Hohenheim, Univ., Diss., 2007.

This work investigates the death and degradation of the second polar body of the nematode C. elegans in order to improve our understanding how pluripotent undifferentiated cells deal with dying cells. With the use of fluorescence microscopy this work demonstrates that both polar bodies loose membrane integrity early. The second polar body has contact to embryonic cells and gets internalized, dependent on the Rac1-ortholog CED-10. The polar body gets degraded via LC3-associated phagocytosis. While lysosome recruitment depends on RAB-7, LC3 does not improve lysosome recruitment but still accelerates polar body degradation. This work establishes the second polar body as a genetic model to study cell death and LC3-associated phagocytosis and has revealed further aspects of phagosome maturation and degradation. / Um besser zu verstehen, wie undifferenzierte pluripotente Zellen mit abgestorbenen Zellen umgehen, wird in dieser Dissertation die Phagozytose und der Abbau des 2. Polkörpers der weiblichen Meiose im Fadenwurm C. elegans untersucht. Mithilfe von fluorenzenzmikroskopischen Aufnahmen wird in dieser Arbeit gezeigt, dass beide Polkörper schon früh ihre Membranintegrität verlieren. Der 2. Polkörper, welcher direkten Kontakt zu embryonischen Zellen hat, wird daraufhin mithilfe des Rac1-Orthologs CED-10 phagozytiert. Es wird gezeigt, dass es sich bei dem Abbauprozess um LC3-assoziierte Phagozytose handelt. Die RAB-7 GTPase ist notwendig für die Rekrutierung von Lysosomen, während LC3 darauf keinen Einfluss hat, aber trotzdem den Abbau des Polkörpers beschleunigt. Mit dieser Arbeit konnte ein genetisches Modell für die Erforschung von Zelltod und der LC3-assoziierten Phagozytose entwickelt werden und weitere Aspekte der Phagosomreifung und des -abbaus aufgedeckt werden.

Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecules (CEACAMs) are exploited by human-specific pathogens to anchor themselves to or invade host cells. Interestingly, human granulocytes express a specific isoform, CEACAM3, that can direct efficient, opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria, Moraxella and Haemophilus species. As opsonin-independent phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria depends on Src-family protein tyrosine kinase (PTK) phosphorylation of the CEACAM3 cytoplasmic domain, we hypothesized that an SH2-containing protein might be involved in CEACAM3-initiated, phagocytosis-promoting signals. Accordingly, we screened glutathione-S-transferase (GST) fusion proteins containing SH2 domains derived from a panel of signaling and adapter molecules for their ability to associate with CEACAM3. In vitro pull-down assays demonstrated that the SH2 domain of the adapter molecule Nck (GST-Nck SH2), but not other SH2 domains such as the Grb2 SH2 domain, interact with CEACAM3 in a phosphotyrosine-dependent manner. Either deletion of the cytoplasmic tail of CEACAM3, or point-mutation of a critical arginine residue in the SH2 domain of Nck (GST-NckSH2R308K) that disrupts phosphotyrosine binding, both abolished CEACAM3-Nck-SH2 interaction. Upon infection of human cells with CEACAM-binding Neisseria, full-length Nck comprising an SH2 and three SH3 domains co-localized with tyrosine phosphorylated CEACAM3 and associated bacteria as analyzed by immunofluorescence staining and confocal microscopy. In addition, Nck could be detected in CEACAM3 immunoprecipitates confirming the interaction in vivo. Importantly, overexpression of a GFP-fusion protein of the isolated Nck SH2 domain (GFP-Nck-SH2), but not GFP or GFP-Nck SH2 R308K reduced CEACAM3-mediated phagocytosis of CEACAM-binding Neisseria suggesting that the adaptor molecule Nck plays an important role in CEACAM3-initiated signaling leading to internalization and elimination of human-specific pathogens.

VEGF is a main driver of tumor angiogenesis, playing an important role not only in the formation of new blood vessels, but also acts as a factor for cell migration, proliferation, survival and apoptosis. Angiogenesis is a universal function shared by most solid tumors and its inhibition was thought to have the potential to work across a broad patient population. Clinical evidence has shown that inhibiting pathological angiogenesis only works in a subset of patients and the identification of those patients is an important step towards personalized cancer care. The first approved antiangiogenic therapy was bevacizumab (Avastin®), a monoclonal antibody targeting VEGF in solid tumors including CRC, BC, NSCLC, RCC and others. In addition to endothelial cells, VEGF receptors are present on a number of different cell types including tumor cells, monocytes and macrophages. The work presented in this thesis looked at the in vitro cellular changes in tumor cells and leukocytes in response to the inhibition of VEGF signaling with the use of bevacizumab. In the initial experiments, VEGF was induced by hypoxia in tumor cells to evaluate changes in survival, proliferation, migration and changes in gene or protein expression. There was a minimal direct response of VEGF inhibition in tumor cells that could be attributed to bevacizumab treatment, with minor variations in some of the cell lines screened but no uniform or specific response noted. MMR deficiency often results in microsatellite instability (MSI) in tumors, as opposed to microsatellite stable (MSS) tumors, and accounts for up to 15% of colorectal carcinomas (CRCs). It has been suggested in clinical data that MMR deficient tumors responded better to bevacizumab regimens, therefore further research used isogenic paired CRC tumor cell lines (MMR deficient and proficient). Furthermore, a DNA damaging agent was added to the treatment regimen, the topoisomerase inhibitor SN-38 (the active metabolite of irinotecan). Inhibiting VEGF using bevacizumab significantly inhibited the ability of MMR deficient tumor cells to form anchor dependent colonies, however conversely, bevacizumab treatment before damaging cells with SN-38, showed a significant increase in colony numbers. Moreover, VEGF inhibition by bevacizumab pretreatment also significantly increased the mutation fraction in MMR deficient cells as measured by transiently transfecting a dinucleotide repeat construct, suggesting VEGF signaling may have an intrinsic role in MMR deficient cells. A number of pathways were analyzed in addition to changes in gene expression profiles resulting in the identification of JNK as a possible VEGF targeted pathway. JUN expression was also reduced in these conditions reinforcing this hypothesis, however the intricate molecular mechanisms remain to be elucidated. In order to remain focused on the clinical application of the findings, it