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Die Interleukin 1β (IL-1β) vermittelte Signaltransduktion ist für die akute Entzündung von entscheidender Bedeutung, muss aber gleichzeitig streng reguliert werden. Wie setzt das intrazelluläre IL-1β-Signalnetzwerk den extrazellulären Nachweis von IL-1β effizient in eine präzise und angemessene zelluläre Reaktion um? Welche Kontrollmechanismen kommen zum Einsatz, um eine angemessene Antwort zu gewährleisten und eine Hypo- oder Hyperantwort zu verhindern? Diese Arbeit charakterisiert die IL-1β-vermittelte Signalwegdynamik in EL4-Zellen mithilfe der Immunpräzipitations-Massenspektrometrie (IP-MS), konkret von MyD88, IRAK4 und IRAK1. Statistischer Analysen identifizierten das Interaktom dieser Proteine nach 15-, 30- und 60-minütiger IL-1β-Stimulation, sowie Proteine, die potenziell an der Runterregulierung des IL-1β-Signalwegs beteiligt sind. Um zu verstehen, wie das IL-1β-Signalwegnetzwerk die Translationsmaschinerie in EL4 Zellen beeinflusst, um eine angemessene Reaktion zu gewährleisten, untersuchte ich den IL-1β-abhängigen Proteinumsatz mittels gepulste stabile Isotopenmarkierung durch Aminosäuren in der Zellkultur (pSILAC) in Kombination mit Azidohomoalanin (AHA)- Klickchemie und MS nach IL-1β-Stimulation. Das Ergebnis aller Proteomik-Untersuchungen war die Identifizierung des TNFα-induzierten Proteins 3 (Tnfaip3) interagierendes Protein 1 (TNIP1) als potenziellen Kandidaten für die Herunterregulierung des IL-1β-Signalwegs. Nach IL-1β-Stimulation kolokalisiert TNIP1 mit allen Myddosomen-Proteinen sowie mit der Deubiquitinase Tnfaip3. Mittels CRISPR/Cas9 erzeugte ich eine TNIP1-KO-EL4 Zelllinie. Nach IL-1β Stimulation zeigten TNIP1-KO-Zellen vermehrt phosphoryliertes p65, aber verringertes phosphoryliertes JNK sowie eine langfristig verringerte IL-2-Sekretion. Daher ist TNIP1 nicht nur an der Herunterregulierung des NF-κB-Signalwegs beteiligt, sondern aktiviert auch den MAPK-Signalweg. / Interleukin 1β (IL-1β)-mediated signal transduction is crucial for acute inflammation, but at the same time needs tight regulation. The IL-1β-mediated signal transduction is encoded by the spatial and temporal dynamics of downstream signaling networks. How does the intracellular IL-1β signaling network efficiently convert the extracellular detection of IL-1β into a precise and proportionate cellular response? What control mechanisms apply in order to ensure a proportionate response and pre- vent a hypo- or hyper response? This study characterizes the IL-1β mediated signaling dynamics using immunoprecipitation purification mass spectrometry (IP-MS). specifically, of MyD88, IRAK4, and IRAK1. Statistical analyses identified the interactome of these proteins after 15-, 30-, and 60-minute of IL-1β stimulation, as well as proteins potentially involved in IL-1β signaling downregulation using pathway annotation analysis. Further, in order to understand how the IL-1β signaling network affects the translational machinery in EL4 cells to ensure a proportionate response, , I investigated IL-1β-dependent protein turnover in EL4 cells. Specifically, I applied pulsed stable isotope labeling by amino acids in the culture (pSILAC) combined with azidohomoalanine (AHA)-click chemistry and MS after 30-, 60-, 120- and 240-min of IL-1β stimulation. The result of these proteomics approaches was the identification of TNFα induced protein 3 (Tnfaip3) interacting protein 1 (TNIP1) as a potential candidate in IL-1β signal downregulation. TNIP1 co-localizes with all myddosome proteins and the deubiquitinase Tnfaip3 after IL-1β stimulation. I generated a TNIP1 KO EL4 cell line using CRISPR/Cas9. After IL-1β stimulation, TNIP1 KO cells show increased levels of phosphorylated p65, but decreased levels of phosphorylated JNK as well as decreased levels of long-term IL-2 secretion. Therefore, TNIP1 is not only involved in downregulatory NF-κB signaling but activates MAPK pathway.

