A glândula pineal é um órgão transdutor da informação fótica ambiental para o meio interno do organismo, provendo melatonina para a circulação sistêmica, a qual sinaliza o período de escuro e sincroniza os ritmos endógenos de acordo com as variações ambientais (Reiter, 1993). Várias evidências apontam para uma comunicação bidirecional entre a pineal e o sistema imune. Foi identificado na glândula pineal de ratos o fator de transcrição NFkB, uma via de trasncrição preferencial para citocinas e glicocorticóides e que modula a síntese de melatonina. TNFα inibe transientemente enquanto corticosterona potencia a transcrição do gene da Aa-nat, enzima chave na síntese de melatonina (Ferreira et al., 2005; Fernandes et al., 2006). LPS é um constituinte da membrana de bactérias gram-negativas e potente indutor de inflamação sistêmica e local. A sinalização de LPS é mediada por receptores toll-like 4 (TLR4) que leva à indução da enzima sintase de óxido nítrico induzivel (iNOS) e subsequente formação de óxido nítrico (NO). O objetivo deste trabalho foi demonstrar a expressão de TLR4 e a resposta funcional da via de transdução de LPS. Foram usados ratos Wistar fêmeas (1-2 meses). O RNAm total foi extraído de pineais controle e usados em RT-PCR com primers específcos contra os transcritos tlr-4, Cd14 e o controle interno Gapdh. Para a imunohistoquímica, secções de pineal de animais perfundidos com solução fixadora seguida de fixação com PAF 4% foram usadas com o anticorpo contra TLR4, sendo o controle negativo obtido na ausência de anticorpo. Os pinealocitos foram obtidos por tripsinização seguida de dispersão mecânica. O acúmulo de NFkB em extratos nucleares de pineais de animais tratados in vivo com LPS (1 mg/kg, iv, 2h) foi analisado por EMSA. A produção de NO foi medida por microscopia confocal em células carregadas com o cromóforo fluorescente DAR-4M-AM (5μM, 30min). RT-PCR revelou a presence constitutiva do RNAm de tlr-4 e Cd14 em pineais de rato. O estudo imunohistoquímico indicou uma marcação positiva para TLR4 em localização citoplasmática e nuclear, sendo abolida qualquer marcação na ausência do anticorpo. Um aumento na translocação nuclear de NFB foi observada nos animais tratados com LPS. LPS também levou a uma resposta funcional com aumento na reatividade da iNOS e aumento na produção de NO de maneira dependente de tempo e da concentração de LPS (0,1 to 10 μg/mL). O máximo aumento da produção de NO foi observado com LPS 1 μg/mL por 2 h. Este efeito foi inibido com o pré-tratamento com L-NAME (0.1mM, 30min) e 1400W (1μM, 30 min). Estes resultados demonstram que a glândula pineal de rato está instrumentada a responder ao desafio com LPS através da indução da via NFkB mediada por TLR4. Além disso, funcionalmente esta estimulação induz um significante aumento da imunoreatividade à iNOS e produção de NO. Estes dados corroboram com a hipótese do eixo imune-pineal com supressão da produção de melatonina no início de uma resposta de defesa. / Accumulating evidences put the pineal gland and the immune system reciprocally linked by bidirectional communication. Rat pineal gland constitutively activated NFkB, which plays a role on melatonin synthesis, is a preferential transduction pathway for cytokines and glucocorticoids (Ferreira et al., 2005; Fernandes et al., 2006). TNFα transiently inhibits, while corticosterone potentiates, noradrenaline-induced Aa-nat gene transcription, a key enzyme in melatonin synthesis. Lipopolysaccharides (LPS) are the major components of the outer membrane of Gram-negative bacteria, which makes them prime targets for recognition by the immune system. Toll-like receptor 4 (TLR4) conveys LPS signaling which induces expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and subsequent nitric oxide (NO) formation. An attempt has been made to demonstrate the expression of TLR4 in the rat pineal glands as well as the characterization of functional response and the transduction pathway following LPS challenge. Female Wistar rats (1-2 months) were