was noted that some cytokines were differentially regulated by bevacizumab between MMR proficient and deficient cells. Treatment regimens employed in vitro attempted to mimic the clinical setting by inducing DNA damage, then allowing cells to recover with or without VEGF using bevacizumab treatment. Inflammatory cytokines, CCL7 and CCL8, were found to have higher expression in the MMR deficient cell line with bevacizumab after DNA damage, therefore the cross talk via tumor derived factors to myeloid cells was analyzed. Gene expression changes in monocytes induced by tumor conditioned media showed CCL18 to be a bevacizumab regulated gene by MMR deficient cells and less so in MMR proficient cells. CCL18 has been described as a prognostic marker in gastric, colorectal and ovarian cancers, however the significance is dependent on tumor type. CCL18 primarily exerts its function on the adaptive immune system to trigger a TH2 response in T cells, but is also described to increase non-specific phagocytosis. The results of this study did show an increase in the phagocytic activity of macrophages in the presence of bevacizumab that was significantly more apparent in MMR deficient cells. Furthermore, after DNA damage MMR deficient cells treated with bevacizumab released a cytokine mix that induced monocyte migration in a bevacizumab dependent manner, showing a functional response with the combination of MMR deficiency and bevacizumab. In summary, the work in this thesis has shown evidence of immune cell modulation that is specific to MMR deficient tumor cells that may translate into a marker for the administration of bevacizumab in a clinical setting. VEGF ist ein zentraler Regulator der Tumor-Angiogenese, und spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Bildung von neuen Blutgefäßen, sondern ist auch für die Migration, Proliferation, das Überleben und Apoptose von Tumorzellen essentiell. Angiogenese ist eine der universellen Funktionen, welche das Wachstum der meisten soliden Tumoren charakterisiert. Eine der klassischen therapeutischen Ideen wurde auf der Basis entwickelt, dass die spezifische Hemmung der Angiogenese das Potenzial hat in einer breiten Patientenpopulation einen klinischen Effekt zu zeigen. Die klinische Erfahrung und Anwendung hat jedoch gezeigt, dass die Hemmung der pathologischen Angiogenese nur in einem Teil der Patienten einen therapeutischen Nutzen aufweist. Somit stellt die Identifikation derjenigen Patienten, welche von der anti-angiogenen Therapie profitieren, einen wichtiger Schritt zur personalisierten Krebsbehandlung dar. Die erste zugelassene antiangiogene Therapie war Bevacizumab (Avastin®), ein monoklonaler Antikörper gegen VEGF, welcher unter anderem in soliden Tumoren wie CRC, BC, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und dem Nierenzellkarzinom angewandt wird. VEGF-Rezeptoren befinden sich nicht nur auf Endothelzellen, sondern sind auch auf einer Anzahl von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Tumorzellen, Monozyten und Makrophagen nachweisbar. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse befassen sich mit den zellulären Veränderungen an Tumorzellen und Leukozyten als Reaktion auf die Hemmung der VEGF-Signalkaskade durch Bevacizumab in-vitro. In den Initialen Experimenten wurde VEGF durch Hypoxie in Tumorzellen induziert und Veränderungen der Überlebensrate, der Proliferation, Migration als auch in der Gen- oder Protein-Expression gemessen. Es konnte eine minimale direkte Reaktion der VEGF-Hemmung auf Tumorzellen beobachtet werden, welche auf die Bevacizumab Behandlung zurückgeführt werden könnte. Es zeigten sich aber auch geringfügige Abweichungen in einigen der verwendeten Zellinien, die keine einheitliche Interpretation erlauben oder auf eine uniformelle Reaktion hinweisen würden. Das phänotypische Korrelat einer „Mismatch“ Reparatur (MMR)-Defizienz ist die Mikrosatelliteninstabilität im Gegensatz zu mikrosatellitenstabilen Tumoren und findet sich bei bis zu 15% der kolorektalen Karzinomen (CRC) wieder. Klinischen Daten deuten daraufhin, dass Bevacizumab besser in MMR-defizienten Tumoren wirkt. Daher wurden die weiteren Untersuchungen in gepaarten MMR stabilen und MMR instabilen CRC-Tumorzelllinien (MMR defizient und kompetent) durchgeführt. Weiterhin wurde ein DNA-schädigendes Agens, SN-38, ein Topoisomerase-Inhibitor (der aktive Metabolit von Irinotecan) dem Behandlungsschema zugefügt. Es zeigte sich, dass die Hemmung von VEGF mittels Bevacizumab die Fähigkeit der MMR defizienten Tumorzellen Kolonien zu bilden signifikant inhibiert. Im Gegensatz dazu, hatte die Behandlung von Bevacizumab vor der Zugabe des DNA schädigenden Agens zu einer vermehrten Kolonienzahl geführt. Außerdem erhöhte die Vorbehandlung mit Bevacizumab deutlich die Mutationsrate in MMR-defizienten Zellen, was durch die transiente Transfektion eines Dinukleotid-Repeat-Konstrukts nachgewiesen werden konnte. Dies deutete darauf hin, dass VEGF eine intrinsische Rolle in der Signalkaskade des MMR-Systems haben könnte. Deshalb wurde eine Anzahl von Signalalkaskaden zusätzlich zu Veränderungen von Genexpressionsprofilen untersucht und JNK als mögliche Verbindungsstelle der beiden Signalkaskaden, VEGF und MMR, identifiziert. Diese Hypothese wurde zusätzlich unterstützt durch die Tatsache, dass die JUN Expression unter diesen experimentellen Bedingungen reduziert war. Die Aufklärung der komplexen molekularen Mechanismen der potentiellen Interaktion bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten. In Hinblick auf die klinische Konsequenz der erhaltenen Ergebnisse war es auffällig, dass einige Zytokine durch Bevacizumab in den MMR defizienten Zellen im Gegensatz zu den MMR kompetenten Zellen unterschiedlich reguliert wurden. Die in-vitro verwendeten Behandlungsschemata waren den klinisch zur Anwendung kommenden Protokollen nachempfunden. Zuerst wurde ein DNA-Schaden gesetzt, und den Zellen ermöglicht, sich mit oder ohne Bevacizumab zu erholen. Es konnte gezeigt werden, dass die inflammatorischen Zytokine CCL7 und CCL8 eine höhere Expression in der MMR-defiziente Zelllinie in Kombination mit Bevacizumab aufweisen. Daher wurde ein möglicher Crosstalk zwischen von Tumorzellen sezernierten Faktoren und myeloischen Zellen weiter verfolgt. Veränderungen der Genexpression in Monozyten durch Tumorzell- konditionierte Medien zeigte CCL18 als ein Bevacizumab reguliertes Gen in MMR-defizienten Zellen, aber nicht in MMR kompetenten Zellen. CCL18 übt seine Funktion primär im adaptiven Immunsystems aus um eine TH2-Antwort in T-Zellen auszulösen Ausserdem wird eine Erhöhung der nicht-spezifische Phagozytose als weitere Funktion beschrieben. CCL18 wurde bereits als prognostischer Marker in Magen-, Dickdarm- und Eierstockkrebsarten beschrieben; die klinische Bedeutung ist jedoch abhängig von Tumortyp. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Erhöhung der phagozytischen Aktivität von Makrophagen in Gegenwart von Bevacizumab wesentlich deutlicher in MMR-defizienten Zellen ausgeprägt war. Weiterhin wurde gefunden, dass nach DNA-Schädigung in Bevacizumab behandelten MMR-defizienten Zellen Zytokine freigesetzt werden, welche eine Monozytenmigration in einer Bevacizumab-abhängigen Weise induzieren. Dies weist auf eine funktionelle Interaktion von MMR-Defizienz und Bevacizumab hin. Zusätzlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Immunzellmodulation, die spezifisch für Mismatch-Reparatur defiziente Tumorzellen ist und in der klinischen Praxis als Marker für die Verabreichung von Bevacizumab verwendet werden könnte. / VEGF ist ein zentraler Regulator der Tumor-Angiogenese, und spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Bildung von neuen Blutgefäßen, sondern ist auch für die Migration, Proliferation, das Überleben und Apoptose von Tumorzellen essentiell. Angiogenese ist eine der universellen Funktionen, welche das Wachstum der meisten soliden Tumoren charakterisiert. Eine der klassischen therapeutischen Ideen wurde auf der Basis entwickelt, dass die spezifische Hemmung der Angiogenese das Potenzial hat in einer breiten Patientenpopulation einen klinischen Effekt zu zeigen. Die klinische Erfahrung und Anwendung hat jedoch gezeigt, dass die Hemmung der pathologischen Angiogenese nur in einem Teil der Patienten einen therapeutischen Nutzen aufweist. Somit stellt die Identifikation derjenigen Patienten, welche von der anti-angiogenen Therapie profitieren, einen wichtiger Schritt zur personalisierten Krebsbehandlung dar. Die erste zugelassene antiangiogene Therapie war Bevacizumab (Avastin®), ein monoklonaler Antikörper gegen VEGF, welcher unter anderem in soliden Tumoren wie CRC, BC, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) und dem Nierenzellkarzinom angewandt wird. VEGF-Rezeptoren befinden sich nicht nur auf Endothelzellen, sondern sind auch auf einer Anzahl von verschiedenen Zelltypen, einschließlich Tumorzellen, Monozyten und Makrophagen nachweisbar. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse befassen sich mit den zellulären Veränderungen an Tumorzellen und Leukozyten als Reaktion auf die Hemmung der VEGF-Signalkaskade durch Bevacizumab in-vitro. In den Initialen Experimenten wurde VEGF durch Hypoxie in Tumorzellen induziert und Veränderungen der Überlebensrate, der Proliferation, Migration als auch in der Gen- oder Protein-Expression gemessen. Es konnte eine minimale direkte Reaktion der VEGF-Hemmung auf Tumorzellen beobachtet werden, welche auf die Bevacizumab Behandlung zurückgeführt werden könnte. Es zeigten sich aber auch geringfügige Abweichungen in einigen der verwendeten Zellinien, die keine einheitliche Interpretation erlauben oder auf eine uniformelle Reaktion hinweisen würden. Das phänotypische Korrelat einer „Mismatch“ Reparatur (MMR)-Defizienz ist die Mikrosatelliteninstabilität im Gegensatz zu mikrosatellitenstabilen Tumoren und findet sich bei bis zu 15% der kolorektalen Karzinomen (CRC) wieder. Klinischen Daten deuten daraufhin, dass Bevacizumab besser in MMR-defizienten Tumoren wirkt. Daher wurden die weiteren Untersuchungen in gepaarten MMR stabilen und MMR instabilen CRC-Tumorzelllinien (MMR defizient und kompetent) durchgeführt. Weiterhin wurde ein DNA-schädigendes Agens, SN-38, ein Topoisomerase-Inhibitor (der aktive Metabolit von Irinotecan) dem Behandlungsschema zugefügt. Es zeigte sich, dass die Hemmung von VEGF mittels Bevacizumab die Fähigkeit der MMR defizienten Tumorzellen Kolonien zu bilden signifikant inhibiert. Im Gegensatz dazu, hatte die Behandlung von Bevacizumab vor der Zugabe des DNA schädigenden Agens zu einer vermehrten Kolonienzahl geführt. Außerdem erhöhte die Vorbehandlung mit Bevacizumab deutlich die Mutationsrate in MMR-defizienten Zellen, was durch die transiente Transfektion eines Dinukleotid-Repeat-Konstrukts nachgewiesen werden konnte. Dies deutete darauf hin, dass VEGF eine intrinsische Rolle in der Signalkaskade des MMR-Systems haben könnte. Deshalb wurde eine Anzahl von Signalalkaskaden zusätzlich zu Veränderungen von Genexpressionsprofilen untersucht und JNK als mögliche Verbindungsstelle der beiden Signalkaskaden, VEGF und MMR, identifiziert. Diese Hypothese wurde zusätzlich unterstützt durch die Tatsache, dass die JUN Expression unter diesen experimentellen Bedingungen reduziert war. Die Aufklärung der komplexen molekularen Mechanismen der potentiellen Interaktion bleibt zukünftigen Untersuchungen vorbehalten. In Hinblick auf die klinische Konsequenz der erhaltenen Ergebnisse war es auffällig, dass einige Zytokine durch Bevacizumab in den MMR defizienten Zellen im Gegensatz zu den MMR kompetenten Zellen unterschiedlich reguliert wurden. Die in-vitro verwendeten Behandlungsschemata waren den klinisch zur Anwendung kommenden Protokollen nachempfunden. Zuerst wurde ein DNA-Schaden gesetzt, und den Zellen ermöglicht, sich mit oder ohne Bevacizumab zu erholen. Es konnte gezeigt werden, dass die inflammatorischen Zytokine CCL7 und CCL8 eine höhere Expression in der MMR-defiziente Zelllinie in Kombination mit Bevacizumab aufweisen. Daher wurde ein möglicher Crosstalk zwischen von Tumorzellen sezernierten Faktoren und myeloischen Zellen weiter verfolgt. Veränderungen der Genexpression in Monozyten durch Tumorzell- konditionierte Medien zeigte CCL18 als ein Bevacizumab reguliertes Gen in MMR-defizienten Zellen, aber nicht in MMR kompetenten Zellen. CCL18 übt seine Funktion primär im adaptiven Immunsystems aus um eine TH2-Antwort in T-Zellen auszulösen Ausserdem wird eine Erhöhung der nicht-spezifische Phagozytose als weitere Funktion beschrieben. CCL18 wurde bereits als prognostischer Marker in Magen-, Dickdarm- und Eierstockkrebsarten beschrieben; die klinische Bedeutung ist jedoch abhängig von Tumortyp. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Erhöhung der phagozytischen Aktivität von Makrophagen in Gegenwart von Bevacizumab wesentlich deutlicher in MMR-defizienten Zellen ausgeprägt war. Weiterhin wurde gefunden, dass nach DNA-Schädigung in Bevacizumab behandelten MMR-defizienten Zellen Zytokine freigesetzt werden, welche eine Monozytenmigration in einer Bevacizumab-abhängigen Weise induzieren. Dies weist auf eine funktionelle Interaktion von MMR-Defizienz und Bevacizumab hin. Zusätzlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Immunzellmodulation, die spezifisch für Mismatch-Reparatur defiziente Tumorzellen ist und in der klinischen Praxis als Marker für die Verabreichung von Bevacizumab verwendet werden könnte.

