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In order to associate with the cytoplasmic leaflet of the plasma membrane, many cytosolic signalling proteins possess a distinct lipid binding domain as part of their overall fold. Here, a multiscale simulation approach has been used to investigate three membrane-binding proteins involved in cellular processes such as growth and proliferation. The pleckstrin homology (PH) domain from the general receptor for phosphoinositides 1 (GRP1-PH) binds phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PI(3,4,5)P₃) with high affinity and specificity. To investigate how this peripheral protein is able to locate its target lipid in the complex membrane environment, Brownian dynamics (BD) simulations were employed to explore association pathways for GRP1-PH binding to PI(3,4,5)P₃ embedded in membranes with different surface charge densities and distributions. The results indicated that non-PI(3,4,5)P₃ lipids can act as decoys to disrupt PI(3,4,5)P₃ binding, but that at approximately physiological anionic lipid concentrations steering towards PI(3,4,5)P₃ is actually enhanced. Atomistic molecular dynamics (MD) simulations revealed substantial membrane penetration of membrane-bound GRP1-PH, evident when non-equilibrium, steered MD simulations were used to forcibly dissociate the protein from the membrane surface. Atomistic and coarse grained (CG) MD simulations of the phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten (PTEN) tumour suppressor, which also binds PI(3,4,5)P₃, detected numerous non-specific protein-lipid contacts and anionic lipid clustering around PTEN that can be modulated by selective in silico mutagenesis. These results suggested a dual recognition model of membrane binding, with non-specific membrane interactions complementing the protein-ligand interaction. Molecular docking and MD simulations were used to characterise the lipid binding properties of kindlin-1 PH. Simulations demonstrated that a dynamic salt bridge was responsible for controlling the accessibility of the binding site. Electrostatics calculations applied to a variety of PH domains suggested that their molecular dipole moments are typically aligned with their ligand binding sites, which has implications for steering and ligand electrostatic funnelling.

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Les membres de la famille des 5-phosphatases d’inositols polyphosphates et de phosphoinositides sont des enzymes caractérisées par la présence de deux domaines catalytiques conservés qui hydrolysent un phosphate en position 5 sur un noyau inositol. SKIP (Skeletal Muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase), également appelée Pps (Putative PI 5-phosphatase) est un des derniers membres de la famille des 5-phosphatases à avoir été découvert à ce jour. Cette enzyme hydrolyse majoritairement le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) et le phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3). Les phosphoinositides (PtdIns) représentent environ 10% des lipides membranaires et sont impliqués dans de nombreuses cascades de signalisation cellulaire conduisant, entre autres, à la prolifération, l’apoptose, la différenciation, la sécrétion, le trafic vésiculaire et la mobilité cellulaire.<p>Des études de surexpression de SKIP en cellules tendent à montrer que cette protéine pourrait jouer un rôle de régulateur négatif dans la formation du cytosquelette d’actine et/ou dans la voie de signalisation de l’insuline. <p><p>Afin d’étudier in vivo la fonction de la protéine SKIP chez la souris, nous avons décidé de générer des souris transgéniques surexprimant cette protéine de manière conditionnelle. Dans ce but, nous avons infecté des embryons murins par des lentivirus porteurs d’un transgène SKIP et avons obtenu, après réimplantation des embryons infectés dans des femelles pseudogestantes, deux lignées de souris transgéniques. Celles-ci ont ensuite été croisées avec des souris exprimant la recombinase Cre de manière ubiquitaire afin de pouvoir activer la transcription de SKIP dans l’ensemble des organes. Des expériences de Western blot, de dosage d’activité 5-phosphatase ainsi que des PCR en temps réel sont venus confirmer la présence de la protéine transgénique et de son activité catalytique.<p>L’ensemble des expériences qui ont été menées du point de vue phénotypique tend à montrer que dans notre modèle, la surexpression de SKIP ne provoque aucune anomalie évidente du point de vue anatomique, glycémique ou immunologique. Toutefois, des expériences concernant la physiologie rénale ont été réalisées sur base des résultats d’immunohistochimie et nous ont permis de détecter une anomalie dans les mécanismes de réabsorption d’eau ainsi que dans l’expression et la phosphorylation des canaux hydriques AQP2.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

