L'activation des gamétocytes de Plasmodium falciparum par exposition à l'acide xanthurénique à basse température conduit à la sortie de gamètes mâles et femelles matures des érythrocytes de l’hôte, ce qui est essentiel pour la fertilisation et la formation ultérieure de zygotes. Les gamètes possèdent des vésicules cytosoliques contenant une protéine formant des pores connue sous le nom de PfPLP2. Durant la sortie, les vésicules ayant PfPLP2 sont redistribuées du cytoplasme des gamètes à la périphérie. Puis ces vésicules vont sécréter PfPLP2 permettant ainsi la sortie des gamètes par perforation de la membrane érythrocytaire. Dans cette étude, nous avons identifié le rôle d'une phospholipase de type patatine A2 (PfPATPL1) dans la sortie de gamètes de P. falciparum. Nous avons utilisé une approche de génétique inverse pour générer un knock-down conditionnel de PfPATPL1 par fusion à un domaine de déstabilisation (DD). Nous avons modifié l’expression PfPATPL1 dans les gamétocytes de stade V en supprimant le ligand de Shield-1, ce qui nous a permis de constater l’importance de PfPATPL1 durant les différentes étapes de la gamétogenèse, ainsi que dans l'arrondissement des gamétocytes, la sortie des gamètes et l'exflagellation des gamètes mâles. Nous avons également trouvé que PfPATPL1 est nécessaire pour la redistribution des vésicules portant PfPLP2 à la périphérie des gamètes pendant sortie. De plus, nous avons utilisé un inhibiteur connu de la phospholipase du nom de bromure de 4-bromophénacyle (4-BPB) pour étudier l'importance de l'activité de la PLA2 dans la gamétogenèse. Nous avons découvert que le traitement par le 4-BPB entraîne également des anomalies dans l'arrondissement des gamétocytes, inhibe la sortie des gamètes et l'exflagellation des gamètes mâles. Et que ce même traitement au 4-BPB entravait la redistribution des vésicules contenant PfPLP2 à la périphérie des gamètes. Lorsque les moustiques ont été nourris avec des gamétocytes traités au 4-BPB dans un test d'alimentation membranaire standard (SMFA), nous avons observé une diminution significative du taux d'infection des moustiques et une chute drastique de la densité des oocystes et du nombre de moustiques infectés. Ces données suggèrent que PfPATPL1 est important pour le développement des gamètes chez les moustiques et peut constituer une cible prometteuse pour les stratégies d'intervention de transmissivité. / The activation of Plasmodium falciparum gametocytes by exposure to low temperature and xanthurenic acid leads to the egress of mature male and female gametes from host erythrocytes, which is essential for fertilization and subsequent zygote formation. Gametes contain cytosolic vesicles bearing a pore forming protein known as PfPLP2. During egress, PfPLP2 containing vesicles gets redistributed from gamete cytoplasm to periphery. Subsequently, PfPLP2 is secreted from these vesicles leading to perforation of host erythrocyte membrane resulting in gamete egress. In this study, we have identified the role of a patatin-like phospholipase A2 (PfPATPL1) in P. falciparum gamete egress. We have taken a reverse genetics approach to generate a conditional knock down of PfPATPL1 by fusion to a destabilization domain (DD). We have knocked down PfPATPL1 in Stage V gametocytes by removal of Shield-1 ligand and found that PfPATPL1 is required during different steps of gametogenesis including gametocyte rounding up, gamete egress and male gamete exflagellation. We have also found that PfPATPL1 is needed for redistribution of PfPLP2 bearing vesicles to the gamete periphery during egress. Additionally, we have utilized a known inhibitor of phospholipase A2 known as 4- bromophenacyl bromide (4-BPB) to study the importance of PLA2 activity in gametogenesis. We have found that 4-BPB treatment also leads to defects in gametocyte rounding up, inhibits gamete egress and male gamete exflagellation. 4-BPB treatment also hampers the redistribution of PfPLP2 containing vesicles to gamete periphery. When the mosquitoes were fed with 4-BPB treated gametocytes in a standard membrane feeding assay (SMFA), we observed a significant decline in mosquito infection rate and a drastic drop in oocyst density and number of infected mosquitos. These data suggests that PfPATPL1 is important for gamete development in mosquitos and may serve as a promising target for transmmision intervention strategies.