used. Total RNA was extracted from control pineals and used in real time RT-PCR with specific primers against tlr-4 and Cd14 transcritps and the housekeeping gene Gapdh (internal control). For immunohistochemistry, the pineals cryosections (8μm) from perfused animals (Lanas fixative, 4% PAF, 15min) followed by fixation (4% PAF, 30min) were used with an antibody against rat TLR4, being the negative control performed in the absence of primary antibody. Pinealocytes were obtained by trypsinization followed by mechanical dispersion. The amount of NFB present in nuclear extracts of pinealocytes challenged with LPS (1μg/ml, 15min) was assayed by EMSA. NO production was measured by confocal microscopy in cells loaded with the fluorescent dye DAR-4M-AM (5μM, 30min). RT-PCR revealed specific constitutive tlr-4 and Cd14 mRNA levels in rat pineals. Immunohistochemistry (n=4) indicated TLR4-positive and -negative immunostaining in the nuclear and cytoplasmic compartments of the cells. All TLR4-positive immunostaining were significantly decreased when experiments were performed in the absence of the primary antibody. An increase in the nuclear translocation of NFKB was observed in LPS challenged cells. LPS (0.1 to 10 μg/mL) also lead to a functional response, as it increased the immunoreactivity of iNOS and a time- and concentration-dependent manner the level of NO in cultured pinealocytes. The maximal NO content induced by LPS 1.0 μg/mL was observed 2h after stimulation. Baseline levels were restored after 4-6h of LPS. The LPS stimulatory effect was fully abolished by the pre-treatments with L-NAME (0.1mM, 30min) and 1400W (1μM). Therefore, our data show that pinealocytes are instrumented for answering to LPS challenge through TLR4-induced NFkB pathway. In addition we observed that this stimulation induces a significant increase in iNOS immunoreactivity and NO production. These data corroborates to the hypothesis that pineal melatonin production is suppressed at the beginning of a defense response.

A glândula pineal é um órgão transdutor da informação fótica ambiental para o meio interno do organismo, provendo melatonina para a circulação sistêmica, a qual sinaliza o período de escuro e sincroniza os ritmos endógenos de acordo com as variações ambientais (Reiter, 1993). Várias evidências apontam para uma comunicação bidirecional entre a pineal e o sistema imune. Foi identificado na glândula pineal de ratos o fator de transcrição NFkB, uma via de trasncrição preferencial para citocinas e glicocorticóides e que modula a síntese de melatonina. TNFα inibe transientemente enquanto corticosterona potencia a transcrição do gene da Aa-nat, enzima chave na síntese de melatonina (Ferreira et al., 2005; Fernandes et al., 2006). LPS é um constituinte da membrana de bactérias gram-negativas e potente indutor de inflamação sistêmica e local. A sinalização de LPS é mediada por receptores toll-like 4 (TLR4) que leva à indução da enzima sintase de óxido nítrico induzivel (iNOS) e subsequente formação de óxido nítrico (NO). O objetivo deste trabalho foi demonstrar a expressão de TLR4 e a resposta funcional da via de transdução de LPS. Foram usados ratos Wistar fêmeas (1-2 meses). O RNAm total foi extraído de pineais controle e usados em RT-PCR com primers específcos contra os transcritos tlr-4, Cd14 e o controle interno Gapdh. Para a imunohistoquímica, secções de pineal de animais perfundidos com solução fixadora seguida de fixação com PAF 4% foram usadas com o anticorpo contra TLR4, sendo o controle negativo obtido na ausência de anticorpo. Os pinealocitos foram obtidos por tripsinização seguida de dispersão mecânica. O acúmulo de NFkB em extratos nucleares de pineais de animais tratados in vivo com LPS (1 mg/kg, iv, 2h) foi analisado por EMSA. A produção de NO foi medida por microscopia confocal em células carregadas com o cromóforo fluorescente DAR-4M-AM (5μM, 30min). RT-PCR revelou a presence constitutiva do RNAm de tlr-4 e Cd14 em pineais de rato. O estudo imunohistoquímico indicou uma