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Thesis (Ph. D.)--University of Lund, 1995. / Published dissertation. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--University of Lund, 1995. / Published dissertation. Includes bibliographical references.

Name: Anna Jadwiga Kielkowska Dissertation title: The role of PTEN as a PI(3,4)P2 lipid phosphatase in Class I phosphoinositide 3-kinase signalling Abstract Class I phosphoinositide 3-kinases (Class I PI3Ks) are essential players involved in the signalling events in the cell and are critical promoters of cellular growth, survival and metabolism. Once activated by environmental stimuli such as growth factors, cytokines or antigens, they exert their catalytic activity by phosphorylating phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate (PI(4,5)P2) to yield a second messenger - PI(3,4,5)P3. Unrestrained PI(3,4,5)P3 signalling has been classically associated with hyperactivation of the Class I PI3K/AKT pathway and has been shown to be a molecular trigger of many pathophysiologies in humans, including autoimmune disorders, respiratory diseases and cancer. To date, two classes of lipid phosphatases SHIP1/2 and PTEN have been reported, which dephosphorylate PI(3,4,5)P3 on positions 5’ and 3’ of the inositol ring to generate PI(3,4)P2 and PI(4,5)P2 respectively, and thus quench Class I PI3K signalling. Moreover, PI(3,4)P2 levels in the cell are regulated by two important lipid 4-phosphatases - INPP4A/B. While the role of PTEN as a tumour suppressor is well established, functions of SHIP1/2 and INPP4A/B are just starting to emerge. A major barrier to progress in this field has been the lack of high quality measurements of PI(3,4)P2, to assess the impact it may have on shaping cellular behaviour. This dissertation summarises the work performed to develop a novel, HPLC-ESI MS/MS based method, in order to measure the product of PI(3,4,5)P3 5-dephosphorylation, PI(3,4)P2, separated from its more abundant regioisomer in cells - PI(4,5)P2. This and an existing HPLC-ESI MS/MS method for measuring PI(3,4,5)P3, have enabled us to describe the fluxes through Class I PI3K-controlled PI(3,4,5)P3 generation and its subsequent 3- and 5- dephosphorylation pathways in human mammary epithelial cells (Mcf10a) stimulated with epidermal growth factor (EGF). By means of genetic suppression of PTEN and INPP4B, we revealed an unexpectedly high level of PI(3,4)P2 that accumulates in EGF-stimulated PTEN-INPP4B-KO Mcf10a cells. Further, an in vitro biochemical assay suggested a novel role for PTEN as a direct PI(3,4)P2 3-phosphatase in Mcf10a cells. This important observation was supported by in sillico phosphatidylinositol lipid modelling of the relevant pathways. In an effort to understand its potential physiological significance, we demonstrated that PI(3,4)P2 accumulation correlates with the ability of genetically modified Mcf10a cells to form gelatin-degrading invadopodia. Finally, we used a mouse prostate cancer model to show PTEN’s importance in controlling PI(3,4)P2 levels in vivo, pointing to a potential role for PI(3,4)P2 in PTEN-dependent tumourigenesis. I hope that the work described in this dissertation will contribute to the current knowledge of phosphatidylinositol lipid biology in the context of Class I PI3K signalling and will simulate future efforts to gain an in-depth understanding of the roles of PTEN and PI(3,4)P2 in cellular physiology.

