisations between species interactions. VII. In conclusion, we showed that alpine ecosystems are sensitive towards changing climate conditions and extreme events and that many alpine species in the Bavarian Alps are endangered. Many alpine species could exist under warmer climatic conditions, however they are expected to be outcompeted by more competitive lowland species. Furthermore, host-parasite or predator-prey interactions can be disrupted due to different responses of certain guilds to climate change. Understanding and predicting the complex dynamics and potential risks of future climate change remains a great challenge and therefore further studies analysing species and community responses to climate change are needed. / I. Der globale Klimawandel beeinflusst direkt und indirekt biotische und abiotische Komponenten der Ökosysteme. Durch Klimawandel verursachte Veränderungen in den abiotischen Komponenten der Ökosysteme umfassen Temperaturanstiege, Veränderungen im Niederschlag und häufiger auftretende Extremereignisse. Als Folge dieser abiotischen Veränderungen, werden sich auch die biotischen Komponenten der Ökosysteme, die alle lebenden Organismen einschließen, verändern. Voraussichtliche Veränderungen bei Pflanzen und Tieren sind vorverlegte Phänologien und Verbreitungsverschiebungen in Richtung höherer Breitengrade und Höhenlagen, was möglicherweise Veränderungen von Interaktionen zwischen Arten und in der Artzusammensetzung verursacht. Höhengradienten bieten durch sich schnell verändernde klimatische Bedingungen innerhalb kurzer Distanzen eine optimale Möglichkeit für Klimawandelstudien im Freiland. In dieser Dissertation wurden zwei unterschiedliche Versuchsansätze genutzt, um die Reaktionen von Arten und Artengemeinschaften auf den Klimawandel zu untersuchen: erstens Analysen zum Artenreichtum und zu Merkmalen innerhalb von Artengemeinschaften entlang eines Höhengradienten in den Bayerischen Alpen (Kapitel II, III) und zweitens Manipulationsexperimente zur Simulation von Klimawandel bei unterschiedlichen klimatischen Bedingungen (Kapitel IV, V, VI). II. Wir haben Biodiversitätsaufnahmen von Schmetterlings- und tagaktiven Nachtfalterarten entlang eines Höhengradienten im Nationalpark Berchtesgaden durchgeführt. Zusätzlich haben wir die Dominanzstruktur von Life-History-Merkmalen in Schmetterlingsgesellschaften entlang des Höhengradienten analysiert. Der Artenreichtum von Schmetterlingen und tagaktiven Nachtfaltern nahm mit zunehmender Höhe ab. Die Dominanz von bestimmten Life-History-Merkmalen veränderte sich entlang des Höhengradienten. Zum Beispiel fanden wir einen höheren Anteil an Arten mit größeren Flügeln und eine größere Anzahl an Eiern in höheren Lagen. Die mittlere Eireifezeit, Populationsdichte und geographische Verbreitung von Schmetterlingsgesellschaften nahm mit steigender Höhe ab. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Schmetterlingsgesellschaften hauptsächlich durch den Filtereffekt der Umwelt geformt werden. Wir schlussfolgern, dass sich bestimmte Merkmalskombinationen von Schmetterlingsgesellschaften in höheren Lagen möglicherweise ungünstig auf die Anpassungskapazität an zukünftige klimatische Veränderungen auswirken. III. Zusätzlich zum Artenreichtum von Schmetterlingen und tagaktiven Nachtfaltern haben wir auch den Artenreichtum von Pflanzen in Kombination mit Analysen zu Bestäubungstypen entlang des Höhengradienten untersucht. Die Bewirtschaftungsform der alpinen Grasländer wurde in die Analysen integriert, um kombinierte Auswirkungen von Klima und Bewirtschaftungsform auf die Pflanzendiversität und den Bestäubungstyp zu erfassen. Der Artenreichtum von Pflanzen war auf mittleren Höhen am größten, wobei die Bewirtschaftungsform die Pflanzendiversität beeinflusste. Es kamen mehr Pflanzenarten auf beweideten im Vergleich zu gemähten oder nicht bewirtschafteten Wiesen vor. Der Bestäubungstyp wurde sowohl durch das sich verändernde Klima entlang des Gradienten als auch durch die Bewirtschaftungsform beeinflusst. Unsere Ergebnisse lassen vermuten, dass extensive Beweidung eine hohe Pflanzendiversität entlang des gesamten Höhengradienten erhalten kann. Mit fortschreitendem Klimawandel könnte sich der Bereich mit höchster Pflanzendiversität nach oben verschieben, was zu einem Biodiversitätsverlust durch eine Abnahme an Grasflächen führen könnte, aber auch zu Veränderungen in der