marcação positiva para TLR4 em localização citoplasmática e nuclear, sendo abolida qualquer marcação na ausência do anticorpo. Um aumento na translocação nuclear de NFB foi observada nos animais tratados com LPS. LPS também levou a uma resposta funcional com aumento na reatividade da iNOS e aumento na produção de NO de maneira dependente de tempo e da concentração de LPS (0,1 to 10 μg/mL). O máximo aumento da produção de NO foi observado com LPS 1 μg/mL por 2 h. Este efeito foi inibido com o pré-tratamento com L-NAME (0.1mM, 30min) e 1400W (1μM, 30 min). Estes resultados demonstram que a glândula pineal de rato está instrumentada a responder ao desafio com LPS através da indução da via NFkB mediada por TLR4. Além disso, funcionalmente esta estimulação induz um significante aumento da imunoreatividade à iNOS e produção de NO. Estes dados corroboram com a hipótese do eixo imune-pineal com supressão da produção de melatonina no início de uma resposta de defesa. / Accumulating evidences put the pineal gland and the immune system reciprocally linked by bidirectional communication. Rat pineal gland constitutively activated NFkB, which plays a role on melatonin synthesis, is a preferential transduction pathway for cytokines and glucocorticoids (Ferreira et al., 2005; Fernandes et al., 2006). TNFα transiently inhibits, while corticosterone potentiates, noradrenaline-induced Aa-nat gene transcription, a key enzyme in melatonin synthesis. Lipopolysaccharides (LPS) are the major components of the outer membrane of Gram-negative bacteria, which makes them prime targets for recognition by the immune system. Toll-like receptor 4 (TLR4) conveys LPS signaling which induces expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and subsequent nitric oxide (NO) formation. An attempt has been made to demonstrate the expression of TLR4 in the rat pineal glands as well as the characterization of functional response and the transduction pathway following LPS challenge. Female Wistar rats (1-2 months) were used. Total RNA was extracted from control pineals and used in real time RT-PCR with specific primers against tlr-4 and Cd14 transcritps and the housekeeping gene Gapdh (internal control). For immunohistochemistry, the pineals cryosections (8μm) from perfused animals (Lanas fixative, 4% PAF, 15min) followed by fixation (4% PAF, 30min) were used with an antibody against rat TLR4, being the negative control performed in the absence of primary antibody. Pinealocytes were obtained by trypsinization followed by mechanical dispersion. The amount of NFB present in nuclear extracts of pinealocytes challenged with LPS (1μg/ml, 15min) was assayed by EMSA. NO production was measured by confocal microscopy in cells loaded with the fluorescent dye DAR-4M-AM (5μM, 30min). RT-PCR revealed specific constitutive tlr-4 and Cd14 mRNA levels in rat pineals. Immunohistochemistry (n=4) indicated TLR4-positive and -negative immunostaining in the nuclear and cytoplasmic compartments of the cells. All TLR4-positive immunostaining were significantly decreased when experiments were performed in the absence of the primary antibody. An increase in the nuclear translocation of NFKB was observed in LPS challenged cells. LPS (0.1 to 10 μg/mL) also lead to a functional response, as it increased the immunoreactivity of iNOS and a time- and concentration-dependent manner the level of NO in cultured pinealocytes. The maximal NO content induced by LPS 1.0 μg/mL was observed 2h after stimulation. Baseline levels were restored after 4-6h of LPS. The LPS stimulatory effect was fully abolished by the pre-treatments with L-NAME (0.1mM, 30min) and 1400W (1μM). Therefore, our data show that pinealocytes are instrumented for answering to LPS challenge through TLR4-induced NFkB pathway. In addition we observed that this stimulation induces a significant increase in iNOS immunoreactivity and NO production. These data corroborates to the hypothesis that pineal melatonin production is suppressed at the beginning of a defense response.