In der vorliegenden Arbeit sollte die Eignung von T. pyriformis GL für den Nachweis von Botulinumneurotoxinen als biologische Alternative zum Maus-Bioassay untersucht werden. Dazu wurden funktionelle Tests für die Quantifizierung der mutmaßlich SNARE-abhängigen Prozesse Phagozytose und Exozytose entwickelt. Die Botulinumneurotoxine wurden durch Kultivierung der C. botulinum-Toxovare A bis G in einem Caseinpepton-Glukose-Hefeextrakt-Medium mit und ohne Zusatz von Trypsin herge-stellt. Die Neurotoxinkonzentrationen wurden mit Hilfe des Maus-Bioassays bestimmt. Für den Phagozytosetest wurde E. coli K12 als Beutekeim gewählt. Es konnte gezeigt werden, dass die KbE/ml von E. coli K12 allein durch die Phagozytoseaktivität von T. pyriformis reduziert wurde. Für den Exozytosetest wurde die saure Phosphatase als Leitenzym gewählt. Die neurotoxinhaltigen Kulturüberstände wurden mit Neurotoxinendkonzentrationen von 1,50E+02 MLD/ml (Maus letale Dosis/ml) bei den trypsinisierten und nicht trypsinisierten Ansätzen der Toxovare A bis D, F und G bzw. von 1,50E+00 MLD/ml bei dem trypsinisierten Ansatz des Toxovars E in den entwickelten Tests eingesetzt und auf ihren Einfluss untersucht. Die eingesetzten Neurotoxinkonzentrationen erwiesen sich als nicht ausreichend. Zudem wurde eine erhebliche Anfälligkeit der Phagozytose- und Exozytoseleistung von T. pyriformis gegen die Proteinkonzentrationen der eingesetzten Kulturüberstände nachgewiesen. Aufgrund dessen ist die Eignung von T. pyriformis im Rahmen der entwickelten Tests für den Nachweis von Botulinumneurotoxinen aus Proben wie biologischen Substraten oder mit ähnlichen, komplexen Matrizes nicht gegeben.

Bei der Alzheimerschen Erkrankung handelt es sich um eine progressiv verlaufende, neurodegenerative Erkrankung, die die häufigste Form altersbedingter, kognitiver Dysfunktionen des Menschen darstellt. Sie ist pathomorphologisch durch eine fortschreitende Formation von amorphen und kompakten extrazellulären Amyloid-Ablagerungen (Plaques) sowie durch die Ausbildung intrazellulärer neurofibrillärer Bündel charakterisiert. Die Oligomerisierung und die Aggregation von β-Amyloid1-42-Peptiden zu fibrillären Plaques und davon ausgehende neurodegenerative Veränderungen führen zu einer unspezifischen Aktivierung von Mikrogliazellen und zu Entzündungsprozessen im ZNS. Diese Antigen-unspezifische Form der Mikroglia-Aktivierung ist neurotoxisch und fördert daher die Neurodegeneration im Verlauf der Alzheimerschen Erkrankung. Mikroglia-Aktivierung ist allerdings nicht generell neurotoxisch, da es verschiedene, in der vorliegenden Arbeit diskutierte Arten von mikroglialer Aktivierung mit jeweils unterschiedlichen – neurotoxischen bis hin zu neuroprotektiven - Auswirkungen gibt. Das Ziel dieser Arbeit war es, die mikrogliale Aktivierung in einem Mausmodell des Morbus Alzheimer zu modulieren und die resultierenden Effekte zu charakterisieren. Für die Modulation der mikroglialen Aktivierung wurde die subklinische Infektion mit dem neurotropen Borna Disease Virus (BDV) genutzt. Um den Einfluss der veränderten mikroglialen Aktivierung auf die zerebrale β-Amyloid-Belastung zu untersuchen, wurden swAPP-transgene Mäuse der Linie Tg2576 verwendet, die die schwedische Mutationsvariante des humanen app überexprimieren. Diese Mäuse produzieren humane β-Amyloid-Peptide, die sich mit zunehmendem Alter zu Plaques formieren. Transgene Mäuse wurden in drei Altersgruppen (11, 13,5 und 18 Monate) BDV-infiziert. Vier Wochen später wurden im Gehirn der Mäuse immunhistochemisch Lymphozyteninfiltration, Astroglia- und Mikroglia-Aktivierung untersucht. Die zerebrale βA-Belastung dieser BDV-infizierten Mäuse wurde mittels βA1-42-Immunhistochemie und Thioflavin-S-Markierung histometrisch quantifiziert und mit nicht infizierten, transgenen Kontrollmäusen verglichen. Auch eine biochemische Analyse der βA1-40- und βA1-42-Peptide mittels ELISA wurde vorgenommen. Zu keinem Zeitpunkt wurde eine klinisch manifeste BDV-Erkrankung registriert; die BDV-infizierten Mäuse blieben klinisch unauffällig. βA-Ablagerungen allein waren nur bei massiver Formation in der Lage, einzelne Mikroglia-zellen zu aktivieren. Erst die intrazerebrale BDV-Infektion induzierte vorrangig CD4-T-lymphozytäre Infiltrationen sowie eine deutliche BDV-spezifische Aktivierung der Mikroglia-zellen, die vier Wochen p.i. maximal ausgeprägt waren. Es lag eine positive lokale und graduelle Korrelation zwischen CD4-T-Lymphozyteninfiltrationen und Mikroglia-Aktivierung in den Gehirnen BDV-infizierter Mäuse vor. Bis auf eine Untersuchungsgruppe wurde keine nachweisbare Reaktion der Astroglia - weder auf die BDV-Infektion, noch auf die βA-Ablagerungen - registriert. In allen untersuchten Altersgruppen wurde ein tendenziell reduzierter βA-Gehalt in den Gehirnen der BDV-infizierten Tiere gegenüber den nicht infizierten Kontrolltieren registriert. Diese βA-Reduktion nach BDV-Infektion war in der Altersgruppe 13,5 Monate am deutlichsten ausgeprägt, wo die βA-Belastung der BDV-infizierten Tiere in vielen untersuchten Arealen signifikant geringer war als die der Kontrolltiere. Eine lokale Korrelation zwischen Mikroglia-Aktivierung und βA-Reduktion wurde nicht nachgewiesen. In zahlreichen untersuchten Hirnarealen aller drei Altersgruppen war der Anteil von vaskulär lokalisiertem β-Amyloid in den Gehirnen der BDV-infizierten Mäuse gegenüber den nicht infizierten Kontrollmäusen signifikant erhöht. Schlussfolgerungen: 1) In unserem Mausmodell führt die BDV-Infektion zu einer Modulation der Mikroglia-Aktivierung. 