Artenzusammensetzung und dem Anpassungspotential von Bestäubungstypen. IV. Wir simulierten Extremereignisse (extreme Dürre, frühere und spätere Schneeschmelze) auf 15 Grasflächen entlang des Höhengradienten, um kombinierte Effekte von extremen klimatischen Ereignissen und Höhenlage auf die Futterqualität und den Blattfraß von alpinen Pflanzen zu untersuchen. Das Verhältnis von Kohlenstoff zu Stickstoff (CN) in Blättern und die Fraßschäden durch Pflanzenfresser wurden durch die simulierten Extremereignisse nicht signifikant beeinflusst. Dagegen beeinflusste die Höhenlage das CN-Verhältnis und die Herbivorieraten von alpinen Pflanzen mit entgegengesetzten Reaktionen unter den Pflanzengruppen. Des Weiteren haben wir Unterschiede in den Stickstoffkonzentrationen und Herbivorieraten zwischen Gräsern, Leguminosen und krautigen Pflanzen gefunden, wobei die Leguminosen die höchsten Stickstoffkonzentrationen aufwiesen und am stärksten angefressen waren. Zusätzlich stiegen die CN-Verhältnisse und die Fraßschäden während der Vegetationsperiode an, was auf eine Abnahme der Futterqualität im Verlauf der Vegetationsperiode hindeutet. Entgegengesetzte Muster von Gräsern, Leguminosen und krautigen Pflanzen über die Höhe können möglicherweise die Dominanzstruktur zwischen diesen Pflanzengruppen mit fortschreitendem Klimawandel verändern. V. In dieser Studie haben wir die phänologischen Reaktionen von Graslandarten auf ein extremes Dürreereignis, eine frühere und eine spätere Schneeschmelze entlang des Höhengradienten, analysiert. Die frühere Schneeschmelze bewirkte einen früheren Blühbeginn, wobei dieser Effekt auf höheren Lagen ausgeprägter war als auf tieferen Lagen. Extreme Dürre und spätere Schneeschmelze hatten eher geringe Auswirkungen auf die Blühphänologie und die Auswirkungen unterschieden sich nicht zwischen höher und tiefer gelegenen Flächen. Am stärksten würde die Blühphänologie von der Höhenlage beeinflusst wobei sich der Effekt im Verlauf der Vegetationsperiode verringerte. Die Länge der Blühdauer wurde durch die Simulationen nicht signifikant beeinflusst. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Pflanzenarten in höheren Lagen stärker durch Veränderungen des Zeitpunktes der Schneeschmelze beeinflusst werden als Tieflandarten, weil in höheren Lagen stärkere Veränderungen erwartet werden. Das Risiko von extremer Dürre für die Blühphänologie scheint aber gering zu sein. VI. Wir untersuchten Effekte der Höhenlage und früherer Schneeschmelze auf Häufigkeiten und Schlupfphänologien fünf verschiedener Arthropodenordnungen. Dazu installierten wir Bodenphotoeklektoren auf Flächen mit früherer Schneeschmelze und Kontrollflächen. Außerdem analysierten wir die Auswirkungen der Höhenlage und der früheren Schneeschmelze auf den Artenreichtum von Coleoptera. Wir stellten fest, dass die Abundanz und der Artenreichtum von Coleoptera sowie die Abundanz der Diptera mit steigender Höhenlage zunahmen, während die Abundanz der Hemiptera mit steigender Höhe abnahm. Araneae und Hymenoptera zeigten keine Abundanzmuster entlang des Höhengradienten. Eine simulierte frühere Schneeschmelze ließ die Abundanz der Araneae und Hymenoptera ansteigen. Arthropoden, die im Boden überwinterten, schlüpften in höheren Lagen bis zu sieben Wochen später. Eine frühere Schneeschmelze beeinflusste die Schlupfphänologie der Arthropoden unmittelbar nach der Schneeschmelze jedoch nicht. Aufgrund des Klimawandels wird eine frühere Schneeschmelze häufiger auftreten, was vor allem Auswirkungen auf bodenüberwinternde Arthropoden in der Alpenregion haben kann und zu Desynchronisationen mit interagierenden Arten führen kann. VII. Abschließend lässt sich sagen, dass alpine Ökosysteme sensibel auf klimatische Veränderungen und Extremereignisse reagieren und dass viele alpine Arten in den Bayerischen Alpen gefährdet sind. Viele alpine Arten könnten unter wärmeren klimatischen Bedingungen existieren, aber vermutlich werden sie von konkurrenzstärkeren Tieflandarten verdrängt. Des Weiteren können Wirt-Parasit oder Räuber-Beute Interaktionen durch unterschiedliche Reaktionen von bestimmten Gruppen auf Klimawandel gestört werden. Es bleibt eine große Herausforderung die komplexen Dynamiken und möglichen Gefahren des zukünftigen Klimawandels zu verstehen und vorherzusagen. Wir empfehlen weitere Studien, die die Auswirkungen des Klimawandels auf Arten und Artengesellschaften untersuchen.

