Les phosphoinositides sont des molécules régulatrices présentes à l'interface membrane-cytosol, impliquées dans la transduction du signal, le trafic membranaire ainsi que l'organisation du cytosquelette. Ces lipides recrutent non seulement diverses protéines vers des compartiments spécifiques, mais régulent aussi leur activité enzymatique. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, ils interagissent directement avec le domaine RhoGAP de la protéine Rgd1, identifiée comme un activateur commun aux GTPases Rho3 et Rho4. Ces 2 protéines, respectivement impliquées dans la croissance polarisée et la cytocinèse, voient leur activité GTPasique exacerbée en présence de Rgd1pet des PIPs. L'objectif de cette thèse était comprendre à l'échelle moléculaire le processus unique d'activation de RhoGAP par les PIPs. Pour ce faire, nous avons réalisé l'étude structurale de RhoGAP par cristallographie couplée à la RMN en solution. Nos résultats montrent que le domaine possède les éléments essentiels à l'activation des protéines Rho. L'interaction avec les PIPs a été suivie par RMN en présence de PI(4)P et de PI(4,5)P2, respectivement localisés dans les vésicules de sécrétion et à la membrane plasmique. Nos résultats révèlent un site de liaison commun aux PIPs dans une région non conservée chez les domaines RhoGAP. L'affinité des complexes, de l'ordre de la centaine de micromolaires suggèrent qu'in vivo l'interaction soit transitoire et réversible avec les PIPs. La sélectivité de l'interaction se ferait donc de façon spatio-temporelle, au niveau des vésicules de sécrétion pour la croissance polarisée et de la membrane plasmique pour la cytocinèse. / Phosphoinositides act as regulatory and signalling molecules at the membrane-cytosol interface in signal transduction, membrane traffic and cytoskeleton organization. These lipids recruit several proteins to specific compartments, but also regulate their activity. In the yeast Saccharomycescerevisiae, they directly bind the Rgd1-RhoGAP domain, that stimulates the GTPase activity of bothRho3p and Rho4p. The GTPase activity of these two Rho proteins, respectively involved in the polarized growth and cytokinesis of the yeast, is enhanced with the presence of Rgd1p and PIPs. The main objective of this thesis is to understand the PIP-RhoGAP interaction at the molecular level. In order to do that, we coupled X-ray structure determination to solution NMR spectroscopy on the isolated RhoGAP domain. Our results show that the domain contains the conserved elements that would usually confer the catalytic GTPase activation. We us e liquid-state NMR spectroscopy to follow the interaction with PI(4)P and PI(4,5)P2, respectively found in secretion vesicles and the plasma membrane. Our study reveals a common binding site for both PIPs in a non-conserved region in the RhoGAP domain family. We measured sub-millimolar binding affinity for PIPs. Such moderate binding affinities are consistent with the biological requirement for reversible complex formation. The selectivity of the interaction could be made in a spatio temporal way, on the secretion vesicles during polarized growth and at the plasma membrane during cytokinesis.

Le couplage excitation-contraction (EC) du muscle squelettique correspond à l’efflux de Ca2+ par le réticulum sarcoplasmique (RS) suite à une dépolarisation sarcolemmale. Des mutations dans les gènes MTM1 et DNM2 sont responsables respectivement de la forme sévère et modérée de la myopathie centronucléaire (CNM). Chez la souris Mtm1 KO, l’absence de la (PtdInsP) 3-phosphatase MTM1 est associée à une altération du couplage EC, propablement la cause majeure de la faiblesse musculaire. Le rôle du PdtIns(4,5)P2 dans la régulation du couplage EC a été étudié dans des fibres musculaires exprimant une PtdInsP phosphatase sensible au potentiel. Grâce à une combinaison d’électrophysiologie et d’imagerie confocale, nous avons montré une altération de l’efflux calcique en réponse à de fortes dépolarisations déplétant les stocks de PdtIns(4,5)P2 à la membrane.Dans un deuxième temps, une caractérisation complète des défauts de signalisation calcique et du couplage EC a été réalisée dans les fibres musculaires isolées de souris Mtm1 KO. Nos résultats indiquent