Although cell membranes normally resist the hydrolysis of secretory phospholipase A2, a series of current investigations demonstrated that the changes in lipid order caused by increased calcium has a relationship with the susceptibility to phospholipase A2. To further explore this relationship, we setup ordinary differential equations models, statistic models and stochastic models to compare the response of human erythrocytes to the hydrolyzing action of secretory phospholipase A2 and the relationship between the susceptibility of hydrolysis and the physical properties of secretory phospholipase A2. Furthermore, we use models to determine the ability of calcium ionophore to increased membrane susceptibility.

L’arthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune systémique affectant près de 1% de la population mondiale. L’inflammation articulaire est caractérisée par une infiltration leucocytaire majoritaire de neutrophiles, la formation d’un pannus et la destruction du cartilage et de l’os. De nombreux acteurs cellulaires et moléculaires dont les plaquettes et leurs microparticules (MPs) ainsi que la phospholipase A2 sécrétée de type IIA (sPLA2-IIA) contribuent à cette pathologie. Récemment, nous avons mis en évidence que les plaquettes activées libèrent certes des MPs mais aussi des mitochondries libres que nous avons appelées freeMitos. Les MPs et les freeMitos sont détectées dans les fluides synoviaux de patients arthritiques. Au cours de nos recherches, nos résultats indiquent que la sPLA2-IIA hydrolyse les phospholipides membranaires des MPs et des freeMitos. Elle libère des lysophospholipides et des acides gras, dont l’acide arachidonique (AA). L’ADN mitochondrial est aussi relâché à la suite de l’hydrolyse des freeMitos par la sPLA2-IIA. Ces différents produits induisent la libération de leucotriènes et de cytokines pro-inflammatoires ainsi que la formation de neutrophil extracellular trap (NET) par les neutrophiles. La sPLA2-IIA cible aussi les MPs qui sont riches en enzymes du métabolisme de l’acide arachidonique (AA). Cet AA est majoritairement métabolisé en 12-Hydroxyeicosatetraenoic acide (12-HETE) par la 12-lipoxygénase (12-LO) des MPs. Le 12(S)-HETE issue de l’action concertée de la sPLA2-IIA et la 12-LO, induit l’internalisation des MPs par les neutrophiles in vitro et in vivo. Les MPs transfèrent leur cargaison en facteurs de transcription, en acides nucléiques et en mitochondries aux neutrophiles. Les MPs modulent le transcriptome et les fonctions du neutrophile. Les MPs et les produits d’hydrolyse par la sPLA2-IIA induisent une augmentation de la génération de leucotriènes, la formation de NETs et une résistance à l’apoptose. Ces deux enzymes sont aussi impliqués dans la sévérité de l’arthrite inflammatoire murine. En somme, nos études apportent une meilleure connaissance sur le contenu des MPs de plaquette. Un mécanisme finement régulé, d’internalisation des MPs par les neutrophiles, a été mis en évidence. / Rheumatoid arthritis is a systemic autoimmune disease affecting 1% of the world population. This pathology is characterized by a symmetric articular achievement where takes place a synovial hyperplasia accompanied with an infiltration of leukocytes, mainly neutrophils, and a destruction of cartilage and bone. Several cellular and molecular actors including platelets, platelet microparticles (MPs) and the secreted phospholipase A2 group IIA (sPLA2-IIA) contribute to this pathology. Recently, we highlighted that activated platelets produce also extracellular mitochondria (freeMitos) which we detected in the synovial fluids from arthritic patients. In our research, our results indicate that sPLA2-IIA hydrolyzes membrane phosopholipids of freeMitos and MPs, releasing lysophospholipids and arachidonic acid (AA). Mitochondrial DNA is also liberated after sPLA2-IIA hydrolysis. These products induce leukotrienes production, proinflammatory cytokine release and neutrophil extracellular trap (NET) formation by neutrophils. sPLA2-IIA also targets MPs that contain enzyme involved in AA metabolism. AA is mainly metabolized in 12-Hydroxyeicosatetraenoic acid (12-HETE) by 12-lipoxygenase (12-LO) from MPs. It induces MP internalization in the human and murin neutrophils. MPs transfer their elaborated cargo, rich in transcription factors, nucleic acids and mitochondria, to neutrophils. MPs modulate transcriptome and functions of neutrophils. MPs and the products of hydrolysis by sPLA2-IIA, induce increase of leukotrienes production, NET release and apoptosis resistance. 12-LO and sPLA2-IIA are involved in inflammatory murine arthritis severity. Our work brings a better knowledge on the content of the platelet MPs. It highlights a tightly regulated mechanism implicated in MP internalization in neutrophils.