The control of phosphatidylinositol 3, 4, 5-trisphosphate [PtdIns(3,4,5)P3] level depends on the activities of both PI kinase and PtdIns(3,4,5)P3 phosphatases: 5-phosphatase like SHIP1 and SHIP2, and 3-phosphatase like PTEN. The ubiquitous SH2 domain containing inositol 5-phosphatase SHIP2 contains both a series of protein interacting domains and the ability to dephosphorylate PtdIns(3,4,5)P3. Previous reports obtained in SHIP2 deficient mice have shown that SHIP2 is involved in the control of insulin sensitivity and reducing weight gain on fatty diet. <p><p>Since SHIP2 is a lipid phosphatase as well as a docking protein, the initial aim that emerged in the lab was to measure the inositol lipid levels in SHIP2 +/+ and deficient cells and compare the levels of 3-phosphoinositides PtdIns(3,4,5)P3 and PtdIns(3,4)P2. At first, we developed mouse embryonic fibroblasts (MEF) as a cellular model. Amongst various stimuli tested, surprisingly, only serum showed an obvious difference in terms of PtdIns(3,4,5)P3 level. This lipid was significantly up regulated in SHIP2 -/- cells but only after short-term (i.e. 5-10 min) incubation with serum. The difference in PtdIns(3,4,5)P3 levels in heterozygous fibroblast cells was intermediate between the +/+ and -/- cells. Serum stimulated PI3K activity appeared to be comparable between +/+ and -/- cells. Moreover, PKB, but not MAP kinase activity, was also potentiated in SHIP2 deficient cells stimulated by serum. The up regulation of PKB activity in serum stimulated cells was totally reversed in the presence of the PI3K inhibitor LY-294002, in both +/+ and -/- cells.<p><p>Reactive oxygen species (ROS) have emerged as physiological mediators of many cellular responses. H2O2 mimics some effects of insulin in a number of cell culture systems. It also inactivates tyrosine phosphatase activities including PTEN. In addition, in Swiss 3T3 fibroblasts, Gray et al reported that exposure of the cells to H2O2 resulted a huge increase in PtdIns(3,4)P2 level. The authors suspected that the effect was attributed to a inositol 5-phosphatase activity. We thus exposed our cells to H2O2 in order to address the question of the role of SHIP2 in response to oxidative stress.<p><p>We worked on the same SHIP2 MEF model, stimulated by H2O2: at 15 min, PtdIns(3,4,5)P3 was markedly increased in SHIP2 -/- cells as compared to +/+ cells. In contrast, no significant increase in PtdIns(3,4)P2 could be detected at 15 or 120 min incubation of the cells with H2O2 (0.6 mM). PKB activity was upregulated in SHIP2 -/- cells in response to H2O2 and therefore follows the regulation of PtdIns(3,4,5)P3. As for serum, the PI3K activity appeared to be comparable between +/+ and -/- cells. The levels of PTEN and type I 4-phosphatase [an enzyme that acts on PtdIns(3,4)P2] remained unchanged between the two types of cells. SHIP2 add back experiments in SHIP2 -/- cells confirm its critical role in the control of PtdIns(3,4,5)P3 level in response to H2O2: the decrease in PtdIns(3,4,5)P3, observed in SHIP2 expressing cells, was no longer seen in cells infected with a catalytic mutant of this enzyme. <p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Cette thèse vise à démontrer l’importance de la PI 3-kinase dans la régulation hormonale de la réabsorption rénale du sodium. Ce contrôle extrêmement précis, notamment par l’aldostérone, s’effectue au niveau du néphron distal. Nous avons utilisé comme modèle l’épithélium de cellules A6, dérivées du tubule distal de Xenopus Laevis. Le transport unidirectionnel de sodium s’effectue en deux étapes: depuis, l’entrée à partir du milieu luminal par des canaux sodiques épithéliaux (ENaCs) insérés dans la membrane apicale, jusqu’à la sortie vers le liquide extracellulaire par des pompes Na+/K+-ATPases, situées dans la membrane basolatérale. L’insuline augmente ce transport de sodium et la PI 3-kinase semble assurer un rôle-clef.