que l’efflux calcique est d’amplitude réduite, est retardé et est spatialement hétérogène. L’inhibition pharmacologique de l’activité PtdInsP 3-kinase améliore ces défauts in vitro et la survie des souris in vivo, suggérant que l’accumulation des substrats de MTM1 participe au défaut du couplage EC. Ces résultats montrent le bénéfice thérapeutique d’une approche pharmacologique aux inhibiteurs d’activité PtdInsP 3-kinase.Enfin, nous avons montré que les fibres musculaires d’un modèle murin de la forme modérée de CNM (KI-Dnm2R465W) partagent certaines altérations du couplage EC avec le modèle Mtm1 KO (retard de l’efflux calcique) pouvant contribuer à la faiblesse musculaire. Cependant, d’autres défauts (altérations structurales, réduction de l’efflux calcique) affectent plus sévèrement le modèle Mtm1 KO, et pourraient être déterminants dans la différence de sévérité entre les deux formes de CNM / Excitation-contraction (EC) coupling is the process whereby a membrane depolarization leads to an increased cytosolic Ca2+ content, allowing contraction. Mutations in the genes MTM1 and DNM2 are responsible respectively for severe and moderate forms of centronuclear myopathy (CNM). In Mtm1 KO mouse model, MTM deficiency is associated with defective EC coupling, which makes probably the major contribution to muscle meakness.PdtIns(4,5)P2 involvement in regulating EC coupling has been investigated in muscle fibers expressing a voltage sensing PtdInsP phosphatase. Thanks to a combination of electrophysiology and confocal imaging techniques, we showed a reduction of SR Ca2+ release amplitude in response to strong depolarizations activating PdtIns(4,5)P2 depletion at plasma membrane.Secondly, we made a complete characterization of calcium signaling and EC coupling properties in isolated muscle fibers from Mtm1 KO mice. Our results demonstrate that SR Ca2+ release is depressed, delayed and spatially heterogeneous in diseased fibers. Moreover, we showed that pharmacological inhibition of PtdInsP 3-kinase activity improves these defects in vitro and mice survival in vivo, suggesting that accumulation of MTM1 substrates may participate to defective EC coupling. Overall, these results provide proof of concept for the use of PtdIns 3-kinase inhibitors in severe form of CNM.Finally, we showed that muscle fibers from murine model of moderate CNM form (KI-Dnm2R465W) share some of EC coupling defects with Mtm1 KO model (delayed SR Ca2+ release) that may contribute to muscle weakness. However, other defects (structural alterations, depressed SR Ca2+ release) affect more severely Mtm1 KO model, and may be critical in determining the severity of CNM

Les phosphoinositides sont des phospholipides constituant des membranes cellulaires eucaryotes qui participent entre autres à la transmission de certains signaux extracellulaires dans le milieu intracellulaire. Désormais, un contrôle rigoureux et constant de leur métablisme par des enzymes est primordial pour assurer le bon fonctionnement de l'activité cellulaire. La 5-phosphatase SHIP2 est une enzyme capable d'hydrolyser certains de ces phosphoinositides dont le PtdIns(3,4,5)P3. Ce dernier, produit majoritaire d'une famille d'enzymes dénommées les PI(3)K, gouverne un large éventail de fonctions cellulaires dont la prolifération et le métabolisme énergétique. Deux souris knock-out pour SHIP2 ont été rapportées. La première présente une invalidation conjointe, accidentelle, des gènes INPPL1 et PHOX2A ;à l'état homozygote elle conduit à une létalité précoce. L'hétérozygote est viable et hypersensible à l'insuline. La seconde, caractérisée par l'invalidation unique d'INPPL1, est viable à l'état homozygote. D'un point vue phénotypique, cette souris ne montre pas d'altération majeure du métabolisme du glucose sous un régime conventionnel, mais un retard de croissance et une anomalie de la face. Elle est aussi protégée de l'obésité et de l'insulinorésistance induite par un régime riche en graisse.