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L'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est constitué d'une monocouche de cellules tapissant le fond de l'oeil et est localisée de façon apicale par rapport à la rétine neurale. Outre ses fonctions au niveau du cycle visuel, PEPR permet aussi la phagocytose des segments externes des bâtonnets (SEB) et la production de phagosomes. L'EPR digère ces phagosomes à l'aide d'enzymes telles les phospholipases A₂ (PLA₂) et recycle certaines de ses composantes tels les acides gras polyinsaturés (AGPI). Fait notable, plus de 60% des acides gras des phospholipides des SEB sont polyinsaturés. Ces membranes sont donc très susceptibles à l'oxydation. Il a déjà été démontré dans notre laboratoire que PEPR exprime une PLA₂ gamma cytosolique (cPLA₂ gamma). La spécificité et l'activité constitutive de cette PLA₂ suggèrent qu'elle pourrait participer au recyclage des AGPI. Les objectifs poursuivis dans cette partie de la thèse étaient de surexprimer, de purifier la cPLA₂ gamma et de caractériser ses propriétés enzymatiques et de liaison avec des modèles membranaires. Au niveau des interactions membranaires, nous avons d'une part démontré que la cPLA2-gamma recombinante était active, hydrolysant le L-DPPC en monocouche ainsi que le PAPC en vésicules (résultats non-montrés). Il s'agit selon nous de la première fois où une cPLA2-gamma recombinante issue d'un système prokaryote, dépourvue des modifications postraductionnelles associées à celle produite à partir du système eukaryote, notamment la farnésylation de son extrémité C-terminale et de nombreux sites potentiels de palmitoylation et d'un site de myristoylation (Tucker et al., 2005), était démontrée active. La vision chez les vertébrés commence avec l'absorption de lumière par les pigments visuels dans les cellules des photorécepteurs. Les pigments visuels, ou opsines, sont des récepteurs à sept hélices transmembranaires couplés aux protéines G localisés dans la membrane des disques des segments externes des bâtonnets et des cônes. Dans l'obscurité, le chromophore sensible à la lumière, le 11 cis retinal, est lié de manière covalente à l'opsine via un lien de base de Schiff à un résidu de lysine spécifique localisé au centre de la septième hélice alpha transmembranaire. La stimulation lumineuse a pour résultat Pisomérisation du 11-cis rétinal en tout-trans rétinal, ce qui cause un changement dans la conformation de la rhodopsine. La métarhodopsine II photoactivée résultante réagit avec la protéine G, appelée transducine, et déclenche la cascade de phototransduction qui mène à u l'hyperpolarisation des photorécepteurs et, finalement, à l'inhibition du relargage de neurotransmetteur au niveau de la terminaison synaptique. Après isomérisation du 11-cis-rétinal à la configuration tout-trans, la base de Schiff est hydrolysée et le chromophore photolyse se détache de l'opsine. Le tout-trans rétinal est alors réduit en tout-trans rétinol par une rétinol dehydrogenase (RDH) localisée dans la membrane discale des segments externes des photorécepteurs (Blaner et al, 1980; Nicotra et Livrea, 1982; Ishiguro et al, 1991; Palczewski et al, 1994). Les enzymes spécifiques responsables de cette réaction sont la RDH8 et la RDH 12 (Molday et al., 2009; Rattner et al., 2000; Maeda et al., 2006, Maeda et al. 2009). Six RDHs distinctes exprimées dans les photorécepteurs ont été récemment clonées. Leurs fonctions, in vivo, demeurent inconnues, mais elles ont toutes démontré leur capacité à réduire le tout-trans rétinal in vitro (Kasus-Jacobi et al. 2006). Plusieurs évidences suggèrent que cette réduction du tout-trans rétinal dans les cellules des photorécepteurs est cruciale pour le maintien du caractère fonctionnel et de l'intégrité structurale de la rétine. Cette réaction est la première étape d'une voie métabolique appelée le cycle visuel, lequel est essentiel pour une phototransduction soutenue. Cette voie intervient au niveau des photorécepteurs et de l'épithélium de pigment rétinien (EPR) et permet de recycler le tout-trans rétinal en 11-cis rétinal. Quand le tout-trans rétinol issu de la réduction du tout-trans rétinal est produit dans les photorécepteurs, il est transporté dans PEPR où il est estérifié par la lécithine rétinol acyl transferase (LRAT) et est emmagasiné sous forme de