Funktionelle Expression von ChR2 in Pflanzen In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig die funktionelle Expression des licht-aktivierten Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii in höheren Pflanzen gezeigt werden. Obwohl die erfolgreiche Transformation auf der Basis der Integration einer Expressionskassette für WT-ChR2 in Pflanzen genetisch nachgewiesen werden konnte, war ein funktioneller Nachweis nicht möglich. Demgegenüber war die funktio-nelle Expression aller getesteten ChR2-Mutanten im transienten Expressionsansatz er-folgreich und konnte schließlich auf der Basis der im Rahmen dieser Arbeit generierten Konstrukte auch für stabil transformierte Arabidopsis-Pflanzen bestätigt werden. ChR2 wurde in Arabidopsis-Protoplasten sowie Tabak-Epidermis- und Mesophyllzellen an der Plasmamembran lokalisiert, zeigte jedoch aufgrund der Überexpression eine starke Überladung des Endomembransystems. Elektrophysiologische Messungen mit Hilfe der Einstichtechnik belegten, dass ChR2 sowohl in Arabidopsis-Keimlingen als auch im Tabakmesophyll funktionell ist, wobei sich die erzeugten Blaulicht-vermittelten Depolarisationen weitaus erfolgreicher im Ta-baksystem darstellten. Alle eingesetzten ChR2-Mutanten waren funktionell und zeigten in Einstichmessungen mit Oozytendaten korrelierende Kinetiken. Die Mutante C128A wurde hinsichtlich der erzielten lichtinduzierten Membranpotentialdepolarisationen als effektivste ChR2-Variante identifiziert. Calcium-Messungen mit dem Reporterprotein Aequorin lieferten keinen Beweis für einen direkt durch ChR2-C128A vermittelten Calcium-Einstrom in Arabidopsis-Protoplasten. Jedoch konnte ein cytosolischer Calcium-Anstieg ca. 3min nach Blau-lichtapplikation beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass die durch ChR2 vermittelten Membranpotentialänderungen zu einer Aktivierung endogener, Calcium-permeabler Ionenkanäle führen könnte. Für die ChR2-L132C Mutante konnte allerdings in ersten Messungen ein direkter Calcium-Anstieg nach Lichtgabe beobachtet werden.   Transkriptionelle Änderungen aufgrund ChR2-basierter, elektrischer Signalmuster In RNA-Seq-Analysen mit transient transformierten Tabakblättern konnte die Bedeu-tung der Signalsignatur elektrischer bzw. Calcium-basierter Signale verifiziert werden: Die Applikation zweier in ihrer Form gänzlich unterschiedlicher elektrischer Signal-muster lieferte ein signifikant unterschiedlich reguliertes Set an Genen, wobei einige wenige durch beide Behandlungen induziert werden konnten. Langanhaltende Depolari-sationen regulierten deutlich mehr Gene und waren daher in ihrer Wirkung weitaus ef-fektiver als kurze, repetitive Depolarisationen. Die bioinformatische Analyse dieser Daten zeigte, dass die Nachahmung eines im Zuge der Pathogenantwort bekannten, langen Depolarisationspulses Gene der Flagellin-induzierten Signaltransduktion adressierte, während kurze, wiederkehrende Pulse mit gleichem Informationsgehalt diese nicht regulierten. / Functional expression of ChR2 in plants The current work for the first time proves the functional expression of the light gated ChR2 derived from the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii in higher plants. In line with its function ChR2 was localized primarily at the plasma membrane in Ara-bidopsis protoplasts and Tobacco epidermal and mesophyll cells. However, overexpres-sion as well as codon-usage often resulted in overloading of the endomembrane system such as Golgi and ER. Electrophysiological recordings by means of the impalement technique proved ChR2 function in Arabidopsis seedlings as well as Tobacco mesophyll cells. Blue light induced depolarization, however, was more efficient in the Tobacco system. In contrast to the WT protein all ChR2-mutants tested in this study were shown to be functional. Channel kinetics gained from Xenopus oocyte TEVC measurements corre-lated well with observed depolarization and repolarization kinetics of individual mu-tants. Highest depolarization levels were generated by the mutant C128A. Using the Calcium reporter Aequorin, measurements provided no evidence for ChR2-C128A mediated Calcium-influx in Arabidopsis protoplasts. However, a delayed Cal-cium increase approximately 3min following blue light application suggests that ChR2 mediated membrane potential changes activated endogenous Calcium permeable ion channels. Preliminary experiments using the L132C mutant showed cytosolic Calcium elevation directly after light stimulation. All ChR2 mutants tested in this study are suited for generating defined depolarization patterns in plants, whereas simulation of specific Calcium signatures seems possible with ChR2 variants based on the L123C mutation. Transcriptional changes based on ChR2-mediated, electrical patterns Transcriptional analyses of transiently transformed Tobacco leaves verified the im-portance of signature shape of electrical or Calcium-based signals in plants: Application of two blue light triggered depolarization patterns differing in shape revealed two sets of significantly differentially regulated genes, although a small number of genes was regulated by both stimuli. Sustained depolarizations regulated more genes and thus turned out to be more effective than short, repetitive depolarizations. Bioinformatic analyses of the data generated by RNA-Seq revealed the power of elec-trical signal application. Mimicking known electrical pathogen responses by applying a sustained depolarization pattern indeed addressed genes involved in flagellin signaling. In contrast, repetitive depolarization pulses regulated a completely different set of genes.

Univ., Diss.--Regensburg, 1985.

Th. doct.--Sciences de la terre--Vriji Universiteit te Amsterdam, 1985. / Bibliogr. p. 174-185.