2) Die Korrelation der Mikroglia-Aktivierung mit viral bedingter T-Zellinfiltration und erhöhter Zytokinexpression deutet auf adaptive, T-Zell-vermittelte Modulation als Induktor dieser Aktivierung. 3) Die BDV-induzierte Mikroglia-Aktivierung führt zu einer: a) β-Amyloid-Reduktion, an der vermutlich von spezifisch aktivierten Mikrogliazellen ausgehende Clearance-Mechanismen beteiligt sind. b) β-Amyloid-Umverteilung vom Parenchym zu den Gefäßen, vermutlich, um den βA-Abtransport über das Gefäßsystem zu realisieren, wobei Amyloid-Einlagerungen in die Gefäßwände möglich sind. 4) Die viral induzierte Mikroglia-Aktivierung hängt sowohl vom Alter als auch von möglicher Voraktivierung der Zellen ab; altersbedingte Dysfunktionalität der Mikroglia ist eine potentielle Ursache der geringeren β-Amyloid-Clearance in der Altersgruppe 18 Monate. 5) Die Modulation der Mikroglia-Aktivierung ist prinzipiell möglich und führt zu potentiell positiven Effekten. 6) Dieses Modell ist zur Untersuchung der Modulation mikroglialer Aktivierung über adaptive Mechanismen geeignet. / Alzheimer´s Disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder and the most common form of age-related cognitive failure in humans. Pathomorphologically, it is characterized by a progressive accumulation of amorphous and compact extracellular amyloid-β deposits (plaques) as well as intracellular neurofibrillary tangles. Oligomerization and aggregation of amyloid-β1-42, its formation of fibrillary deposits as well as associated neurodegenerative changes lead to an unspecific activation of microglial cells and to inflammatory processes in the CNS. This unspecific form of microglial activation is neurotoxic and enhances neurodegeneration in the course of Alzheimer´s Disease. However, microglial activation is not neurotoxic per se, since there are various types of microglial activation that are being discussed in this study; the different activation types have varying effects reaching from neurotoxic to neuroprotective. The aim of the study was to modify microglial activation in a mouse model of Morbus Alzheimer and to characterize the resulting effects. For the modulation of microglial activation, we used the subclinic infection with the neurotropic Borna Disease Virus (BDV). In order to study the impact of the modulated microglial activation on the cerebral amount of beta-amyloid material, we used swAPP-transgenic Tg2576 mice, which overexpress the Swedish mutation variant of the human APP. These mice produce human amyloid β peptides that form amyloid plaques upon aging. We infected transgenic mice intracerebrally with BDV at different ages (11, 13,5 and 18 months old) and investigated brain-sections of these mice four weeks later by means of immunohistochemistry with regard to lymphocytic infiltrations, astroglial and microglial activation. The amount of amyloid β in the brains of BDV-infected mice was compared to that of non-infected, transgenic mice. The investigation of the cerebral amyloid β load was realized immunohistochemically by using an anti-Aβ1-42-antibody as well as by means of Thioflavin-S fluorescence technique followed by histometric quantification. Additionally, a biochemical analysis of Aβ1-40 and Aβ1-42 peptides was done using an ELISA-kit. A clinically apparent BDV-disorder could not be seen at any stage; BDV-infected mice remained free of BDV symptoms. Only massive amyloid-β deposits were able to independently induce activation of single microglial cells. Intracerebral BDV-infection caused marked infiltrations of primarily CD4-T-lymphocytes as well as a prominent specific microglial activation, which reached maximum levels four weeks p.i. A positive local and gradual correlation of CD4-T-lymphocytes and microglial activation was registrated in the brains of BDV-infected mice. Except one age group, neither BDV-infection nor amyloid-β deposits induced a detectable reaction of astrocytes. In all investigated age groups, a reduced amount of amyloid-β could be measured in the brains of BDV-infected mice compared to non-infected control mice. This Aβ reduction after BDV-infection was most prominent in the age group 13,5 months, where Aβ-load of BDV-infected mice was significantly decreased in many brain areas compared to that of control mice. A local correlation of microglial activation and Aβ reduction could not be observed. Several brain areas in all three age groups showed a significantly higher amount of vascular amyloid-β in the brains of BDV-infected mice compared to those of non-infected controls. Conclusions: 1) In our mouse model, BDV-infection leads to a modulation of microglial activation. 2) The correlation of microglial activation with viral-induced infiltrations of T cells and with upregulated cytokine expression suggests an adaptive, T cell-induced modulation as trigger of this acivation. 3) BDV-specific microglial activation leads to: a) Reduced cerebal amyloid-β load, possibly realized by clearance mechanisms of activated microglial cells. b) Redistribution of amyloid-β from the parenchyma to the vessels, possibly in order to clear the amyloidogenic material via the vasculature. During these processes, amyloid deposition in the walls of the cerebral blood vessels is possible. 4) Viral-induced microglial activation depends on the cell´s age and possible pre-activation; dysfunctional changes in microglia might be a cause for the less effective Aβ-clearance observed in the age group 18 months. 5) In principle, modulation of microglial activation is possible and leads to potential beneficial effects. 6) This study displays a proper model for investigations of the modulation of microglial activation via adaptive mechanisms.