tout-trans rétinyl ester. Le tout-trans-rétinol peut aussi être acheminé à PEPR par la vascularisation choroïdienne, entrant dans PEPR via un processus récepteur-dépendant impliquant un complexe de protéine/transthyretin - protéine sérique liant le rétinol (SRBP) (Malpeli et al., 1996). Les rétinyl esters emmagasinés dans PEPR constituent le substrat pour Pisomérohydrolase (IMH), aussi appelée RPE65, une enzyme dont le rôle proposé serait de catalyser l'hydrolyse concertée du tout-trans rétinyl ester et l'isomérisation en 11-cis rétinol. L'oxydation du 11 cis-rétinol en 11-cis rétinal par la 11 cis rétinol dehydrogenase (RDH5) et/ou la RDH11 dans PEPR complète le cycle visuel. Le 11-cis rétinal est ensuite réacheminé vers les photorécepteurs où il se combine avec l'opsine pour régénérer la rhodopsine photosensible. La première étape du cycle visuel est importante parce qu'elle produit du tout-trans rétinol, utilisé pour approvisionner PEPR en Ill rétinyl ester. U ne s'agit cependant pas de Punique source de tout-trans-rétinol puisque celui en circulation dans l'organisme peut également être utilisé de façon alternative. À ce jour, on connaît encore peu de choses sur ces enzymes. Il est connu que des mutations de la RDH5 sont associées avec la maladie récessive rare fundus albipunctatus, alors que des mutations de la RDH 12 causent l'amaurose congénitale de Leber. Cependant le rôle physiologique exact de plusieurs autres isozymes de la RDH et de leur implication possible dans des pathologies de l'oeil demeurent toujours inconnus jusqu'à maintenant. L'objectif de ces travaux consistait à surexprimer et purifier la RDH 11 et une forme tronquée (N-delRDHll) pour ensuite mesurer ses interactions membranaires et, finalement, déterminer sa structure tridimensionnelle. Lors de cette étude, nous avons obtenu deux versions de la RDH-11, soit une version complète comportant les 318 acides aminés, ainsi qu'une version tronquée comportant une deletion des 26 premiers acides aminés en N-terminal que l'on appelera N-delRDHll tout au long de cette thèse. La version N-delRDHl 1 fut produite par génie moléculaire en raison du très faible niveau d'expression et de solubilité de la version complète de la RDH-11. Les meilleurs essais de purification ont produit une N-delRDHll d'une pureté supérieure à 95% et d'une concentration d'environ 1 mg/ml, ce qui nous a permis de tenter la cristallogénèse de cette protéine, malheureusement sans succès. Nous avons de plus démontré que la N-delRDH 11 surexprimée dans un système prokaryote était active, convertissant rapidement le tout-trans rétinal en rétinol. Or, il s'agit à notre connaissance de la première fois qu'une activité était démontrée pour une protéine issue d'un tel système d'expression. Les mesures effectuées en pression de surface ont permis d'établir comment la présence du segment N-terminal, sans être le seul élément nécessaire à la liaison membranaire, venait néanmoins accélérer grandement la cinétique de mobilisation de la protéine du coeur de phase jusqu'à l'interface. Cependant, ce segment N-terminal n'aurait pas d'effet significatif sur la pression d'insertion maximale (PIM) sous une monocouche de DOPE. Par ailleurs, les mesures de PIM avec les lipides comportant deux chaînes grasses 18:1 nous ont également permis de constater des différences significatives entre les différentes têtes polaires des phospholipides testés. / Les PIM les plus élevées ont été obtenues avec le DOPE (~ 44 mN/m) et les plus faibles avec le DOPC (~ 25 mN/m). Quant aux mesures faites en spectroscopic PM-IRRAS, nous avons d'une part confirmé que la N-delRDHll ainsi que la RDH 11 ont une structure secondaire à l'interface air-eau composée d'une proportion importante d'hélices-a, en accord avec les données que nous avions obtenues en solution par dichroïsme circulaire et spectroscopie infrarouge. Le maintien de la structure secondaire de la N-delRDHll à l'interface air-eau démontre également que l'intégrité de la protéine est préservée dans cet environnement. Ces mesures en PM-IRRAS ont de plus révélé un possible changement conformationnel de la N-delRDHll suite à la liaison de son substrat, le tout-trans rétinal, en plus de démontrer que la composition lipidique de la monocouche pouvait avoir un effet direct sur la stabilisation des hélices-a de la protéine.