Les Porifères et les Cténophores sont probablement les deux lignées animales les plus anciennes. Leur étude permet de retracer l’histoire précoce des métazoaires, et d’aborder l'origine de la distinction entre les lignées somatique et germinale. En effet, chez les éponges cette distinction n’existe pas: les archéocytes et choanocytes pouvant donner les cellules somatiques et les gamètes.Après avoir établi la liste des gènes considérés comme impliqués dans la gamétogenèse chez les métazoaires, j’ai caractérisé leurs séquences et retracé leur histoire grâce à des analyses comparatives intégrant les principales lignées animales. Enfin, un suivi in situ d'Oscarella lobularis m’a permis d’affiner son cycle de vie et d’accéder à toutes les étapes du développement pour étudier l’expression de ces gènes et de tester leur implication dans la gamétogenèse.Ainsi, j'ai montré que 18 gènes du GMP (Germline Multipotency Program) sont présents ancestralement chez les animaux. Parmi ceux-ci 11 s’expriment pendant la gamétogenèse, au cours de l’embryogenèse, de la reproduction asexuée et de la régénération. Enfin, le suivi in situ a montré l’influence de la variation de la température et de la matière organique sur le déclenchement de la gamétogenèse.Mon travail suggère d’une part, que la spécification des cellules germinales est régie par des mécanismes génétiques communs à l’échelle de métazoaires, et d’autre part que ces gènes pourraient être impliqués dans la multipotence. Ces résultats renforcent l’hypothèse proposant une origine commune de la lignée germinale et des cellules souches somatiques. / Porifera and Ctenophora are probably the two most ancient animal lineages. Their study therefore allows to trace back the early history of metazoans and to address the origin of the distinction between somatic and germ lines. Indeed, in sponges this distinction does not exist: archeocytes and choanocytes can give rise to both somatic cells and gametes.After establishing the list of genes considered to be involved in gametogenesis in metazoans, I searched for these candidate genes (by local blast) in the transcriptomes of two sponge species (Oscarella lobularis and Oopsacas minuta). I thereby managed to characterize their sequences (phylogenetic and protein domain analyzes) and to trace their evolution through comparative analyzes including all main animal phyla. Finally, the in situ monitoring of O. lobularis enabled me to refine its life cycle and access all key developmental stages in order to study the expression of candidate genes in order to test their possible involvement in gametogenesis in this species.I have shown that 18 GMP (Germline Multipotency Program) genes are present ancestrally in animals. Among them, at least 11 are expressed not only during gametogenesis but also during embryogenesis, asexual reproduction and regeneration. Finally, in situ monitoring showed the influence of temperature variations and organic matter availability on gametogenesis.My work suggests, firstly that the specification of germ cells is controlled by common genetic mechanisms across metazoans, and secondly that these ancestral genes might be involved in pluripotency. These results reinforce the hypothesis suggesting a common origin of the germline and somatic stem cells.

La truite arc-en-ciel carnivore (Oncorhynchus mykiss) est considérée comme une espèce pauvre utilisatrice de glucides alimentaires. Des études récentes ont montré qu'une hypométhylation globale de l'ADN hépatique induite par un régime alimentaire riche en glucides et pauvre en protéines pourrait être impliquée dans l'établissement / le maintien du de ce phénotype chez la truite, mais le détail des mécanismes sous-jacents reste inconnu. La thèse vise à étudier les mécanismes épigénétiques sous-jacents à ce phénotype de faible utilisation des glucides alimentaire chez la truite et à examiner si le métabolisme du glucose et l’épigénome chez les juvéniles peuvent être programmés par un stimulus hypoxique précoce. Nous avons d’abord identifié tous les gènes paralogues liés aux voies de méthylation / déméthylation de l’ADN (dnmt, tet et tdg) dans le génome de la truite, clarifié leurs histoires évolutives et analysé leurs profils d’expression au cours de la gamétogenèse et de