Patienten mit einer dekompensierten Leberzirrhose besitzen ein hohes Risiko bakterielle Infektionen zu entwickeln. Besonders häufig kommt es dabei zu einer spontan bakteriellen Peritonitis, wobei die Letalität bis heute noch immer bei bis zu 50 % liegt. Ein wesentlicher Grund für das generelle Infektionsrisiko besteht in der Zirrhose-assoziierten systemischen Immunparalyse als Folge einer andauernden Immunstimulation. Es ist allerdings ungeklärt warum bei Patienten mit Leberzirrhose die SBP die häufigste Infektion ist, wohingegen Patienten mit malignem Aszites dafür nicht empfänglich sind. Daher war das Ziel dieser Arbeit, die Funktionseinschränkung von PMNs im Aszites von Patienten mit Leberzirrhose zu evaluieren und dafür die Fähigkeit zur Phagozytose und stimuliertem oxidativen Burst in Aszites- und korrespondierenden Blutproben zu untersuchen.

Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es, die Frage zu beantworten, ob es nach einer einmaligen Gabe eines Glucocorticoidpräparates (Dexamethason-21-isonicotinat, Voren-Suspension) zu Veränderungen der Phagozytoseleistung der neutrophilen Granulozyten und der Monozyten bei Kühen im postpartalen Zeitraum kommt. Weiterhin sollte die Wirkung der Glucocorticoide in der Zeit von der Geburt bis 14 Tage p.p. auf hämatologische und klinisch-chemische Parameter bei diesen Tieren untersucht werden. Zusätzlich wurden die Ergebnisse der klinischen Untersuchungen und die Krankheitsinzidenz im Zeitraum bis acht Wochen p.p. erfasst. Dazu wurden 103 Kühe in die Untersuchung einbezogen, von denen 52 Tiere innerhalb von 12 Stunden nach dem Kalben eine Dexamethasoninjektion (2 mg/100kg KM Voren) erhielten. Die Phagozytoseleistung der segmentkernigen neutrophilen Granulozyten und der Monozyten wurde am Tag der Geburt (Tag eins) und zwei Tage p.p. (Tag drei) bei 34 Tieren bestimmt, von denen 17 Kühe als Versuchsgruppe und ebenso viele als Kontrollgruppe dienten. Für die Untersuchung wurde das Testkit zur quantitativen Bestimmung der Phagozytoseaktivitä von Moozyten und Granulozyten der Firma OPREGEN Pharma, Heidelberg verwendet. Es handelt sich hierbei um eine in vitro Technik, bei der der prozentuale Anteil der monozyten und Granulozyten (Aufnahme von Escherischia coli), die phagozytieren und die Phagozytoseaktivität (Anzahl der aufgenommenen Bakterien pro Zelle und Zeiteinheit) dieser Zellen bestimmt wurde. Die prozentualen Anteile der phagozytierenden neutrophilen Granulozyten stiegen in der Versuchsgruppe (75,57 % auf 86,49 %) und der Kontrollgruppe (77,23 % auf 80,04 %) an. Auch die Phagozytoseaktivität der neutrophilen Granulozyten stieg in Versuchsgruppe (2006 auf 2681) und Kontrollgruppe (1968 auf 2289) an. Bei beiden Parametern wies die Versuchsgruppe deutlichere Anstiege auf. Der Anstieg des prozentualen Anteils phagozytierender neutrophiler Granulozyten war signifikant (p < 0,05). Die Untersuchung der Phagozytoseparameter der Monozyten zeigte in der Kontrollgruppe einen Abfall sowohl des prozentualen Anteils (65,97 % auf 63,26 %) als auch der Phagozytoseaktivität (1262 auf 1220), während beide Parameter in der Versuchsgruppe anstiegen (63,39 % auf 69,51 % / 1144 auf 1379), was statistisch jedoch nicht gesichert werden konnte. Die Haptoglobinkonzentrationen zeigten in den Gruppen einen ähnlichen Verlauf. Nur am Tag 14 konnte ein signifikanter Gruppenunterschied nachgewiesen werden. Der Anti-Lipid-A-IgG-Antikörper-Titer stieg in beiden Gruppen im Untersuchungszeitraum an. Signifikante Gruppenunterschiede wurden nicht nachgewiesen. Die Parameter der klinischen Untersuchung zeigten keine Unterschiede zwischen den Gruppen. Auch die tägliche Milchmenge und die Jahresmilchleistung wiesen keinen Einfluss der Glucocorticoidapplikation auf. Die Inzidenz der postpartalen Erkrankungen zeigte keine Unterschiede zwischen den Gruppen. Das Differentialblutbild und die klinisch-chemischen Parameter lassen den gesicherten stoffwechselstabilisierenden Einfluss des Dexamethasons erkennen. Auf diese Weise wird die Abwehrfunktion der Kühe indirekt positiv durch die Glucocorticoide unterstützt. Die Ergebnisse der Untersuchung zeigen, dass eine einmalige Glucocorticoidapplikation im Zeitraum bis 12 Stunden p.p. die Phagozytoseleistung der neutrophilen Granulozyten sowie der Monozyten nicht negativ beeinflusst. Deutlich nachweisbar sind die stabilisierenden Wirkungen der Glukokortikoide auf den Stoffwechsel. Durch die Untersuchung wird belegt, dass keine negativen Auswirkungen auf die Krankheitsinzidenz und die Laktationsleistung bei einer einmaligen Applikation zu befürchten sind. Aus diesem Grund erscheint es möglich die positiven Effekte z. B. auf den Stoffwechsel, besonders in dieser für Hochleistungstiere kritischen Phase, zu nutzen. / The study was meant to show if a single injection of dexamethasone (Dexamethason-21-isonicotinat, Voren-Suspension) would lead to changes in phagocytic activity of neutrophils and monocytes in peripartal cows. Additionally the influence of the glucocorticoid on haematological and clinic-chemical parameters was measured. Furthermore the results of clinical examinations and the incidence of diseases during eight week after parturition were estimated. The study was performed on 103 cows, 52 of these received an intramuscular injection of dexamethason within 12 hours after parturition (dexamethason-group), the 51 other cows were untreated as control (control-group). The phagocytic activity was measured in 34 cows (17 after treatment with dexamethason and 17 cows of the control group) on day 1 (parturition) and day 3. The phagocytic activity was estimated by measuring two parameters: overall percentage of monocytes and granulocytes showing phagocytosis and individual cellular phagocytic activity (number of bacteria per cell). From day 1 to day 3 the percentage of phagocytic granulocytes increased in the dexamethasone–group from 75,57 % to 86,49 % and in the control-group from 77,23 % to 80,04 %. The