A Apis mellifera é um inseto pertencente à ordem Himenóptera, família Apidae, possui ocorrência cosmopolita e grande importância ecológica, econômica e médica. As subespécies hibridas que ocorrem no Brasil possuem características predominantemente africanas e passaram a ser conhecidas como abelhas africanizadas. As principais características das abelhas africanizadas são o comportamento agressivo, boa resistência a doenças, alta produção de mel e o aumento da frequência de enxameamentos, que tem causado preocupação por estar acompanhado, de aumento no número de acidentes. A agressividade e o aumento da frequência do exameamento fazem com que elas estejam repetidamente envolvidas em ataques massivos a humanos e animais, tornando esse tipo de envenenamento um problema de saúde pública. A busca de tratamento para o envenenamento tem sido alvo de diversas pesquisas. De uma forma geral, os tratamentos atuam sobre os efeitos causados pelo veneno (medicamentos) ou sobre os componentes do veneno (soros e inibidores). Os principais componentes do veneno são a fosfolipase A2 (PLA2) e a melitina. A PLA2 é uma das principais proteínas do veneno, que degrada a membrana plasmática das células e tem o seu efeito potencializado pela presença da melitina. A PLA2 da Apis mellifera possui a estrutura protéica determinada e sítio ativo identificado. Essas características qualificam a PLA2 como potencial alvo de estudos de planejamento de fármacos. A estratégia de planejamento de fármacos tem como objetivo acelerar o processo de identificação de ligantes, contribuindo para o processo da descoberta de fármacos. Este trabalho teve como objetivo identificar in silico potenciais inibidores contra a PLA2 de Apis mellifera, avaliar in vitro e in vivo a potencial atividade inibitória dos compostos selecionados e identificar a citotoxicidade in vitro dos compostos. A estrutura da PLA2 foi obtida da base de dados (PDB) e a busca de compostos feita das bibliotecas Maybridge e Chembridge. A triagem virtual foi realizada com o auxilio do programa GOLD. Os compostos identificados (22 da Maybridge e 68 da Chembridge) pelos programas GOLD foram filtrados com o uso das ferramentas computacionais para seleção dos compostos com melhores interações no sítio ativo. Os parâmetros utilizados como filtros foram as análises das ligações químicas e os campos de interação molecular. Os compostos selecionados (20 da Maybridge e 29 da Chembridge) foram submetidos a um grupo de programas computacionais para predição de características físico-químicas (drug-like), toxicidade e atividade biológica dos ligantes. Os resultados das predições sugeriram que os compostos da Chembridge fossem utilizados nas análises experimentais. Os compostos da biblioteca Chembridge foram adquiridos (29 do total de 49 compostos). Os compostos tiveram as suas potenciais atividades inibitórias avaliadas in vitro e in vivo. A atividade fosfolipásica foi avaliada para os 29 compostos e 11 apresentaram atividade inibitória contra PLA2. Os 11 compostos foram avaliados in vivo com o experimento de indução de edema e 5 compostos conseguiram reduzir o edema. Os compostos foram avaliados em relação a citoxicidade que poderiam causar. A citotoxicidade in vitro foi calculada para 3 compostos dos 5 inibidores obtidos. O resultado do experimento identificou 2 compostos como citotóxicos e 1 com menor citotoxicidade. Apesar da citotoxicidade identificada, mais estudos devem ser realizados para determinar a concentração inibitória não tóxica. Portanto, o trabalho identificou 5 potenciais inibidores específicos contra a PLA2 de Apis mellifera. / Apis mellifera is an insect belonging to the order Hymenoptera , Apidae family , has cosmopolitan occurrence and major ecological , economic, and medical . The hybrid subspecies that occur in Brazil have predominantly African features and came to be known as Africanized bees . The main characteristics of Africanized bees are aggressive behavior , good disease resistance, high honey production and increased frequency of enxameamentos , which has caused concern to be monitored , the increase in the number of accidents . The aggressiveness and increased frequency of exameamento cause they are repeatedly involved in massive human and animal attacks , making this kind of poisoning a problem of public health. The search for treatments for poisoning has been the subject of several studies . In general , treatments act on the effects caused by poison ( drug ), or the components of poison ( sera and inhibitors) . The main components of the venom are A2 ( PLA2 ) and phospholipase melittin . PLA2 is a major venom proteins , which degrades the plasma membrane of the cells and its effect is potentiated by the presence of melittin . The Apis mellifera PLA2 has determined the protein structure and active site identified . These characteristics qualify PLA2 as a potential target for drug design studies . The strategy for drug design aims to accelerate the identification of ligands , contributing to the process of drug discovery . This study aimed to identify in silico potential inhibitors of PLA2 Apis mellifera , in vitro and in vivo the potential inhibitory activity of selected compounds and identify the in vitro cytotoxicity of the compounds . The structure of PLA2 was obtained from the database (PDB ) and the search for compounds made from Maybridge Chembridge and libraries. The virtual screening was done with the aid of the GOLD program. The identified compounds ( 22 and 68 of the Maybridge Chembridge ) by GOLD programs were filtered with the use of computational tools for the selection of compounds with better interactions in the active site . The parameters used were as filters analyzes of chemical bonds and the fields of molecular interaction. The selected compounds ( 20 and 29 of the Maybridge Chembridge ) were submitted to a group of computer programs for the prediction of physico- chemical characteristics ( drug -like) , toxicity and biological activity of the ligands . The results of the predictions suggest that the compounds of Chembridge were used in experimental analysis . The compounds were obtained from Chembridge library (29 of 49 compounds). The compounds had their potential inhibitory activity evaluated in vitro and in vivo . The phospholipase activity was assessed for compounds 29 and 11 showed inhibitory activity against PLA2 . The 11 compounds were evaluated in vivo experiment with the induction of edema and 5 compounds were able to reduce edema . The compounds were evaluated for cytotoxicity that could cause . The in vitro cytotoxicity was calculated for three of the compounds obtained 5 inhibitors . The result of the experiment identified as cytotoxic compounds 2 and 1 with lower cytotoxicity . Despite the cytotoxicity identified , further studies should be conducted to determine the non-toxic inhibitory concentration . Therefore, the study identified 5 potential specific inhibitors of PLA2 Apis mellifera.