Le métabolisme des phosphoinositides est constitué d’un réseau complexe d’enzymes et de seconds messagers phospholipidiques et solubles cruciaux pour de nombreux processus cellulaires. Le phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3), second messager très important dans la cellule est contrôlé par plusieurs phosphatases. La phosphatase PTEN, fréquemment mutée dans de nombreux cancers humains (glioblastome, cancer de la prostate, cancer du sein, …), le déphosphoryle en position 3 pour donner du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2). Les cellules de mammifères possèdent également une activité « inositol 5-phosphatase » pour de nombreux dérivés du myo-inositol. C’est la protéine SHIP2 (SH2-containing Inositol 5-phosphatase 2), une lipide phosphatase membre de la famille des phosphatidylinositol polyphosphate 5-phosphatases qui est, entre autres, responsable de cette activité. <p>Le but de ce travail de thèse a été de mettre en évidence un rôle potentiel de SHIP2 et/ou PTEN dans un modèle murin de tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) ;ce modèle exprime une forme constitutivement active du récepteur tyrosine kinase Kit muté sur l’acide aminé 641. Les souris qui ont été générées par le groupe du Dr Brian Rubin (Lerner Research Institute and Taussig Cancer Center, Cleveland) sont dénommées, les souris KitK641E.<p>La caractérisation des souris KitK641E nous a permis de montrer que SHIP2 et PTEN étaient exprimés dans les cellules Kit positives, les cellules de Cajal et qu’ils semblaient régulés de façons différentes.<p>En effet, nous avons pu mettre en évidence une augmentation de l’expression de PTEN dans l’antre gastrique des souris KitK641E homozygotes. Cette augmentation d’expression a également été observée dans l’antre gastrique de souris double transgéniques KitK641E x PTEN+/- alors que l’expression de PTEN dans le foie, un tissu n’exprimant pas de cellules Kit positives, était bien diminuée. Des expériences de PCR quantitative ont également permis de montrer que cette augmentation d’expression de PTEN ne provenait pas d’une augmentation du taux d’ARNm mais qu’elle se situait plutôt au niveau post-traductionnel. Ces données nous permettent de conclure que l’augmentation d’expression de PTEN dans les cellules Kit positives des souris KitK641E homozygotes est influencée par l’activation constitutive du récepteur Kit. <p>A l’inverse, l’expression de SHIP2 dans les cellules Kit positives n’a pu être mise en évidence qu’après activation constitutive du récepteur Kit. En parallèle, l’étude des voies de signalisation dépendantes du récepteur Kit nous ont permis de montrer que la phosphorylation de PKB ne semblait pas être affectée et que ce serait plutôt la voie des MAPK kinases qui interviendrait dans ce modèle. <p>Nous avons également observé la localisation subcellulaire de SHIP2 et de PTEN en utilisant un modèle cellulaire de cellules GIST882 (cellules dérivées d’un GIST humain portant la mutation correspondante à notre modèle murin). Dans ce modèle, PTEN est principalement localisé dans le noyau alors que SHIP2 est localisé à la fois au sein du noyau et du cytoplasme. Ce modèle nous a également permis de montrer que la forme phosphorylée sur tyrosine de SHIP2 (Y1135) était localisée dans le noyau et qu’elle était modulée en fonction du cycle cellulaire.<p>En conclusion, ces travaux ont permis de montrer que dans le modèle de souris KitK641E, SHIP2 et PTEN étaient localisés au sein des cellules Kit positives et qu’ils étaient modulés par des mécanismes différents. L’augmentation d’expression de PTEN observée dans les souris KitK641E homozygotes pourrait constituer un mécanisme de rétrocontrôle négatif afin de modifier l’impact de voies de signalisation en aval du récepteur Kit dans ce modèle oncogénique.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’Ins(1,3,4,5)P4 produit par l’Ins(1,4,5)P3 3-kinase de type B (Itpkb) est nécessaire au développement des thymocytes et lymphocytes T murins. Trois hypothèses sont admises quant à la fonction physiologique et au mécanisme d’action de cet inositol phosphorylé :la première postule que l’Ins(1,3,4,5)P4 module la réponse calcique intracellulaire ;la seconde, que cet inositolphosphate est un intermédiaire métabolique dans la synthèse d’inositols plus hautement phosphorylés ;la dernière, que l’Ins(1,3,4,5)P4 module la localisation subcellulaire et la fonction de protéines capables de la reconnaître par des domaines spécifiques de liaison. Afin d’investiguer cette dernière hypothèse, nous avons analysé la physiologie des lymphocytes B invalidés pour Itpkb et avons généré et analysé des souris transgéniques d’addition pour Rasa3, récepteur potentiel à l’Ins(1,3,4,5)P4.