<p>Pour lever la controverse quant au rôle de SHIP2 in vivo chez la souris, le laboratoire hôte a généré un nouveau modèle, la souris SHIP2Δ/Δ, génétiquement modifiée pour exprimer une protéine SHIP2 tronquée dépourvue d'activité catalytique. L'analyse phénotypique de cette souris SHIP2Δ/Δ a permis de confirmer le retard de croissance et l'anomalie craniofaciale observés précédemment. Elle a aussi mis en évidence une réduction de la masse musculaire, de la masse adipeuse et une atrophie du tractus génital femelle. Le métabolisme du glucose et la sensibilité à l'insuline de la souris SHIP2Δ/Δ ne sont que peu affectés. Nous avons ensuite évalué la capacité du mutant SHIP2Δ à corriger l'insulinorésistance consécutive à une réduction de moitié de l'activité PI(3)K de classe IA in vivo chez la souris. L'expression du mutant SHIP2Δ sur ce fond génétique permet de rétablir un métabolisme glucidique normal mais cette récupération ne semble cependant pas s'opérer par la restauration de la phosphorylation de la PKB/Akt. D'autre part, les anomalies du développement de la souris SHIP2Δ/Δ sont maintenues sur ce fond génétique et accompagnées d'une hypertrophie cardiaque. Désormais, les effets de l'inactivation de SHIP2 in vivo chez la souris ne semblent pas être la seule conséquence d'une hyperactivation de la voie PI(3)K de classe IA suite à la perte d'une voie de dégradation du PtdIns(3,4,5)P3. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

SH2-containing inositol polyphosphate 5-phosphatases, SHIP2, has been established as a regulator of the insulin cascade, of cell adhesion and spreading, actin structures, remodelling and cytoskeletal organization. However, the molecular mechanisms underlying these processes still needed additional investigations. Among different regulatory mechanisms, protein-protein interaction play an essential role. To better understand the molecular mechanism of SHIP2 in signalling pathway as well as to reveal novel roles of SHIP2, a two-hybrid was performed to search for SHIP2 protein interactors. JNK-interacting protein 1 (JIP1) and intersectin 1 (ITSN1) were two of the newly identified protein partners of SHIP2. In this thesis, we characterized the associations of SHIP2 with JIP1 and ITSN1 in different aspects as identifying the interacting domain involved, biochemical function regulations and cellular biological roles.<p><p>The JIP scaffold family of proteins associate with MAPK, MAPKK and MAPKKK creating functional signaling modules to control the specificity of signal transduction. JIP1 is characterized as a scaffold protein assembling JNK, MAPK kinase 7 (MKK7), mixed lineage kinase (MLK), dual leucine zipper-bearing kinase (DLK). It thus enhances the selectivity and effectiveness of kinase activation during JNK signaling. In this thesis, the SHIP2-JIP1 interaction has been confirmed both in overexpression system in COS-7 and CHO-IR cells, and in native cells of COS-7. Both the proline-rich (PR) domain (residues 359-487) and PTB domain of JIP1 participated in this interaction. Overexpression of SHIP2 in COS-7 cells up-regulated JIP1-mediated JNK activation and the tyrosine phosphorylations of both JIP1 and MLK3. These effects were independent of SHIP2 catalytic activity. By the use of kinase inhibitors, we showed that Abl and Src family tyrosine kinases might be implicated in the regulation of JIP1 tyrosine phosphorylation. The residue Y270 of JIP1, a potential target of Abl tyrosine kinase, was shown to be involved in SHIP2-increased JIP1 tyrosine phosphorylation. In an in vitro assay, JIP1 negatively regulated the catalytic activity of SHIP2. In addition, upon the stimulation of okadaic acid, the overexpression of SHIP2 caused less viability of COS-7 cells. These data provide a new molecular link between SHIP2 and JIP1-mediated JNK pathway, and may help explain the biochemical mechanisms of SHIP2 in cellular apoptosis, as well as in insulin pathway.<p> <p>Another protein partner, ITSN1, is a multi-domain protein which plays a role in endocytosis, MAPK signalling and actin cytoskeleton. The interaction between SHIP2 and ITSN1 was confirmed in overexpression systems in COS-7 cells, as well as at the physiological concentration with the endogenously expressed proteins in C2C12 and COS-7 cells. EGF stimulation did not modulate the association of SHIP2 and ITSN1. ITSN1-SH3D, A, C and E domains interacted with the C-terminal part of SHIP2 with the binding affinity as SH3D>SH3A>SH3C>SH3E. Upon the stimulation of EGF, the expression of SHIP2 may recruit ITSN1 short form (ITSN1-S) to cell membrane. The ITSN-mediated ERK1/2 and JNK activations in response to EGF were not modulated when SHIP2 or catalytic mutant of SHIP2 or TSHIP2 was overexpressed. The link between SHIP2 and ITSN may provide one of the molecular mechanisms used by SHIP2 to participate in receptor endocytosis regulation.