Medicago truncatula forme une association symbiotique avec Sinorhizobium meliloti qui conduit à la formation de nodosités fixatrices d’azote. Les cellules symbiotiques végétales accueillent des centaines de bactéries qui restent viables dans la nodosité et se différencient en bactéroïdes fixateurs d’azote. Dans le but de mieux comprendre les mécanismes moléculaires nécessaires à la mise en place de cette interaction, nous avons recherché de nouveaux gènes de plante requis pour une symbiose effective en utilisant des approches de génétique directe et inverse. Des méthodes de biologie cellulaire et moléculaire ont été utilisées pour caractériser le phénotype des mutants et mieux comprendre la fonction biologique de ces gènes.Le gène symbiotique DNF2 code une phosphatidylinositol phospholipase C putative. Les nodosités formées par le mutant dnf2 contiennent une zone de fixation qui est réduite et dans laquelle les rhizobia ne se différencient pas complètement en bactéroïdes. De plus ces nodosités sénescent rapidement et présentent des réactions similaires à des réponses de défense. Sous certaines conditions d’expérimentation, le phénotype sauvage peut être restauré chez ce mutant ce qui montre le caractère conditionnel du phénotype.Le gène symbiotique SYMCRK code un récepteur kinase riche en cystéine. Le phénotype du mutant symCRK est similaire à celui de dnf2, ce qui suggère que ces deux gènes sont impliqués dans des processus aboutissant à des réponses similaires, probablement la persistance des bactéries dans les cellules végétales ou l’inhibition des réactions de défense de la plante. Les phénotypes Fix- atypiques des mutants dnf2 et symCRK suggèrent que les gènes correspondants sont impliqués dans les processus de répression des défenses de la plante et de persistance des bactéroïdes. / Medicago truncatula and Sinorhizobium meliloti form a symbiotic association resulting in the formation of nitrogen-fixing nodules. In the nodules, symbiotic plant cells home and maintain hundreds of viable bacteria which are differentiated into bacteroids, the nitrogen-fixing form of rhizobia. In order to better understand the molecular mechanism sustaining this phenomenon, we used a combination of forward and reverse genetics approaches to identify genes required for nitrogen fixation. In addition we have used cell and molecular biology to characterize the phenotype of the corresponding mutants and to gain an insight into the genes functions.The symbiotic gene DNF2 encodes a putative phosphatidylinositol phospholipase C-like protein. Nodules formed by the mutant contain a zone of infected cells reduced to a few cell layers. In this zone, bacteria do not differentiate properly into bacteroids. Mutant nodules senesce rapidly and they exhibit defense-like reactions. The dnf2 symbiotic phenotype has been shown to be dependent on the experimental conditions.The symbiotic gene SYMCRK encodes a cystein-rich receptor kinase. The symCRK phenotype is similar to dnf2 suggesting that the two genes SYMCRK and DNF2 are participating in similar processes. This atypical phenotype amongst Fix- mutants unravels DNF2 and SYMCRK as new actors of bacteroid persistence inside symbiotic plant cells and repression of plant defense.

A Apis mellifera é um inseto pertencente à ordem Himenóptera, família Apidae, possui ocorrência cosmopolita e grande importância ecológica, econômica e médica. As subespécies hibridas que ocorrem no Brasil possuem características predominantemente africanas e passaram a ser conhecidas como abelhas africanizadas. As principais características das abelhas africanizadas são o comportamento agressivo, boa resistência a doenças, alta produção de mel e o aumento da frequência de enxameamentos, que tem causado preocupação por estar acompanhado, de aumento no número de acidentes. A agressividade e o aumento da frequência do exameamento fazem com que elas estejam repetidamente envolvidas em ataques massivos a humanos e animais, tornando esse tipo de envenenamento um problema de saúde pública. A busca de tratamento para o envenenamento tem sido alvo de diversas pesquisas. De uma forma geral, os tratamentos atuam sobre os efeitos causados pelo veneno (medicamentos) ou sobre os componentes do veneno (soros e inibidores). Os principais componentes do veneno são a fosfolipase A2 (PLA2) e a melitina. A PLA2 é uma das principais proteínas do veneno, que degrada a membrana plasmática das células e tem o seu efeito potencializado pela presença da melitina. A PLA2 da Apis mellifera possui a estrutura protéica determinada e sítio ativo identificado. Essas características qualificam a PLA2 como potencial alvo de estudos de planejamento de fármacos. A estratégia de planejamento de fármacos tem como objetivo acelerar o processo de identificação de ligantes, contribuindo para o processo da descoberta de fármacos. Este trabalho teve como objetivo identificar in silico potenciais inibidores contra a PLA2 de Apis mellifera, avaliar in vitro e in vivo a potencial atividade inibitória dos compostos selecionados e identificar a citotoxicidade in vitro dos compostos. A