<p>Les lymphocytes B déficients en Itpkb présentent un défaut de survie car ils ne peuvent activer correctement les protéines kinases Erk1/2 suite à la stimulation du BCR de surface. Cela conduit à la surexpression anormale de la protéine pro-apoptotique Bim. La diminution de l’expression de Bim est suffisante dans ce modèle pour restaurer une fonction normale des lymphocytes B. In vitro, Nous avons montré que l’Ins(1,3,4,5)P4 est nécessaire à la translocation de Rasa3, protéine favorisant l’inactivation de la voie de Ras, de la membrane vers le cytoplasme. L’étude de lymphocytes invalidés pour Itpkb dans un modèle de BCR transgénique semble montrer que des anomalies de réponse calcique ne participent pas au phénotype.<p>En conclusion, nos résultats indiquent qu’une des voies de signalisation préférentielle de l’Ins(1,3,4,5)P4 passe par la modulation de la localisation subcellulaire de protéines possédant un domaine d’affinité pour l’Ins(1,3,4,5)P4 telle que Rasa3.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les phosphoinositides (PI) sont impliqués dans de nombreux processus biologiques cellulaires, tels que la régulation du cytosquelette d'actine, le trafic vésiculaire membranaire et les voies de signalisation médiées par des récepteurs membranaires. Le métabolisme des phosphoinositides est un processus hautement régulé par un ensemble de PI-kinases et PI-phosphatases. Des mutations dans ces enzymes sont associées à des maladies tels que le syndrome de Lowe, le diabète de type 2, les désordres bipolaires et le cancer.<p>\ / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le métabolisme des phosphoinositides constitue un processus crucial parmi les systèmes permettant la terminaison de la transmission intracellulaire d’un stimulus extracellulaire. En effet, l’une de principales voies de signalisation intracellulaire engendrée en réponse à la liaison d’hormones ou de facteurs de croissance sur leurs récepteurs spécifiques fait intervenir la phosphorylation du PtdIns(4,5)P2 en PtdIns(3,4,5)P3 par une PI 3-kinase. Les enzymes responsables du métabolisme de ce second messager sont donc essentielles à la fonction normale de la cellule. L’ADNc de la 5-phosphatase SHIP2 a été cloné dans notre laboratoire. Cette enzyme présente au sein de sa structure primaire, en plus d’un domaine catalytique 5-phosphatase, un grand nombre de motifs permettant des interactions spécifiques avec d’autres protéines :un domaine SH2 N-terminal, des séquences riches en prolines, un motif NPXY et un domaine SAM. <p>SHIP2 joue un rôle de régulateur négatif dans la voie PKB et MAPK in vitro dans plusieurs modèles cellulaires. De plus, l’affinité de SHIP2 pour le cytosquelette a été mise en évidence notamment dans les plaquettes sanguines.<p> Notre travail de thèse s’intègre dans le cadre de l’étude biochimique de SHIP2 et plus particulièrement dans la recherche de ses partenaires protéiques. La Vinexine, protéine du cytosquelette impliquée dans l’adhérence cellulaire, avait été identifiée comme une protéine interagissant avec SHIP2 par la technique du double hybride. Nous avons confirmé cette association par des expériences d’immunoprécipitation en système transfecté (cellules COS-7) ainsi qu’en système natif (cellules HeLa et MEF). Nous avons montré que cette interaction n’était ni modulée par une stimulation à l’EGF (dans des cellules COS-7) ni par le sérum (dans des cellules MEF). Nous avons démontré une colocalisation de SHIP2 avec la Vinexine &61537; à la périphérie des cellules COS-7 stimulées à l’EGF. Par la suite, nous nous sommes intéressés au rôle potentiel de cette interaction dans l’adhérence cellulaire. Nous avons montré que la surexpression de SHIP2 ou de la Vinexine &61537; augmente l’adhérence des cellules COS-7 sur un substrat de collagène I. L’adhérence à ce même substrat est diminuée dans les cellules MEF issues des souris déficientes en SHIP2 comparées à des cellules contrôles SHIP2 +/+. De plus, il apparaît que la partie carboxy-terminale de SHIP2 ainsi que son activité catalytique sont importantes pour l’adhérence des cellules au substrat.<p>Ces résultats suggèrent un rôle important de SHIP2 dans l’adhérence cellulaire et l’organisation du cytosquelette d’actine faisant intervenir un mécanisme probable de déphosphorylation du PtdInsP3.