Estudos anteriores de literatura indicavam que o sistema renina-angiotensina II local pineal era de fundamental importância para a expressão plena da capacidade de síntese de melatonina induzida pela estimulação noradrenérgica pelos pinealócitos. Essa relação funcional estava na dependência de uma interação parácrina entre pinealócitos e astrócitos onde os astrócitos seriam os responsáveis pela síntese de angiotensina II que, liberada pela ação da noradrenalina, agiria em receptores do tipo AT1 existentes na membrana dos pinealócitos. O objetivo desse trabalho foi o de, uma vez estabelecida a metodologia de dissociação e cultivo dos tipos celulares, estudar a hipótese acima, além das possíveis vias de transdução intrapinealocitárias que levassem ao efeito potenciador da angiotensina II sobre a estimulação noradrenérgica no processo de síntese de melatonina. Os resultados mostraram que, diferentemente do que acontece com glândulas intactas ou com co-cultura (cultura contendo astrócitos e pinealócitos), a estimulação noradrenérgica de pinealócitos isolados não é passível de bloqueio por Losartan, uma droga bloqueadora de receptores AT1. Por outro lado, nas mesmas condições experimentais, a síntese de melatonina induzida pela estimulação noradrenérgica é passível de potenciação pela adição de angiotensina II , efeito esse, que é bloqueado pelo Losartan. Demonstrou-se, ainda, que a estimulação noradrenérgica de astrócitos isolados, provoca a liberação de angiotensina II por esse tipo celular. Demonstrou-se, ainda, que há a mobilização de pelo menos duas vias de transdução nos pinealócitos quando estimulados pela angiotensina II: aumento da concentração de cálcio intracelular e mobilização de processos de fosforilação em tirosina usando as vias das proteínas JAK/ STAT. Dessa forma, pelo presente trabalho pode- se especular que quando a glândula pineal é estimulada pela liberação de noradrenalina dos terminais simpáticos, ao mesmo tempo que esta age nos pinealócitos promovendo a via de síntese de melatonina, age, também, nos 7 astrócitos, liberando angiotensina II que, por sua vez, age nos pinealócitos potenciando a ação estimulatória da noradrenalina, levando a um aumento da síntese de melatonina. / We have previously demonstrated that Angiotensin II (Ang II) potentiates the noradrenaline-stimulated (Nor+) melatonin synthesis in the rat pineal gland [Baltatu et al.,J. Neurochem.(2002)80, 328-334]. The aim of the present paper was to study the possible paracrine interactions between glial cells and pinealocytes in the rat pineal gland. To accomplish this aim, after standard pineal cell dissociation we studied the two cellular types separated in different cell cultures, either of glial pineal cells or pinealocytes. First, we showed, using freshly dissociated pineal cells, that Losartan is able to reduce Nor+ induced melatonin synthesis, similarly to what happens with pineal glands culture. Noradrenaline stimulation is able to induce melatonin synthesis in glial cell-free pinealocytes cell culture, what is not blocked by Losartan. In this condition, Ang II is able to potentiated the Nor+ induced melatonin synthesis, an AngII effect that is blocked by Losartan. Moreover, Ang II stimulated pinealocytes show an increase in Ca2+ current as evaluated by confocal microscopy. On the other hand, pinealocytes-free glial cells cultures when stimulated by noradrenaline release Ang II in the culture medium. Taking into account the above results it is possible to speculate that in the intact pineal gland noradrenaline released by sympathetic terminals stimulated pinealocytes inducing the well know process of melatonin synthesis at the same time that stimulate glial cells that release AngII that acting through AT1 receptors in pinealocytes potentiate melatonin synthesis by the inducing an increase in the intracellular Ca2+ pool and tyrosine phosphorylation of JAK/STAT complex.