Die Entstehung und Progression maligner Tumoren ist ein mehrstufiger Prozeß, der auf einer Vielzahl genetischer Alterationen beruht. Essentielle Schritte sind die Aktivierung von Proto-Onkogenen und die Inaktivierung von Tumor-Suppressorgenen. Infolge dessen können die Zellen unabhängig von externen Wachstumssignalen ungebremst proliferieren, die Apoptose wird gehemmt, die Angiogenese wird aktiviert, und es kommt schließlich zur Metastasierung. Zu den bekanntesten Proto-Onkogenen, die in humanen Tumoren aktiviert werden, gehören die RAS Gene. Sie sind in einer Vielzahl von Tumoren mutiert und führen zu einer Stimulation der Proliferation. Um den Einfluß aktivierter RAS Onkogene auf die Regulation der Genexpression zu untersuchen wurden Genexpressionsprofile in Zellkultur-Modellen und humanen Tumoren erstellt. In einem Fibroblasten- und einem Epithelzell-basierten System konnten mehrere hundert, RAS-abhängig differenziell exprimierte Genen identifiziert werden. Aufgrund der bekannten Funktionen ihrer Genprodukte spielen sie eine wichtige Rolle im Verlust der Zellzyklus-Kontrolle, der Kontrolle der Signalübertragung, in der Angiogenese-Induktion sowie in der Invasion und damit Metastasierung. Die Zusammenhänge zwischen der Aktivierung bestimmter Signalkaskaden wie z.B. Raf-Mek-Erk oder PI-3K und der Expression von definierten Genmustern wurden hergestellt. Weiterhin konnte mit Hilfe von Microarray Analysen eine Vielzahl potentieller Tumormarker und Zielgene für therapeutische Intervention im Ovarialkarzinom identifiziert werden. Die Rolle der KlasseII Tumorsuppressor Gene Caveolin-1 und H-REV107-1 in humanen Ovarialkarzinomen wurde detailliert untersucht und ihre Rolle in der Regulation des Zellüberlebens nachgewiesen. Caveolin-1, ein negativer Regulator der RAS-abhängigen Signalübertragung, wird in über 80% der untersuchten humanen Ovarialkarzinome gehemmt. Hierbei spielen epigenetische Mechanismen eine Rolle, die jedoch nicht Caveolin-1 selbst, sondern einen unbekannten Regulator des Caveolin-1 Gens betreffen. Das H-REV107-1 Gen, ein Wachstumsregulator mit unbekannter Funktion wird in ca. 50% der untersuchten Ovarialkarzinome nicht mehr exprimiert. Ähnlich wie bei Caveolin-1, führt eine gezielte Expression des Gens in Tumorzellen zur Apoptose. Die Suche nach Interaktionspartnern des H-REV107-1 Gens führte zur Identifizierung der ubiquitär exprimierten Phosphatase2A (PP2A). Die Bindung zwischen H-REV107-1 und PP2A wurde weiter charakterisiert und ihre Rolle in der H-REV107-1 vermittelten Apoptose analysiert. / Development and progression of human tumours is a multistep process depending on numerous genetic alterations. Essentiell steps herein are the mutational activation of oncogenes and the inactivation of tumour suppressor genes. As a result of these alterations, the cells acquire the potential of unlimited growth independent of external growth factor signals, apoptosis is diminished, angiogenesis is stimulated and finally metastasis can occur. Among the best known proto-oncogenes, mutated in a number of human tumours, are the RAS genes. To investigate the role of RAS oncogenes in transformation-related transcriptional alterations, expressionsprofiling was performed from cell culture models and human tumours. Several hundred genes were identified to be de-regulated in a RAS-dependent manner in a fibroblast and an epithelial cell-based model. The protein products encoded by these genes play important roles in the loss of cell cycle control, control of signal transduction, angiogenesis induction as well as invasion and metastasis. Groups of de-regulated genes could be assigned to distinct signaling pathways such as the Raf-Mek-Erk or the PI-3 kinase dependent pathways. In addition, a number of potential tumour markers and potential target structures for therapeutic intervention were identified in ovarian carcinomas with the help of microarray studies. The role of the class II tumor suppressor genes Caveolin-1 and H-REV107-1 in human ovarian carcinomas was further investigated and their role in the regulation of cell survival was demonstrated. Caveolin-1, a negative regulator of RAS-dependent signal transduction, is supressed in more than 80% of the ovarian carcinomas analysed. This suppression is mediated by epigenetic mechanisms which due not target Caveolin-1 itself but an unknown regulator of the Caveolin-1 gene. The H-Rev107-1 gene, a growth regulator with unknown function, is no longer expressed in nearly 50% of the ovarian carcinomas analysed. Similar to Caveolin-1, also re-expression of H-REV107-1 results in apoptosis in the tumour cells. The search for proteins interacting with H-REV107-1 led to the identification of the ubiquitously expressed phosphatase 2A (PP2A). The interaction between H-REV107-1 and PP2A was further characterised and its role in the H-REV107-1 mediated apoptosis investigated.