<p> / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le Phosphatidylinositol(4,5)P2 (PtdIns(4,5)P2) est essentiel pour réguler divers processus cellulaires, y compris la signalisation cellulaire, le trafic intracellulaire et la cytocinèse. Le contrôle strict de son homéostasie est donc crucial et la dérégulation des kinases, des phosphatases et des phospholipases qui la contrôlent conduit à de multiples pathologies. Parmi elles, le syndrome de Lowe est une maladie rare et incurable causée par des mutations du gène OCRL qui code pour la PtdIns(4,5)P2 phosphatase OCRL1. La déplétion de dOCRL, l’orthologue d’OCRL1 chez la drosophile altère l’homéostasie du PtdIns(4,5)P2 avec (i) une accumulation anormale de PtdIns(4,5)P2 sur les endomembranes conduisant (ii) à des défauts de cytocinèse et à de la multinucléation. L’objectif de cette thèse était de comprendre comment le PtdIns(4,5)P2 est régulé sur les endomembranes. Dans les cellules de drosophile, nous avons découvert une fonction nouvelle et inattendue pour le suppresseur de tumeur PTEN, indépendante de son activité phosphatase. En effet, nous avons constaté que PTEN réduit les niveaux de PtdIns(4,5)P2 sur les endosomes grâce à l’action enzymatique de dPLCXD, une phospholipase C (PLC) atypique. Ainsi la voie de signalisation PTEN/dPLCXD peut compenser pour les défauts de cytocinèse dus à la perte de dOCRL. Enfin, nous avons identifié un activateur chimique des PLC qui restaure la perte fonctionnelle d’OCRL dans trois modèles de syndrome de Lowe distincts. Par la suite, nous avons étudié le rôle de la PTEN/PLCXD pendant l’autophagie, mécanisme d’autodigestion du matériel cellulaire. En effet, l’homéostasie du PtdIns(4,5)P2 lysosomale est essentielle pour l’étape autophagique de fusion des autophagosomes avec lysosomes. Nous avons observé que la déplétion de PLCXD et la surexpression d’un mutant catalytiquement inactif de PTEN altèrent l’autophagie chez les cellules de drosophile et de mammifère. Ces données suggèrent que la voie PTEN/PLCXD nouvellement identifiée régule le flux autophagique. Dans cette thèse, nous avons mis en lumière une nouvelle voie de signalisation PTEN/dPLCXD qui contrôle les niveaux de PtdIns(4,5)P2 sur les endolysosomes. Cette voie peut réguler l’autophagie et compenser la perte de dOCRL. Il s’agit d’une nouvelle fonction de PTEN indépendante de son activité phosphatase et c’est une première fonction biologique connue pour PLCXD. Cette découverte a conduit à l’identification d’une stratégie thérapeutique potentielle pour traiter les patients atteints du syndrome de Lowe. / Phosphatidylinositol(4,5)P2 (PtdIns(4,5)P2) is essential for various cellular processes, including cell signaling, intracellular traffic and cytokinesis. Therefore, strict control of its homeostasis is crucial. Indeed, the deregulation of the kinases, phosphatases and phospholipases which controls PtdIns(4,5)P2 leads to multiple pathologies. Among them, the Lowe syndrome is a rare and incurable disease caused by mutations in the OCRL gene which codes for PtdIns(4,5)P2 phosphatase OCRL1. Depletion of dOCRL, the orthologue of OCRL1 in drosophila, alters the homeostasis of PtdIns(4,5)P2 with (i) an abnormal accumulation of PtdIns(4,5)P2 on the endomembranes leading (ii) to cytokinesis defects and multinucleation. The objective of this thesis was to understand how PtdIns(4,5)P2 is regulated on endomembranes. In drosophila cells, we have discovered a new and unexpected function for the tumor suppressor PTEN independent of its phosphatase activity. Indeed, we have found that PTEN reduces the levels of PtdIns(4,5)P2 on endolysosomes thanks to the enzymatic action of dPLCXD, an atypical phospholipase C (PLC). Thus, the PTEN/dPLCXD signaling pathway can compensate for cytokinesis defects due to the loss of dOCRL. Finally, we identified a chemical activator of PLC that restores the functional loss of OCRL in three distinct Lowe syndrome models. Next, we studied the role of this newly identified PTEN/PLCXD pathway during autophagy, a self-digestion mechanism. Indeed, the homeostasis of lysosomal PtdIns(4,5)P2 is essential for the fusion of autophagosomes with lysosomes during autophagy. We have observed that depletion of PLCXD and overexpression of a catalytically inactive mutant of PTEN both alter autophagy in Drosophila and mammalian cells. These data suggest that this newly identified PTEN/PLCXD pathway regulates the autophagic flux. In this thesis, we have highlighted a new PTEN/dPLCXD signaling pathway which controls the levels of PtdIns(4,5)P2 on endolysosomes. This new PTEN function is independent of its phosphatase activity and the first biological function for PLCXD can regulate autophagy and compensate for the loss of dOCRL. This discovery led to the identification of a potential therapeutic strategy for treating patients with Lowe’s syndrome.

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