Estudos anteriores de literatura indicavam que o sistema renina-angiotensina II local pineal era de fundamental importância para a expressão plena da capacidade de síntese de melatonina induzida pela estimulação noradrenérgica pelos pinealócitos. Essa relação funcional estava na dependência de uma interação parácrina entre pinealócitos e astrócitos onde os astrócitos seriam os responsáveis pela síntese de angiotensina II que, liberada pela ação da noradrenalina, agiria em receptores do tipo AT1 existentes na membrana dos pinealócitos. O objetivo desse trabalho foi o de, uma vez estabelecida a metodologia de dissociação e cultivo dos tipos celulares, estudar a hipótese acima, além das possíveis vias de transdução intrapinealocitárias que levassem ao efeito potenciador da angiotensina II sobre a estimulação noradrenérgica no processo de síntese de melatonina. Os resultados mostraram que, diferentemente do que acontece com glândulas intactas ou com co-cultura (cultura contendo astrócitos e pinealócitos), a estimulação noradrenérgica de pinealócitos isolados não é passível de bloqueio por Losartan, uma droga bloqueadora de receptores AT1. Por outro lado, nas mesmas condições experimentais, a síntese de melatonina induzida pela estimulação noradrenérgica é passível de potenciação pela adição de angiotensina II , efeito esse, que é bloqueado pelo Losartan. Demonstrou-se, ainda, que a estimulação noradrenérgica de astrócitos isolados, provoca a liberação de angiotensina II por esse tipo celular. Demonstrou-se, ainda, que há a mobilização de pelo menos duas vias de transdução nos pinealócitos quando estimulados pela angiotensina II: aumento da concentração de cálcio intracelular e mobilização de processos de fosforilação em tirosina usando as vias das proteínas JAK/ STAT. Dessa forma, pelo presente trabalho pode- se especular que quando a glândula pineal é estimulada pela liberação de noradrenalina dos terminais simpáticos, ao mesmo tempo que esta age nos pinealócitos promovendo a via de síntese de melatonina, age, também, nos 7 astrócitos, liberando angiotensina II que, por sua vez, age nos pinealócitos potenciando a ação estimulatória da noradrenalina, levando a um aumento da síntese de melatonina. / We have previously demonstrated that Angiotensin II (Ang II) potentiates the noradrenaline-stimulated (Nor+) melatonin synthesis in the rat pineal gland [Baltatu et al.,J. Neurochem.(2002)80, 328-334]. The aim of the present paper was to study the possible paracrine interactions between glial cells and pinealocytes in the rat pineal gland. To accomplish this aim, after standard pineal cell dissociation we studied the two cellular types separated in different cell cultures, either of glial pineal cells or pinealocytes. First, we showed, using freshly dissociated pineal cells, that Losartan is able to reduce Nor+ induced melatonin synthesis, similarly to what happens with pineal glands culture. Noradrenaline stimulation is able to induce melatonin synthesis in glial cell-free pinealocytes cell culture, what is not blocked by Losartan. In this condition, Ang II is able to potentiated the Nor+ induced melatonin synthesis, an AngII effect that is blocked by Losartan. Moreover, Ang II stimulated pinealocytes show an increase in Ca2+ current as evaluated by confocal microscopy. On the other hand, pinealocytes-free glial cells cultures when stimulated by noradrenaline release Ang II in the culture medium. Taking into account the above results it is possible to speculate that in the intact pineal gland noradrenaline released by sympathetic terminals stimulated pinealocytes inducing the well know process of melatonin synthesis at the same time that stimulate glial cells that release AngII that acting through AT1 receptors in pinealocytes potentiate melatonin synthesis by the inducing an increase in the intracellular Ca2+ pool and tyrosine phosphorylation of JAK/STAT complex.