estrutura da PLA2 foi obtida da base de dados (PDB) e a busca de compostos feita das bibliotecas Maybridge e Chembridge. A triagem virtual foi realizada com o auxilio do programa GOLD. Os compostos identificados (22 da Maybridge e 68 da Chembridge) pelos programas GOLD foram filtrados com o uso das ferramentas computacionais para seleção dos compostos com melhores interações no sítio ativo. Os parâmetros utilizados como filtros foram as análises das ligações químicas e os campos de interação molecular. Os compostos selecionados (20 da Maybridge e 29 da Chembridge) foram submetidos a um grupo de programas computacionais para predição de características físico-químicas (drug-like), toxicidade e atividade biológica dos ligantes. Os resultados das predições sugeriram que os compostos da Chembridge fossem utilizados nas análises experimentais. Os compostos da biblioteca Chembridge foram adquiridos (29 do total de 49 compostos). Os compostos tiveram as suas potenciais atividades inibitórias avaliadas in vitro e in vivo. A atividade fosfolipásica foi avaliada para os 29 compostos e 11 apresentaram atividade inibitória contra PLA2. Os 11 compostos foram avaliados in vivo com o experimento de indução de edema e 5 compostos conseguiram reduzir o edema. Os compostos foram avaliados em relação a citoxicidade que poderiam causar. A citotoxicidade in vitro foi calculada para 3 compostos dos 5 inibidores obtidos. O resultado do experimento identificou 2 compostos como citotóxicos e 1 com menor citotoxicidade. Apesar da citotoxicidade identificada, mais estudos devem ser realizados para determinar a concentração inibitória não tóxica. Portanto, o trabalho identificou 5 potenciais inibidores específicos contra a PLA2 de Apis mellifera. / Apis mellifera is an insect belonging to the order Hymenoptera , Apidae family , has cosmopolitan occurrence and major ecological , economic, and medical . The hybrid subspecies that occur in Brazil have predominantly African features and came to be known as Africanized bees . The main characteristics of Africanized bees are aggressive behavior , good disease resistance, high honey production and increased frequency of enxameamentos , which has caused concern to be monitored , the increase in the number of accidents . The aggressiveness and increased frequency of exameamento cause they are repeatedly involved in massive human and animal attacks , making this kind of poisoning a problem of public health. The search for treatments for poisoning has been the subject of several studies . In general , treatments act on the effects caused by poison ( drug ), or the components of poison ( sera and inhibitors) . The main components of the venom are A2 ( PLA2 ) and phospholipase melittin . PLA2 is a major venom proteins , which degrades the plasma membrane of the cells and its effect is potentiated by the presence of melittin . The Apis mellifera PLA2 has determined the protein structure and active site identified . These characteristics qualify PLA2 as a potential target for drug design studies . The strategy for drug design aims to accelerate the identification of ligands , contributing to the process of drug discovery . This study aimed to identify in silico potential inhibitors of PLA2 Apis mellifera , in vitro and in vivo the potential inhibitory activity of selected compounds and identify the in vitro cytotoxicity of the compounds . The structure of PLA2 was obtained from the database (PDB ) and the search for compounds made from Maybridge Chembridge and libraries. The virtual screening was done with the aid of the GOLD program. The identified compounds ( 22 and 68 of the Maybridge Chembridge ) by GOLD programs were filtered with the use of computational tools for the selection of compounds with better interactions in the active site . The parameters used were as filters analyzes of chemical bonds and the fields of molecular interaction. The selected compounds ( 20 and 29 of the Maybridge Chembridge ) were submitted to a group of computer programs for the prediction of physico- chemical characteristics ( drug -like) , toxicity and biological activity of the ligands . The results of the predictions suggest that the compounds of Chembridge were used in experimental analysis . The compounds were obtained from Chembridge library (29 of 49 compounds). The compounds had their potential inhibitory activity evaluated in vitro and in vivo . The phospholipase activity was assessed for compounds 29 and 11 showed inhibitory activity against PLA2 . The 11 compounds were evaluated in vivo experiment with the induction of edema and 5 compounds were able to reduce edema . The compounds were evaluated for cytotoxicity that could cause . The in vitro cytotoxicity was calculated for three of the compounds obtained 5 inhibitors . The result of the experiment identified as cytotoxic compounds 2 and 1 with lower cytotoxicity . Despite the cytotoxicity identified , further studies should be conducted to determine the non-toxic inhibitory concentration . Therefore, the study identified 5 potential specific inhibitors of PLA2 Apis mellifera.