<p><p>In conclusion, our data of the associations of SHIP2 with JIP1 and ITSN1 provide evidence for potential novel biochemical mechanisms of SHIP2 to be implicated in JNK pathway as well as EGF receptor endocytosis. JIP1 and ITSN1, which are both implicated in the JNK pathway, may also have a link through the common protein partner SHIP2, giving rise to potential interesting study goal. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les ions Ca2+ responsables de la contraction musculaire sont extrudés du réticulum sarcoplasmique (RS) via le récepteur de la ryanodine de type 1 (RyR1). Des mutations du gène de RyR1 sont responsables chez l’homme de l’hyperthermie maligne (HM) et de la myopathie à cores centraux (MCC). Nous avons caractérisé les altérations de l’efflux calcique du RS dues à de telles mutations dans la fibre musculaire de souris par électrophysiologie et imagerie confocale. L’expression des formes Y523S, R615C et R2163H de RyR1, associées à l’HM, provoque une hypersensibilité de l’efflux vis-à-vis du potentiel membranaire alors que les formes I4897T et G4896V associées à la MCC provoquent une réduction chronique de l’efflux sans modification de densité des RyR1 s ainsi que des protéines Cav1.1 et SERCA1. L’expression de la forme R4892W associée à la MCC ne modifie pas l’efflux calcique suggérant une plus faible pénétrance fonctionnelle de cette forme. Dans tous les cas, aucune indication de changement du contenu en calcium RS n’a été observée. Les résultats suggèrent que les modifications pathologiques de l’efflux calcique sont la conséquence directe de l’altération de fonction des canaux. Le deuxième objectif du travail s’est intéressé au rôle de certains phosphoinositides (PtdInsPs) dans la régulation de l’efflux calcique du RS. La surexpression de la PtdInsPs-phosphatase Mtm 1 n’a aucun effet sur l’efflux calcique alors que l’application intracellulaire de ses deux principaux substrats inhibe l’efflux, suggérant que leur accumulation dans les fibres musculaires déficientes en Mtm1 pourrait contribuer aux altérations pathologiques associées du couplage excitation-contraction / Ca2+ ions that trigger muscle contraction are released from the sarcoplasmic reticulum (SR) through the type 1 ryanodine receptor (RyR1) channel. Mutations of the gene encoding RyR1 are responsible for malignant hyperthermia (MH) and central core disease (CCD) in human. We characterized the alterations of SR Ca2+ release due to such mutations in mouse fibers using electrophysiology and confocal imaging. Expression of each of the MH-associated Y523S, R615C and R2163H mutant forms of RyR1 increases the sensitivity of Ca2+ release to membrane potential whereas forms I4897T and G4896V that are associated to CCD provoke a chronic depression of Ca2+ release with no concurrent alteration of RyR1, Cav1.1 and SERCA1 density. Expression of the CDD-associated R4892W form of RyR1 has no effect on Ca2+ release suggesting a weaker functional penetrance of this mutant form. In all cases we found no indication for a change in SR calcium content. Results suggest that pathological changes in Ca2+ release are the direct consequence of the functional alteration of the channels. The second goal of this work focused on the role of certain phosphoinositides (PtdInsPs) in the control of SR Ca2+ release. Over-expression of the PtdInsPs-phosphatase Mtm 1 does not affect Ca2+ release whereas intracellular application of its two main substrates inhibits Ca2+ release, suggesting that accumulation of these molecules in Mtm 1-deficient fibers could contribute to the associated alterations of excitation-contraction coupling