l’embryogenèse chez la truite. Nous avons ensuite étudiés plus en détail les processus et les mécanismes potentiellement à l’origine de l'hypométhylation de l'ADN hépatique global constatée chez la truite après un régime riche en glucides et pauvre en protéines. Les résultats ont montré pour la première fois qu'une diminution du taux deprotéines et une augmentation du taux de glucides dans l’aliment induisent de manière indépendante et en interaction une hypométhylation hépatique globale chez la truite, qui semble établie par le biais d'une voie de déméthylation active. Nous avons également constaté qu’une forte hyperglycémie induite par une injection de glucose induit une hypométhylation globale de l’ADN au niveau des sites CmCGG dans le foie de la truite. Les mécanismes détaillés de ces processus de déméthylation restent à élucider. Enfin, grâce à la stratégie de programmation métabolique, nous avons pour la première fois confirmé que l’utilisation d’un stimulus non nutritionnel au début de la vie, l’hypoxie, pouvait moduler de façon persistante la transcription des gènes liés au métabolisme du glucose chez la truite juvénile sans nuire aux performances de croissance. De plus, selon sa nature chronique ou aigue, l’hypoxie, a tendance à induire des effets de programmation opposés sur les gènes codants pour les transporteurs au glucose notamment dans le foie et le muscle de la truite juvénile. Dans son ensemble, la thèse met en avant notre compréhension du rôle du méthylome dans la contribution à la faible capacité d'utilisation des glucides alimentaires chez la truiteLa thèse met aussi en lumière le potentiel d'utilisation de l'hypoxie comme stimulus pour programmer le métabolisme du glucose, l'épigénome et l'utilisation des glucides alimentaires chez la truite arc-en-ciel. / The carnivorous rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) is considered as a poor user of dietary carbohydrates. Recent studies showed that a high-carbohydrate/low protein diet inducing hepatic global DNA hypomethylation could be involved in the establishment/maintenance of the poor dietary carbohydrates utilisation phenotype in trout, but the detail mechanisms remain unclear. The present thesis aimed at investigating the epigenetic mechanisms underlying this poor dietary carbohydrate utilisation phenotype in trout, and exploring if the glucose metabolism and the epigenome in juveniles can be programmed through a hypoxic stimulus during early life. We first identified all the paralogous genes related to DNA methylation/demethylation pathways (dnmt, tet and tdg) in trout genome, clarified their molecular evolution histories and monitored their transcriptional expression patterns during gametogenesis and embryogenesis in trout. Besides, we investigate further the causes, processes and potential mechanisms about the hepatic global DNA hypomethylation in trout after feeding a high carbohydrate/low protein diet. Results for the first time demonstrated that a decrease in protein content and an increase in carbohydrate content in the diet can independently as well as interactively induce hepatic global hypomethylation in trout. This global loss of methylation is probably established through an active demethylation pathway. We also found that a strong hyperglycaemia induced by glucose injection induces global CmCGG hypomethylation in the liver of trout. The detailed mechanisms of these demethylation processes remain to be elucidated. Finally, through metabolic programming strategy, we confirmed for the first time that using a non-nutritional stimulus, hypoxia, during early life stage persistently modulates the transcription of glucose metabolism-related genes in juvenile trout without negative effects on growth performance. Moreover, acute and chronic hypoxia tended to induce opposite programming effects on glucose-transporter encoding genes in both liver and muscle of juvenile trout. Together, the present thesis brings forward our understandings about the roles of epigenetics in contributing to the low ability to use dietary carbohydrates in trout, and sheds light on the potential of using hypoxia as the stimulus in metabolic programming strategy to tailor the glucose metabolism, the epigenome and dietary carbohydrate utilisation in rainbow trout.