Esse trabalho teve como objetivo estudar os efeitos do glutamato sobre a síntese de melatonina, avaliando a participação dos diferentes tipos de receptores e uma possível interação entre pinealócitos e astrócitos; além de avaliar o papel do fator de transcrição NF-<font face=\"symbol\">kB nos efeitos modulatórios do glutamato. Para tanto, glândulas pineais de ratos foram mantidas em cultura e estimuladas com diferentes concentrações de glutamato e também com diversos agonistas glutamatérgicos. Culturas de pinealócitos isolados e co-culturas de pinealócitos e astrócitos também foram usadas. A melatonina foi quantificada em HPLC com detecção eletroquímica. Para caracterização dos receptores de glutamato foi feita uma análise de RT-PCR, e a ativação do NF-<font face=\"symbol\">kB foi avaliada por ensaio de gel de retardo. Os resultados mostram que o glutamato exerce um efeito inibitório sobre a síntese de melatonina através de uma ação sobre os receptores metabotrópicos dos grupos I e II e ionotrópico do tipo AMPA e que as ações do glutamato são mediadas pela ativação do NF-<font face=\"symbol\">kB dos astrócitos. / The aim of this work was to study the effects of glutamate on melatonin synthesis, investigating the glutamate receptors involved and a possible interaction between the two predominant cell types of the pineal gland, pinealocytes and astrocytes; moreover, it was investigated the involvement of the transcription factor NF-<font face=\"symbol\">kB on the glutamate effects. To accomplish this, pineal glands were kept in culture and stimulated with glutamate or glutamate agonists. Isolated pinealocytes or in association with astrocytes in culture were also stimulated with glutamate. Melatonin was quantified by HPLC with electrochemical detection. Glutamate receptors were characterized by RT-PCR and NF-<font face=\"symbol\">kB activation was evaluated by gel shift assay. The data showed that glutamate has an inhibitory effect on melatonin synthesis that is mediated by groups I and II glutamate metabotropic receptors and AMPA receptor and that this effect involves the activation of astrocytic NF-<font face=\"symbol\">kB.

Esse trabalho teve como objetivo estudar os efeitos do glutamato sobre a síntese de melatonina, avaliando a participação dos diferentes tipos de receptores e uma possível interação entre pinealócitos e astrócitos; além de avaliar o papel do fator de transcrição NF-<font face=\"symbol\">kB nos efeitos modulatórios do glutamato. Para tanto, glândulas pineais de ratos foram mantidas em cultura e estimuladas com diferentes concentrações de glutamato e também com diversos agonistas glutamatérgicos. Culturas de pinealócitos isolados e co-culturas de pinealócitos e astrócitos também foram usadas. A melatonina foi quantificada em HPLC com detecção eletroquímica. Para caracterização dos receptores de glutamato foi feita uma análise de RT-PCR, e a ativação do NF-<font face=\"symbol\">kB foi avaliada por ensaio de gel de retardo. Os resultados mostram que o glutamato exerce um efeito inibitório sobre a síntese de melatonina através de uma ação sobre os receptores metabotrópicos dos grupos I e II e ionotrópico do tipo AMPA e que as ações do glutamato são mediadas pela ativação do NF-<font face=\"symbol\">kB dos astrócitos. / The aim of this work was to study the effects of glutamate on melatonin synthesis, investigating the glutamate receptors involved and a possible interaction between the two predominant cell types of the pineal gland, pinealocytes and astrocytes; moreover, it was investigated the involvement of the transcription factor NF-<font face=\"symbol\">kB on the glutamate effects. To accomplish this, pineal glands were kept in culture and stimulated with glutamate or glutamate agonists. Isolated pinealocytes or in association with astrocytes in culture were also stimulated with glutamate. Melatonin was quantified by HPLC with electrochemical detection. Glutamate receptors were characterized by RT-PCR and NF-<font face=\"symbol\">kB activation was evaluated by gel shift assay. The data showed that glutamate has an inhibitory effect on melatonin synthesis that is mediated by groups I and II glutamate metabotropic receptors and AMPA receptor and that this effect involves the activation of astrocytic NF-<font face=\"symbol\">kB.