CMT4H est une forme de CMT démyélinisant, à transmission autosomique récessive, pour laquelle notre équipe a identifié le gène responsable. Il s'agit du gène FGD4, codant pour FRABIN, protéine de 766 AA possédant 5 domaines fonctionnels: le domaine FAB de liaison à l'actine, un domaine DH responsable de l'échange GDP/GTP, et trois domaines de liaison avec des polyphosphoinositides. C'est une RhoGEF, connue pour activer les RhoGTPases Cdc42 et Rac1.Mon projet de thèse vise à mieux comprendre les bases moléculaires et les mécanismes physiopatologiques qui sous-tendent CMT4H grace à l'étudie de modèles cellulaires et murins. Dans un premier temps, j'ai identifié deux nouvelles mutations dans le gène FGD4. J'ai pu démontrer l'impact fonctionnel des mutations p.Met298fs*8 et p.Ala172Glyfs*27 et une absence totale la protéine dans les fibroblastes de ces patients, donnant lieu à une augmentation de l'activation de Cdc42.L'étude d'un modèle murin d'ablation conditionnelle de FGD4 dans les cellules de Schwann, m'a permis de démontrer la présence d' anomalies myéliniques dans le nerf périphérique de ces souris, ainsi qu'une diminution de l'activation de Cdc42.J'ai également montré, que dans les fibroblastes, FRABIN était localisée au niveau des endomembranes et que l'endocytose semblait déficient dans des cellules de patients. Finalement, l'identification de SNX3,comme partenaire protéique de FRABIN constitue un argument supplémentaire fort en faveur du rôle de FRABIN dans le trafic membranaire.La poursuite de l'étude de nos modèles et de modèles iPS ,permettra de poursuivre l'exploration de ces mécanismes et de mieux comprendre la physiopathologie de la forme CMT4H. / Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 4H (CMT4H) is an inherited, autosomal recessive, peripheral neuropathy characterized by demyelination of sensory-motor nerves and due to mutations in FGD4. FGD4 encodes FRABIN, a GDP/GTP nucleotide exchange factor (GEF), specific for the GTPase Cdc42, composed of five functional domains: an N-terminal F-actin binding (FAB) domain, one Dbl homology (DH) domain, two pleckstrin homology (PH) domains, and one cysteine-rich FYVE domain.The main goal of my project is to understand the mechanisms leading to the pathology in CMT4H. To this purpose, I studied both cellular and mouse models.First, molecular screening of FGD4 allowed us to identify two additional mutations in FGD4. We also demonstrated a complete absence of the 105 kDa FRABIN isoform in patients homozygous for splicing and frameshift mutations, which unexpectedly was related to abnormally high levels of Cdc42 activation.The study of a mouse model with conditional ablation of fgd4 in Schwann cells, that we have generated, demonstrates the presence of abnormal myelin outfoldings in sciatic nerves from KO mice, which might be linked to decreased levels of Cd42 in mouse sciatic nerves. Finally, altered recycling of transferrin receptors in patients, with complete absence of FRABIN described above, as well as the identification of SNX3, a protein involved in endosomal trafficking, as a partner for FRABIN are new elements that I provide in favour of a role for FRABIN in membrane and cellular trafficking.Still, there are many points to understand, notably the relation between the RhoGTPase and the endosomal pathways, and the study of our models will help answer these questions.

Call number: LD2668 .T4 1985 Z48 / Master of Science

Receptor-activated phosphatidylinositol (PtdIns) hydrolysis was examined in AR42J rat pancreatic acini. Cholecystokinin-octapeptide (CCK₈) and bombesin induced a dose-dependent accumulation of [³H] inositol monophosphate ([³H]InsP₁). Manganese (Mn²⁺), a known calcium channel blocker, did not alter basal PtdIns hydrolysis. In contrast, when added 5 minutes prior to the addition of agonists for 60 minutes, Mn²⁺ markedly inhibited secretagogue-mediated [³H]InsP1 formation. Mn²⁺ also attenuated the CCK₈-mediated increase in biologically active inositol 1,4,5-trisphosphate and inositol 1,3,4,5-tetrakisphosphate. These inhibitory effects of Mn²⁺ were mimicked by lanthanum and by EGTA. Addition of calcium to EGTA-treated cells abolished the inhibitory effects of extracellular calcium depletion. Mn²⁺, La³⁺ and EGTA exerted similar inhibitory effects on PtdIns hydrolysis in pancreatic acini. These findings suggest that receptor-activated calcium influx is required for full activation of the CCK₈-mediated signal transduction pathway that is coupled to PtdIns hydrolysis.