Le renouvellement annuel de la population de cellules germinales chez l'huître creuse Crassostrea gigas est une étape clé de son cycle de reproduction. La compréhension de ces mécanismes est essentielle à la maîtrise de la reproduction contrôlée de C. gigas, indispensable pour répondre à une demande croissante des ostréiculteurs, de naissain produit en écloserie. Les objectifs de cette étude étaient de déterminer l'origine et les mécanismes de renouvellement annuel des cellules germinales de C. gigas et de comprendre l'infuence des facteurs environnementaux sur ces processus. Le gène Oyster vasa-like gene (Oyvlg), premier marqueur spécifique des cellules germinales découvert chez les bivalves a été caractérisé. Ce gène, exprimé spécifiquement dans les cellules de la lignée germinale, nous a permis de déterminer que les cellules germinales de C. gigas, d'origine mésodermique, étaient différenciées dès le stade embryonnaire sous la forme de cellules germinales primordiales (PGCs). Ces PGCs seraient spécifiées par la localisation de déterminants cytoplasmiques transmis maternellement à l'embryon, dans une structure équivalente à un cytoplasme germinal. Les ARNm Oyvlg seraient l'un de ces déterminants germinaux. Au stade adulte, la population de cellules germinales apparaît renouvelée annuellement par la prolifération, au début du cycle de reproduction, de cellules germinales souches (GSCs), dispersées en petits groupes dans le tissu conjonctif pendant la période de repos sexuel. La différenciation des GSCs en gonies et la multiplication de ces gonies marque le début de la gamétogenèse. Afin de tester l'effet de la température et de la photopériode sur la gamétogenèse, des huîtres adultes ont été conditionnées expérimentalement pendant un an en écloserie, dans trois conditions de température et de photopériode différentes : (1) conditions dites "naturelles" reproduisant les cycles de température et de photopériode moyens enregistrés à Marennes-Oléron, (2) conditions "accélérées", deux fois plus rapides que les cycles naturels, (3) conditions "hivernales" constantes à 8°C et 8 heures de jour. Ces expérimentations ont mis en évidence une grande plasticité physiologique de la reproduction de C. gigas, dont le rythme se synchronise parfaitement sur celui des facteurs température / photopériode. Des photopériodes décroissantes pourraient stimuler la prolifération des cellules germinales souches alors que la température apparaît comme le facteur prédominant dans la régulation des mitoses goniales et de la maturation. Les températures basses (8°C – 11°C) semblent déclencher les mitoses goniales et les températures élevées accélèrent le processus de maturation des cellules germinales. L'utilisation de cycles de température et de photopériode modifiés (accélérés ou hivernaux) permettraient d'obtenir des pontes toute l'année en écloserie, y compris en période automnale généralement considérée comme réfractaire pour le conditionnement.

Depuis plusieurs années il est devenu essentiel de comprendre le déterminisme sexuel des espèces à fort intérêt économique afin d’optimiser leur production au sein d’écloseries émergentes.L’objectif principal de cette thèse était de mettre en évidence les mécanismes impliqués dans la détermination et la différenciation sexuelle, et notamment du sexe femelle, chez l’huître perlière P. margaritifera, espèce hermaphrodite protandre et espèce clé de la perliculture, la seconde ressource économique pour la Polynésie française. Pour atteindre cet objectif, deux approches ont été menées : une approche transcriptomique visant à étudier les mécanismes moléculaires du déterminisme et de la différenciation sexuelle, et une approche expérimentale visant à comprendre le phénomène de la sexualisation par des forçages environnementaux et hormonaux en s’intéressant plus particulièrement au déterminisme et à la différenciation sexuelle femelle.Dans l’approche transcriptomique, le transcriptome de la gonade de P. margaritifera a été séquencé à partir de plusieurs échantillons gonadiques d’huîtres de sexe mâle et femelle à différents stades de développement. Après le séquençage Illumina et l'assemblage du transcriptome, 70 147 contigs ont été obtenus. L’analyse fonctionnelle de ces 70 147contigs, a permis d’identifier des gènes d’intérêt et ainsi de constituer un catalogue de 87 ARNm codant pour 67 protéines impliquées dans la détermination, la différenciation sexuelle et/ou la gamétogenèse. Ensuite une analyse stricte des données de quantification RNAseq a révélé 1 937 contigs exprimés de manière différentielle entre les catégories histologiques des gonades. À partir de l’analyse de leurs profils d’expression au sein de chaque échantillon, un nouveau modèle de la reproduction de P. margaritifera, basé sur une double approche analytique, eg. histo-moléculaire, a été proposé. Ce modèle révèle notamment que le déterminisme sexuel de P. margaritifera chez l’adulte se produirait durant une phase de régression de la gonade. Considérant ainsi les nouveaux stades définis par ce modèle, 9 gènes biomarqueurs de la voie sexuelle femelle ont pu être identifiés