Das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme werden unter anderem vom Hypothalamus reguliert. Dort werden Hormonelle Signale der Peripherie und neuronale Signale integriert. Die G-Protein gekoppelten Melanocortinrezeptoren 3 und 4 (MC3R und MC4R) werden von ihren Agonisten, den Melanocortinen aktiviert und durch den inversen Agonisten/Antagonisten Agouti-Related Peptide (AgRP) inaktiviert. Als weiterer Downstream-Mediatoren der MC4R-Aktivierung wurden kürzlich Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) und dessen Rezeptor TrkB (Tropomyosin-Related –Kinase) identifiziert. Mutationen im MC4R gelten als häufigste monogenetische Ursache für Adipositas. Da viele dieser Mutationen aber in vitro funktionell nicht relevant sind, wurde ein Amosäurevergleich von orthologen MC4R aus 70 verschiedenen Spezies erstellt. Funktionsverlustmutationen waren häufiger an koservierten Positionen, während Mutationen ohne Effekt überwiegend an schwach konservierten Positionen zu finden waren. Funktionelle Charakterisierung der von in Mausmodellen identifizierten Punktmutationen I194F und Y302C ergaben eine gute in-vivo/in-vitro Korrelation. Desweiteren wurden in der Normalbevölkerung in normalgewichtigen Personen identifizierte MC4R-Punktmutationen funktionell charakterisiert. Die Mutationen R7C, A70T, T112K, Q156R, M200V, V166I und R236H hatten keinen Effekt auf die Rezeptorfunktion, die H158R. Mutation zeigte eine hohe Basalaktivität, die aber durch AgRP erniedrigt werden konnte. Die in adipösen Patienten gefundenen Mutationen S136F und S139R wiesen einen kompletten Funktionsverlust auf, erstere verursachte zudem sogar einen dominant-negativen Effekt bei Koexpression mit dem Wildtyprezeptor. Für den MC3R wurde das zum Translationsstart bevorzugte Startcodon identifiziert. Für die Rezeptortyrosinkinase TrkB konnte in Hefe-2-Hybridscreens der neue Interaktionspartner Sept3 identifiziert werden. Dieses Protein bindet phosphorylierungsunabhängig an die intrazelluläre Juxtamembrandomäne. / Bodyweight and food intake are regulated by the hypothalamus which integrates peripheral hormonal and neural signals. The G-protein-coupled melanocortin-receptors 3 and 4 (MC3R and MC4R) are activated by melanocortins or inhibited by agouti-related pepetide (AgRP) and signal via the cAMP pathway. Brain-derived neurotrophic Factor (BDNF) was recently shown to signal downstream the MC4R via its receptor TrkB (tropomyosin-related kinase). Mutations in the MC4R are the most common cause of monogenetic obesity. However, many of these mutations are not functionally relevant in vitro. Here, an amino acid alignment of orthologous MC4R from over 70 species was used to evaluate reported mutations. Loss-of-function mutations were predominantly located at highly conserved positions whereas mutations without effect were located at non-conserved positions. Functional characterization of MC4R point mutations I194F (partial loss of function) and Y302C (complete loss of function) identified in mouse models showed good in vitro/in vivo correlation. Furthermore mutations found in normal weight persons were characterized: R7C, A70T, T112K, Q156K, M200V, V166I and R236H had no effect on receptor function in vitro, whereas the H158R Mutation showed high constitutive activity, which however could be diminished by AgRP. The mutations S136F and S139F identified in obese patients were characterized as complete loss-of-function mutations, the former additionally caused a dominant-negative effect on wildtype MC4R in vitro. For the MC3R the preferred start-codon for initiation of translation was identified. For TrkB Sept3 could be identified as a new interaction partner in a yeast-2-hybrid screen. This Protein belonging to the septin family binds to the intracellular juxtamembrane domain of TrkB independent of phosphorylation of the Shc-binding site.

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