La phospholipase A2 sécrétée de type IIA (sPLA2-IIA) est une protéine possédant une activité antibactérienne très élevée envers les bactéries à Gram positif. La mucoviscidose (MV) est une maladie génétique résultant de la mutation du gène Cftr. L'altération de la fonction du CFTR dans les poumons favorise la colonisation par des pathogènes bactériens, dont les plus retrouvés, S. aureus et P. aeruginosa, colonisent les voies aériennes de manière séquentielle: S. aureus est principalement retrouvé chez les jeunes patients et P. aeruginosa chez les adultes. Les mécanismes impliqués dans ce changement de prévalence restent cependant mal connus. Dans ce travail, nous démontrons que l'expression de la sPLA2-IIA est plus importante dans les poumons de patients MV que dans les poumons de patients non MV et augmente avec l'âge des patients. La sPLA2-IIA présente dans les expectorations de patients MV est capable de tuer spécifiquement S. aureus. L'utilisation de modèles animaux nous a permis de démontrer sa spécificité d'action contre S. aureus et l'induction de son expression par P. aeruginosa contribuant à l'élimination de S. aureus des voies respiratoires. Enfin, nous avons identifié les cellules épithéliales comme une source majeure de sPLA2-IIA chez les patients MV. Dans ces cellules, P. aeruginosa induit l'expression de la sPLA2-IIA par un mécanisme dépendant de l'injection de la toxine ExoS et du facteur de transcription KLF2. L'ensemble de ces résultats indique i) que la sPLA2-IIA induite par P. aeruginosa, participe à l'élimination de S. aureus dans les voies aériennes des patients MV et ii) qu'une bactérie élimine une autre bactérie en utilisant la défense de l'hôte. / The type IIA secretory phospholipase A2 (sPLA2-IIA) is a host defense protein endowed with antibacterial activity, especially against Gram positive bacteria. Cystic fibrosis (CF) is a genetic disease due to mutations of Cftr gene. In the lungs, CFTR mutation favored bacterial colonization by bacterial pathogens, of which S. aureus and P. aeruginosa are the most isolated. These two bacterial species sequentially colonized airways of CF patients: S. aureus is predominant in young patients and P. aeruginosa in adults. But the mechanisms involved in this switch of bacterial prevalence are still unknown. In this work we showed that sPLA2-IIA levels were increased in lungs of CF patients compared to lungs of non-CF patients and that sPLA2-IIA levels increased with age of patients. sPLA2-IIA recovered from CF patients expectorations was active and killed specifically S. aureus. Using animal models of lung infection, we demonstrated the selectivity of sPLA2-IIA against S. aureus and that P. aeruginosa induced sPLA2-IIA expression, the latter contributed to S . aureus elimination from the airways. Finally, we identified epithelial cells as a major source of sPLA2-IIA in CF airways. In these cells, P. aeruginosa induced sPLA2-IIA expression through injection of ExoS toxin and activation of KLF2 transcription factor. Taken together, these results indicate that i) P. aeruginosa-induced sPLA2-IIA expression in CF airways participated to S. aureus elimination and ii) a bacteria eliminate another bacteria by manipulating host innate immunity.

La phospholipase D (PLD) hydrolyse la phosphatidylcholine des membranes cellulaires, libérant le messager acide phosphatidique. La capacité de la PLD à influer sur la voie de signalisation de mTOR, acteur central dans le contrôle du tissu musculaire, nous a incités à étudier son rôle dans ce tissu. Mes travaux de thèse ont pour but d'étudier les mécanismes par lesquels la PLD intervient dans la différenciation myogénique et dans la régulation de la masse musculaire. Dans un premier temps, nous avons montré que le contrôle de la différenciation des myoblastes L6 par la PLD met en jeu l'activation des deux complexes de mTOR (mTORC1 et mTORC2). mTORC2 active la différenciation, probablement via son effecteur PKCalpha, alors que mTORC1 la réprime via son effecteur S6K1, en induisant la phosphorylation de rictor, un composant de mTORC2, et l'inhibition de ce complexe. Nous avons par ailleurs montré que l'extinction de PLD par interférence de I'ARN induit l'atrophie de myotubes L6 en culture, ainsi qu'une baisse de la phosphorylation de S6K1 et 4E-BP1, effecteurs de mTORC1. Inversement, la surexpression de PLD à l'aide de vecteurs adénoviraux induit une hypertrophie des myotubes, associée à une activation de la voie mTORC1, et de Akt, effecteur de mTORC2. De plus, la surexpression de PLD atténue l'atrophie induite par la dexaméthasone. Ces résultats mettent en évidence un rôle hypertrophique et anti-atrophique de la PLD, qui pourrait s'exercer par stimulation de la voie mTOR. Nos résultats suggèrent que la PLD est susceptible de jouer un rôle clé dans le muscle squelettique, en agissant tant au niveau de la régénération du tissu qu'au niveau de la régulation de sa masse. / Phospholipase D (PLD) hydrolyzes phosphatidylcholine of cell membranes, releasing the lipid messenger phosphatidic acid. The ability of PLD to affect mTOR signaling pathway, a central actor in the control of muscle tissue, prompted us to study its role in this tissue. My thesis aims at investigating how PLD is involved in myogenic differentiation, and how it regulates muscle mass. We first showed that the mechanism by which PLD controls differentiation of L6 myoblasts involves the activation of the two mTOR complexes (mTORC1 and mTORC2). mTORC2 activates differentiation, probably via its effector PKCalpha, whereas mTORC1 represses differentiation via its effector S6K1, by inducing the phosphorylation of Rictor, a component of mTORC2, and the inhibition of this complex. Besides, we showed that extinction of PLD by RNA interference induces the atrophy of L6 myotubes, and decreases the phosphorylation of the mTORC1 effectors S6K1 and 4E-BP1. Conversely, overexpression of PLD using adenoviral vectors induces the hypertrophy of myotubes and the activation of both mTORC1 pathway and the mTORC2 effector Akt. Furthermore, PLD overexpression attenuates atrophy induced by dexamethasone. These results highlight a hypertrophic and anti-atrophic role of PLD, which could be achieved through stimulation of the mTOR pathway. Our results suggest that PLD is likely to play a key role in skeletal muscle homeostasis, by acting at both the tissue regeneration and mass regulation levels.