révélant un modèle prédictif de la voie sexuelle basé sur 3 rapports d’expressions de gènes impliquant 2 gènes inconnus pmarg-c43476 et pmarg-c54338 et 2 gènes connus pmarg-foxl2 et pmarg-fem1-like. Ce deuxième modèle suggère fortement l'implication de pmarg-foxl2 et pmarg-fem1-like dans le déterminisme du sexe de P. margaritifera. Dans l’approche expérimentale, deux expérimentations séparées ont été réalisées pour mettre en évidence l’effet i) de plusieurs combinaisons de température et de niveau trophique, et ii) de l’œstradiol-17β administré par injection directe dans la gonade ; sur le sexe, la gamétogenèse et l’expression des neuf gènes biomarqueurs de la voie sexuelle femelle identifiés précédemment. Les résultats ont montré que la condition combinant la température de 28°C et la concentration en algues de 40 000 cellules mL-1 était la plus favorable non seulement à la maturation des gonades mâles et femelles mais aussi au maintien du sexe femelle. Ce serait dans cette condition environnementale qu’il serait possible d’induire un changement de sexe de mâle vers femelle. Dans la seconde expérimentation, il a été clairement démontré que la reproduction de P. margaritifera pouvait être régulée par les hormones œstrogènes. Les résultats montrent un effet négatif de l’œstradiol sur le développement et la différenciation mâle. Enfin les résultats du modèle prédictif de la voie sexuelle de P. margaritifera, suggèrent une programmation génétique du sexe femelle qui toutefois resterait soumise aux conditions environnementales validant ainsi l’hypothèse d’un mode de détermination mixte du sexe chez P. margaritifera. / For several years it has become essential to understand sex determination of species with high economic interest to maximize their production in emerging hatcheries.The main objective of this thesis was to identify the mechanisms involved in sex determination and sex differentiation, and particularly in female sex, in the pearl oyster P. margaritifera, a protandrous hermaphrodite species and the key species of the pearl farming, the second economic resource for French Polynesia. To achieve this goal, two approaches were undertaken: a transcriptomic approach to investigate the molecular mechanisms of sex determinism and sex differentiation, and an experimental approach to understand the phenomenon of sexualization by environmental and hormonal forcing focusing especially on female sex determinism and female sex differentiation.In the transcriptomic approach, the gonad transcriptome of P. margaritifera was sequenced from several samples of male and female oyster gonads at different stages of development. After Illumina sequencing and assembly of the transcriptome, 70,147 contigs were obtained. Functional analysis of these 70,147 contigs identified genes of interest and allowed the constitution of a catalog of 87 mRNAs encoding 67 proteins involved in sex determination, sex differentiation and/or gametogenesis. Then a strict analysis of RNAseq quantification data revealed 1,937 contigs differentially expressed between the histological categories of gonad. From the analysis of their expression profiles in each sample, a new model of reproduction of P. margaritifera, based on dual analytical approach, i.e. histo-molecular, has been proposed. This model shows that sex determination of adult P. margaritifera pearl oysters occur during a regression phase of the gonad. And considering the new stages defined on this model, 9 biomarkers genes of the female sexual pathway have been identified revealing a 3-gene-pair expression ratio based model, which makes it possible to predict the sexual pathway in this hermaphrodite species. This predictive model involves two unknown genes pmarg-c43476 and pmarg-c54338 and 2 known genes pmarg-foxl2 and pmarg-fem1-like, and strongly suggests the involvement of pmarg-foxl2 and pmarg-fem1-like in sex determinism in P. margaritifera.In the experimental approach, two separated experiments were conducted to demonstrate the effect of i) various combinations of temperature and trophic level, and ii) 17β-estradiol administered by direct injection into the gonad; on sex, gametogenesis and expression of the nine biomarkers genes of the female sexual pathway previously identified. The results showed that the condition combining a temperature of 28 °C and a concentration of 40 000 cells of algae mL-1 was the most favorable not only for the maturation of the male and female gonads but also for the maintenance of the female sex. It would be in this environmental condition that it would be possible to induce a sex change from male to female. In the second experiment, it was clearly demonstrated that the reproduction of P. margaritifera could be regulated by estrogen hormones. The results show a negative effect of estradiol on male development and differentiation. Finally the results of the predictive model of the sexual pathway of P. margaritifera, suggest a genetic programming of the female sex, which however remain subject to environmental conditions, thus validating the hypothesis of a mixed sex determinism mode in P. margaritifera.