<p>Nous avons étudié l’importance de chacun des 3-phosphoinositides produits par la PI 3-kinase, sur le transport du sodium en ajoutant au milieu cellulaire des formes «perméantes» de ces phospholipides. Parmi ceux-ci, le PIP3 et dans une moindre intensité le PI(3,4)P2 augmentent ce transport. En revanche, le PI3P, le PI(3,5)P2, ainsi que le PI(4,5)P2 n’ont pas d’effet sur lui. Nous avons démontré par la technique du Western blot que la 3-phosphatase PTEN est exprimée dans les cellules A6. Cette phosphatase déphosphoryle le PIP3 en PI(4,5)P2. Nous avons surexprimé PTEN dans les cellules A6. Ceci réduit l’augmentation du transport du sodium induite par l’insuline, ainsi que celle induite par addition de la forme «perméante» de PIP3. <p>Nous avons ensuite vérifié si d’autres agents qui activent la PI 3-kinase, stimulent également le transport de sodium à travers cet épithélium. A cette fin, nous avons d’abord vérifié que l’EGF et le peroxyde d’hydrogène, connus pour stimuler la PI 3-kinase dans d’autres systèmes, activent également cette enzyme dans les cellules A6. Tous deux augmentent ce transport. L’importance de l’augmentation induite par H2O2 est comparable à celle de l’insuline, tandis que l’effet de l’EGF est plus transitoire. Un dosage d’activité de la PI 3-kinase, nous a permis de démontrer que l’intensité de l’activation de la PI 3-kinase est corrélée avec l’amplitude de l’augmentation du transport du sodium. Par comparaison avec l’effet de l’insuline et de l’H2O2, l’EGF augmente faiblement l’activité de la PI 3-kinase et induit une faible augmentation du transport. <p>Nous avons également examiné si la voie des MAPK influence la stimulation du transport du sodium par ces différents agents. Cette voie ne semble pas impliquée dans l’effet de l’insuline ou du peroxyde d’hydrogène. Par contre, elle diminue la stimulation du transport de sodium par l’EGF. L’effet de l’EGF sur le transport semble résulter d’un compromis entre l’activation de la voie de la PI 3-kinase qui l’augmente et l’activation de la voie des MAPK qui le diminue.<p>En conclusion, une augmentation de PIP3, soit par addition de PIP3 exogène, soit par augmentation endogène sous l’effet de l’insuline ou d’autres agents stimulant la PI 3-kinase, augmente le transport du sodium tandis qu’une diminution de PIP3 endogène (par surexpression de PTEN) le diminue. L’importance de l’activation de la PI 3-kinase est quantitativement corrélée avec l’importance de l’augmentation du transport du sodium. La PI 3-kinase est donc un médiateur-clef de la régulation rénale de ce transport.<p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Gain-of-function mutations in the KIT receptor tyrosine kinase have been associated with highly malignant human neoplasms. In particular, an acquired somatic mutation at codon 816 in the second catalytic domain of KIT involving an aspartic acid to valine substitution is found in patients with systemic mastocytosis (SM) and acute myeloid leukemia (AML). The presence of this mutation in SM and AML is associated with poor prognosis and overall survival. This mutation changes the conformation of the KIT receptor resulting in altered substrate recognition and constitutive tyrosine autophosphorylation leading to constitutive ligand independent growth. As there are currently no efficacious therapeutic agents against this mutation, this study sought to define novel therapeutic targets that contribute to aberrant signaling downstream from KITD816V that promote transformation of primary hematopoietic stem/progenitor cells in diseases such as AML and SM. This study shows that oncogenic KITD814V (murine homolog) induced myeloproliferative neoplasms (MPN) occurs in the absence of ligand stimulation, and that intracellular tyrosines are important for KITD814V-induced MPN. Among the seven intracellular tyrosines examined, tyrosine 719 alone has a unique role in regulating KITD814V-induced proliferation and survival. Residue tyrosine 719 is vital for activation of the regulatory subunit of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), p85α, downstream from KITD814V. Downstream effectors of the PI3K signaling pathway, in of leukemic cells bearing KITD814V with an allosteric inhibitor of Pak or its genetic inactivation results in growth repression due to enhanced apoptosis. To assess the role of Rac GEFs in KITD814V induced transformation, EHop-016, an inhibitor of Rac, was used to specifically target Vav1, and found to be a potent inhibitor of human and murine leukemic cell growth. In vivo, the inhibition of Vav or Rac or Pak delayed the onset of MPN and rescued the associated pathology in mice. These studies provide insight on mechanisms and potential novel therapeutic targets for hematological malignancies harboring an oncogenic KIT mutation.