L'activation des gamétocytes de Plasmodium falciparum par exposition à l'acide xanthurénique à basse température conduit à la sortie de gamètes mâles et femelles matures des érythrocytes de l’hôte, ce qui est essentiel pour la fertilisation et la formation ultérieure de zygotes. Les gamètes possèdent des vésicules cytosoliques contenant une protéine formant des pores connue sous le nom de PfPLP2. Durant la sortie, les vésicules ayant PfPLP2 sont redistribuées du cytoplasme des gamètes à la périphérie. Puis ces vésicules vont sécréter PfPLP2 permettant ainsi la sortie des gamètes par perforation de la membrane érythrocytaire. Dans cette étude, nous avons identifié le rôle d'une phospholipase de type patatine A2 (PfPATPL1) dans la sortie de gamètes de P. falciparum. Nous avons utilisé une approche de génétique inverse pour générer un knock-down conditionnel de PfPATPL1 par fusion à un domaine de déstabilisation (DD). Nous avons modifié l’expression PfPATPL1 dans les gamétocytes de stade V en supprimant le ligand de Shield-1, ce qui nous a permis de constater l’importance de PfPATPL1 durant les différentes étapes de la gamétogenèse, ainsi que dans l'arrondissement des gamétocytes, la sortie des gamètes et l'exflagellation des gamètes mâles. Nous avons également trouvé que PfPATPL1 est nécessaire pour la redistribution des vésicules portant PfPLP2 à la périphérie des gamètes pendant sortie. De plus, nous avons utilisé un inhibiteur connu de la phospholipase du nom de bromure de 4-bromophénacyle (4-BPB) pour étudier l'importance de l'activité de la PLA2 dans la gamétogenèse. Nous avons découvert que le traitement par le 4-BPB entraîne également des anomalies dans l'arrondissement des gamétocytes, inhibe la sortie des gamètes et l'exflagellation des gamètes mâles. Et que ce même traitement au 4-BPB entravait la redistribution des vésicules contenant PfPLP2 à la périphérie des gamètes. Lorsque les moustiques ont été nourris avec des gamétocytes traités au 4-BPB dans un test d'alimentation membranaire standard (SMFA), nous avons observé une diminution significative du taux d'infection des moustiques et une chute drastique de la densité des oocystes et du nombre de moustiques infectés. Ces données suggèrent que PfPATPL1 est important pour le développement des gamètes chez les moustiques et peut constituer une cible prometteuse pour les stratégies d'intervention de transmissivité. / The activation of Plasmodium falciparum gametocytes by exposure to low temperature and xanthurenic acid leads to the egress of mature male and female gametes from host erythrocytes, which is essential for fertilization and subsequent zygote formation. Gametes contain cytosolic vesicles bearing a pore forming protein known as PfPLP2. During egress, PfPLP2 containing vesicles gets redistributed from gamete cytoplasm to periphery. Subsequently, PfPLP2 is secreted from these vesicles leading to perforation of host erythrocyte membrane resulting in gamete egress. In this study, we have identified the role of a patatin-like phospholipase A2 (PfPATPL1) in P. falciparum gamete egress. We have taken a reverse genetics approach to generate a conditional knock down of PfPATPL1 by fusion to a destabilization domain (DD). We have knocked down PfPATPL1 in Stage V gametocytes by removal of Shield-1 ligand and found that PfPATPL1 is required during different steps of gametogenesis including gametocyte rounding up, gamete egress and male gamete exflagellation. We have also found that PfPATPL1 is needed for redistribution of PfPLP2 bearing vesicles to the gamete periphery during egress. Additionally, we have utilized a known inhibitor of phospholipase A2 known as 4- bromophenacyl bromide (4-BPB) to study the importance of PLA2 activity in gametogenesis. We have found that 4-BPB treatment also leads to defects in gametocyte rounding up, inhibits gamete egress and male gamete exflagellation. 4-BPB treatment also hampers the redistribution of PfPLP2 containing vesicles to gamete periphery. When the mosquitoes were fed with 4-BPB treated gametocytes in a standard membrane feeding assay (SMFA), we observed a significant decline in mosquito infection rate and a drastic drop in oocyst density and number of infected mosquitos. These data suggests that PfPATPL1 is important for gamete development in mosquitos and may serve as a promising target for transmmision intervention strategies.