cellular phagocytic activity of granulocytes also increased in the dexamethasone-group from 2006 to 2681 and in the control group from 1968 to 2289 between days 1 and 3. The differences between days 1 and 3 were more prominent in both parameters in the dexamethasone-group. The percentage of phagocytic neutrophils increased significantly (P < 0,05). In the control-group, the phagocytic activity decreased in monocytes in the percentage (from 65,97 % to 63,26 %) as well as in the cellular phagocytic activity (from 1262 to 1220). In comparison, both parameters increased in monocytes in the dexamethasone-group (percentage: from 63,39 % to 69,51 %, cellular activity: from 1144 to 1379) between days 1 and 3. All changes in phagocytic activity of monocytes were not statistically significant. The concentrations of haptoglobin show a similar pattern in both groups, only on day 14 a significant difference occured. The anti-lipid-A- IgG-antibody-titre increased in both groups during the study period. Between both groups significant differences were not observerd neither in anti-lipid-A-IgG-antibody-titre nor in the clinical parameters. The application of dexamethasone did not show any influence on the milk yield or on the incidence of diseases in the peripartal period. On the other hand the effects of the glucocorticoid on the metabolic parameters and on the differential white blood cell count was remarkable. The results of the present study show that a single injection of glucocorticoids within 12 hours after parturition did not influence the phagocytic activity of neutrophils and monocytes negatively. The beneficial effects of a single injection on the metabolism is remarkably given without negative effects on milk yield or incidence of diseases. Therefore, it seems possible to benefit from the outstanding effects of glucocorticoids on metabolism (glucose, free fatty acids, bilirubin) in this critical early postpartal period in high yielding cows.

Phagozyten entfernen apoptotische Zellen während der Entwicklung und beseitigen Pathogene im Immunsystem. Die zugrundeliegenden molekularen und zellulären Mechanismen, insbesondere die Unterschiede zwischen Makrophagen und nicht-professionellen Phagozyten wie Gliazellen, sind weitestgehend unklar. Wir haben neuartige Zellkultur-basierte Assays entwickelt, um 86 Kandidatengene zu testen, die wir aus der Literatur sowie unserem Expressions-Profiling in embryonalen Gliazellen von Drosophila melanogaster zusammengestellt haben. Die Genfunktion wurde durch RNAi herabgesenkt und die Phagozytoseeffizienz wurde mittels FACS untersucht; um die funktionelle Spezifität der Gene zu messen, haben wir nicht nur apoptotische Zellen, sondern auch Bakterien und Beads als „Essen“ angeboten. Mit Hilfe von Null-Mutanten und transgenem RNAi wurden die Ergebnis in vivo validiert. Um die Phagozytose apoptotischer Zellen testen, haben wir untersucht, wie Makrophagen und Gliazellen tote Zellen während der Embryonalentwicklung entfernen, während zur Untersuchung der bakteriellen Phagozytoze adulte Fliegen mit Bakterien infiziert wurden. Unser Screen liefert einen Querschnitt durch die verschiedenen Schritte der Phagozytose. In Bezug auf die Erkennung apoptotischer Zellen finden wir sowohl bekannte als auch neue Akteure für Makrophagen und Gliazellen. Außerdem zeigen wir, dass Vesikeltransport für die Phagozytose apoptotischer Zellen erforderlich ist. Überraschenderweise werden Rezeptoren zur Bakterienerkennung auch für apoptotische Zellen benötigt. Umgekehrt sind Apoptose- Rezeptoren auch für bakterielle Phagozytose notwendig, wodurch eine grundlegende Kreuz-Spezifität zutage tritt. Unsere Arbeit liefert die erste systematische und vergleichende Analyse der verschiedenen Phagozytosearten. Durch die Identifizierung vieler neuer Faktoren legt diese Arbeit den Grundstein für ein mechanistisches Verständnis der Phagozytose von apoptotischen Zellen und Bakterien durch Makrophagen und Gliazellen. / Phagocytes remove apoptotic cells during development and eliminate pathogens in the immune system. The underlying molecular and cellular mechanisms, particularly the differences between macrophages and non-professional phagocytes like glia, are not well understood. We used novel cell-based assays to screen phagocytic function of candidate genes assembled from literature and our genome-wide transcription profiling of Drosophila melanogaster embryonic glia. Gene function was knocked-down by RNAi and phagocytic efficiency assessed by flow cytometry; to explore functional specificity, we offered not only bacteria, but also apoptotic cells and beads as ''food''. To validate results in vivo, we analysed glial clearance of apoptotic neurons in embryonic development and immune clearance of bacteria in adult flies using both genetic mutants and transgenic RNAi. Our screen provides a cross section of the different steps of phagocytosis from recognition to engulfment and phagosomal degradation. For the recognition of apoptotic cells, we confirm the involvement of known factors, such as the chaperone Calreticulin and PS-binding Annexin, and identify new players, such as NIMA for macrophage and Megalin for glial corpse clearance. We find components associated with vesicular trafficking including the v-SNARE Synaptobrevin and the cytochrome Cyp4g15 to be required for corpse clearance. Unexpectedly, receptors known for bacterial recognition, such as PGRP-LC and TEP2, are also strongly required for apoptotic clearance. Conversely, receptors previously implicated in apoptotic cell recognition are also required in bacterial clearance (SIMU, Draper), revealing cross-specificity of the system. Our work represents the first systematic and comparative assessment of the molecular repertoire of different types of phagocytosis, and, with the identification of many new players, lays the groundwork for a mechanistic dissection of bacterial and corpse clearance by glia and macrophages.