Wnt signalling belongs to conserved pathways and mediates cell fate decision, development, regeneration and adult tissue homeostasis. Disruption or misregulation of Wnt signalling pathway often leads to disease. Wnt proteins are hydrophobic glycoproteins which need a special receptor for transport from Golgi Apparatus to cell surface, which is called MIG-14 in Caenorhabditis elegans and Wntless (Wls) in mammals. In this study, I focus on understanding mechanisms that regulate MTM-6 protein activity. MTM-6, a lipid phosphatase associated with endosomal membrane, has been recently identified as a regulator of MIG-14/Wls trafficking in Caenorhabditis elegans. Silencing of mtm-6 leads to misregulation of some Wnt-directed processes, such as migration of Q neuroblasts progeny. This study reports identification of novel mtm-6 genetic interactors that have been found to influence migration of Q neuroblasts progeny through Wnt signalling. New knowledge about mtm-6 genetic interactions bring us near to understanding of Wnt signalling regulation. Keywords: Caenorhabditis elegans, MTM-6, SEL-5, Wntless, Wnt, endosomes, phosphoinositides, retromer

Insulin signalling is an essential process in humans by which the level of plasma glucose is maintained within the physiologically healthy range. Insulin activates the phosphoinositide 3 kinase (PI3K) signalling pathway that generates the phospholipid messenger PtdIns(3,4,5)P3, which in turn enhances the activity of two important proteins, AKT and Rac1. This then leads to increase the presence of the glucose transporter 4 (GLUT4) at the plasma membrane that enhances the intake of glucose, particularly in skeletal muscle cells and adipocytes. Insulin signalling also triggers interconversion of several other phosphoinositides (PIs) which play pivotal roles in different steps of glucose regulation. PtdIns5P is an important PI that is robustly increased after insulin treatment in the skeletal muscle cell line, L6 myotubes. Many of PtdIns5P`s functions are not fully understood. To gain more knowledge of the role of PtdIns5P in insulin signalling in muscle cells, the PtdIns5P kinase phosphatidylinositol-5-phosphate 4-kinase a (PIP4K2a) was over-expressed in L6 myotubes as a way of removing PtdIns5P, and the consequences in insulin signalling were studied. Although PtdIns5P is converted by PIP4K2a to PtdIns(4,5)P2 which is a precursor of the potent PI PtdIns(3,4,5)P3, previous studies revealed that the increase in PtdIns(3,4,5)P3 induced by insulin in control cells is diminished in cells overexpressing PIP4K2a, for unknown reasons. Additionally, although the phosphorylation of the serine/threonine protein kinase AKT was not affected in these L6 cells, glucose uptake was attenuated. The current study investigates the possible causes of attenuating glucose uptake in PIP4K overexpressing myotubes by examining the small GTPase Rac1 which plays an important role in the cytoskeleton re-arrangement that is necessary for GLUT4 translocation. Furthermore, the possible roles of PI phosphatases that may cause the disturbance on the levels of PIs in response to insulin were evaluated. Additionally, the potential role of PtdIns5P in Rac1 activation in L6 myotubes was further investigated by delivering synthetic PtdIns5P using a carrier-based delivery approach. The results showed that the attenuation of glucose uptake documented in previous studies occurred as a result of a defect in the process of translocating GLUT4 from intracellular storage to the plasma membrane. Rac1 activity was significantly reduced in cells expressing PIP4K2a. Quantifying the level of PIs suggested that PIP4K2a expression increases the removal of PtdIns(3,4,5)P3 by the PI 5-phosphatase, SKIP. Silencing the expression of SKIP by siRNA restored the level of PtdIns(3,4,5)P3 but Rac1 activity and the attenuation GLUT4 translocation were not rescued possibly as a result of removing PtdIns5P by PIP4K2a. On the other hand, exogenous delivery of PtdIns5P in L6 myotubes activates both Rac1 and GLUT4 translocation in the absence of insulin. However, activating GLUT4 translocation by the exogenous PtdIns5P requires PI3K activity since redistribution of GLUT4 to the plasma membrane is inhibited by the PI3K inhibitor, wortmannin. Removing PtdIns5P reduces Rac1 activity and stimulates SKIP that inhibits PtdIns(3,4,5)P3 increase which attenuates GLUT4 translocation and hence glucose uptake. These results emphasise the critical role played by PtdIns5P which seems to serve as a regulator of insulin signalling, both directly and/or by regulating other enzymes involved in the metabolism of PIs.