Malariapigment Hemozoin wird üblicherweise als nicht-toxische, hochmolekulare, parasitäre Speicherform des nicht abgebauten, toxischen Häms aus dem Wirtszell-Hämoglobins betrachtet. Unaufgereinigtes Pigment, wie wir es im infizierten Erythroyzten finden und wie es nach Schizontenruptur freigesetzt wird, kann man als die "natürliche Diät" bezeichnen, die Makrophagen in Malaria-infizierten Wirten aufnehmen. Nach Aufnahme in den Makrophagen persistiert Hemozoin in den Lysosomen und wird nicht abgebaut. Das Häm-abbauende Enzym, die Häm-Oxygenase wird nicht induziert. Hemozoin ist eine potente Quelle für Radikale, woraus Lipoperoxide und davon abgeleitete Hydroxyaldehyde,wie 4-Hydroxynonenal resultieren . 4- Hydroxynonenal in Konzentrationen, wie sie in Hemozoin-beladenen Monozyten nachgewiesen wurden, hemmen die Proteinkinase C. In immunopräzipitierter Proteinkinase C aus Hemozoin- haltigen Makrophagen wurden ProteinkinaseC-Hydroxynonenal-Komplexe nachgewiesen. Die Hydroxynonenal-bedingte Hemmung der Proteinkinase C (und anderer bisher nicht untersuchter Enzyme und Prozesse) könnte die Hemozoineffekte auf den oxydativen burst und die Phagozytose erklären. Der Phorbolester-induzierte oxydative burst ist irreversibel gehemmt in Monozyten, die entweder Hemozoin oder aber Hemozoin-haltige infizierte Erythrozyten phagozytiert haben. Die Hemmung der NADPH-Oxydase, das für den oxydativen burst verantwortliche Enzym, durch intrazelluläres Hemozoin, sollte beträchtlich zur burst -Hemmung beitragen. Monozyten phagozytieren Hemozoin-haltige, infizierte Erythrozyten oder isoliertes Hemozoin , sind danach jedoch unfähig, erneut zu phagozytieren, wie es Monozyten nach Phagozytose und Verdau von nicht-infizierten Erythrozyten physiologischerweise tun. Schließlich ist die Expression von Membranantigenen, die für die Immunantwort von Bedeutung sind, in Hemozoin-haltigen Monozyten vermindert. Die Induktion des für die Präsentation externer Antigene verantwortlichen Histokompatibilitätskoplexes (MHC) Klasse II durch Interferon-gamma ist in Hemozoin-beladenen Monozyten aufgehoben. Sowohl das Interzelluläre Adhäsionsprotein 1 (CD54) als auch p150,95 Integrin (CD11c) sind in Hemozoin-haltigen Monozyten vermindert Oberflächen-exprimiert. Trotz der verschiedenen funktionellen Einschränkungen sind Hemozoin-beladene Phagozyten vital. Bei Plasmodium-falciparum-Malaria enthält ein hoher Anteil von Gewebsmakrophagen und zirkulierender Monozyten und Leukozyten große Mengen an Hemozoin. Wichtige Funktionen wie oxydativer burst , Phagozytose und die Expression von MHC Klasse II sind in Hemozoin- beladenen Phagozyten gestört. Es scheint deshalb gerechtfertigt, die Hemozoin-Beladung als wichtigen Faktor in der gestörten Immunantwort bei der P.falciparum-Malaria zu betrachten. / Malaria pigment hemozoin is generally considered to be a non-toxic, high-molecular-weight, parasitic storage form of undigested,toxic, host-hemoglobin-heme.Crude pigment, as present in infected erythrocytes and shed after schizont rupture, may be considered the 'natural diet' ingested by macrophages in malaria-infected hosts. After ingestion by macrophages hemozoin persists in the lysosomes without being degraded. The heme-degrading enzyme, the heme-oxygenase, is not induced. Hemozoin is a powerfull source of radicals that generates lipoperoxides and derived, toxic hydroxyaldehydes such as 4-hydroxynonenal. High concentrations of 4-hydroxynonenal, which have been detected in hemozoin-fed macrophages, inhibit protein kinase C. Complexes between hydroxynonenal and protein kinase C have been detected in immunoprecipitated protein kinase C from hemozoin-fed macrophages. Hydroxynonenal-mediated inhibition of protein kinase C (and of other as yet unidentified enzymes and processes) may explain hemozoin-mediated effects on oxidative burst and phagocytosis. The phorbol ester-eliceted oxidative burst is irreversibly suppressed in monocytes fed with hemozoin or hemozoin-containing, infected erythrocytes. The inhibition of NADPH-oxidase, the enzyme responsible for oxidative burst, by ingested hemozoin should considerably contribute to burst inhibition. Monocytes avidly ingest infected hemozoin-containing erythrocytes or isolated hemozoin but are unable to repeat the phagocytic cycle as monocytes do after phagocytosis and digestion of non-infected erythrocytes. Finally , the expression of membrane antigens involved in the immune response is decreased in hemozoin-loaded monocytes. The induction of the major histocompatibility complex (MHC) class II by interferon-gamma, that is responsible for presentation of external antigens, is abrogated in hemozoin-loaded monocyte. The intercellular adhesion molecule 1 (CD54) as well as the p150,95 integrin (CD11c) are decreased on the surface of monocytes containing hemozoin. Despite multiple functional impairments, hemozoin-loaded phagocytes remain alive. In Plasmodium-falciparum malaria large portions of resident macrophages and circulating monocytes and leukocytes contain massive amounts of hemozoin. Important functions like oxidative burst, phagocytosis and the expression of MHC class II are severely impaired in hemozoin-fed phagocytes. It seems therefore likly that hemozoin loading may play an important role in the impairment of the immune response seen in P.falciparum malaria.