A glândula pineal é um órgão transdutor da informação fótica ambiental para o meio interno do organismo, provendo melatonina para a circulação sistêmica, a qual sinaliza o período de escuro e sincroniza os ritmos endógenos de acordo com as variações ambientais (Reiter, 1993). Várias evidências apontam para uma comunicação bidirecional entre a pineal e o sistema imune. Foi identificado na glândula pineal de ratos o fator de transcrição NFkB, uma via de trasncrição preferencial para citocinas e glicocorticóides e que modula a síntese de melatonina. TNFα inibe transientemente enquanto corticosterona potencia a transcrição do gene da Aa-nat, enzima chave na síntese de melatonina (Ferreira et al., 2005; Fernandes et al., 2006). LPS é um constituinte da membrana de bactérias gram-negativas e potente indutor de inflamação sistêmica e local. A sinalização de LPS é mediada por receptores toll-like 4 (TLR4) que leva à indução da enzima sintase de óxido nítrico induzivel (iNOS) e subsequente formação de óxido nítrico (NO). O objetivo deste trabalho foi demonstrar a expressão de TLR4 e a resposta funcional da via de transdução de LPS. Foram usados ratos Wistar fêmeas (1-2 meses). O RNAm total foi extraído de pineais controle e usados em RT-PCR com primers específcos contra os transcritos tlr-4, Cd14 e o controle interno Gapdh. Para a imunohistoquímica, secções de pineal de animais perfundidos com solução fixadora seguida de fixação com PAF 4% foram usadas com o anticorpo contra TLR4, sendo o controle negativo obtido na ausência de anticorpo. Os pinealocitos foram obtidos por tripsinização seguida de dispersão mecânica. O acúmulo de NFkB em extratos nucleares de pineais de animais tratados in vivo com LPS (1 mg/kg, iv, 2h) foi analisado por EMSA. A produção de NO foi medida por microscopia confocal em células carregadas com o cromóforo fluorescente DAR-4M-AM (5μM, 30min). RT-PCR revelou a presence constitutiva do RNAm de tlr-4 e Cd14 em pineais de rato. O estudo imunohistoquímico indicou uma marcação positiva para TLR4 em localização citoplasmática e nuclear, sendo abolida qualquer marcação na ausência do anticorpo. Um aumento na translocação nuclear de NFB foi observada nos animais tratados com LPS. LPS também levou a uma resposta funcional com aumento na reatividade da iNOS e aumento na produção de NO de maneira dependente de tempo e da concentração de LPS (0,1 to 10 μg/mL). O máximo aumento da produção de NO foi observado com LPS 1 μg/mL por 2 h. Este efeito foi inibido com o pré-tratamento com L-NAME (0.1mM, 30min) e 1400W (1μM, 30 min). Estes resultados demonstram que a glândula pineal de rato está instrumentada a responder ao desafio com LPS através da indução da via NFkB mediada por TLR4. Além disso, funcionalmente esta estimulação induz um significante aumento da imunoreatividade à iNOS e produção de NO. Estes dados corroboram com a hipótese do eixo imune-pineal com supressão da produção de melatonina no início de uma resposta de defesa. / Accumulating evidences put the pineal gland and the immune system reciprocally linked by bidirectional communication. Rat pineal gland constitutively activated NFkB, which plays a role on melatonin synthesis, is a preferential transduction pathway for cytokines and glucocorticoids (Ferreira et al., 2005; Fernandes et al., 2006). TNFα transiently inhibits, while corticosterone potentiates, noradrenaline-induced Aa-nat gene transcription, a key enzyme in melatonin synthesis. Lipopolysaccharides (LPS) are the major components of the outer membrane of Gram-negative bacteria, which makes them prime targets for recognition by the immune system. Toll-like receptor 4 (TLR4) conveys LPS signaling which induces expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and subsequent nitric oxide (NO) formation. An attempt has been made to demonstrate the expression of TLR4 in the rat pineal glands as well as the characterization of functional response and the transduction pathway following LPS challenge. Female Wistar rats (1-2 months) were used. Total RNA was extracted from control pineals and used in real time RT-PCR with specific primers against tlr-4 and Cd14 transcritps and the housekeeping gene Gapdh (internal control). For immunohistochemistry, the pineals cryosections (8μm) from perfused animals (Lanas fixative, 4% PAF, 15min) followed by fixation (4% PAF, 30min) were used with an antibody against rat TLR4, being the negative control performed in the absence of primary antibody. Pinealocytes were obtained by trypsinization followed by mechanical dispersion. The amount of NFB present in nuclear extracts of pinealocytes challenged with LPS (1μg/ml, 15min) was assayed by EMSA. NO production was measured by confocal microscopy in cells loaded with the fluorescent dye DAR-4M-AM (5μM, 30min). RT-PCR revealed specific constitutive tlr-4 and Cd14 mRNA levels in rat pineals. Immunohistochemistry (n=4) indicated TLR4-positive and -negative immunostaining in the nuclear and cytoplasmic compartments of the cells. All TLR4-positive immunostaining were significantly decreased when experiments were performed in the absence of the primary antibody. An increase in the nuclear translocation of NFKB was observed in LPS challenged cells. LPS (0.1 to 10 μg/mL) also lead to a functional response, as it increased the immunoreactivity of iNOS and a time- and concentration-dependent manner the level of NO in cultured pinealocytes. The maximal NO content induced by LPS 1.0 μg/mL was observed 2h after stimulation. Baseline levels were restored after 4-6h of LPS. The LPS stimulatory effect was fully abolished by the pre-treatments with L-NAME (0.1mM, 30min) and 1400W (1μM). Therefore, our data show that pinealocytes are instrumented for answering to LPS challenge through TLR4-induced NFkB pathway. In addition we observed that this stimulation induces a significant increase in iNOS immunoreactivity and NO production. These data corroborates to the hypothesis that pineal melatonin production is suppressed at the beginning of a defense response.

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2331593 bytes, checksum: 773c3f24392a37cc5990eecb7f6f2761 (MD5) Previous issue date: 2010-08-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Imidazolidinic derivates present a wide range of biological activities, such as anti-arrhythmic and anti-hypertensive. The vasorelaxant effect of six Imidazolinic compounds was evaluated in this study. Among of this, the cardiovascular effects induced by IM-7 were evaluated using in vivo and in vitro assays. HPA-01 and IM-3 produced a reduced relaxation of rat mesenteric artery rings contracted by phenylephrine (PHE) (MR = 43.15 ± 7.69%; MR = 54.08 ± 6.59%, respectively). IM-6 e IM-2 showed vasoconstictor effects in rigns with endothelium and vasorelaxant effect when endothelium was removed. Meanwhile, HPA-02 did not induce significant vasorelaxant effect. In normotensive non-anesthetized rats, the pretreatment with L-NAME or hexamethonium did not affect the hypotensive and bradicardic effects induced by IM-7. In isolated rat atrial preparations from normotensive, IM-7 (1pM-1 mM) produced negative chronotropic (MR = 65.45 ± 11.4%; pD2 = 3.94 ± 0.02) and inotropic (MR = 68.58 ± 8,0% ; pD2 = 6.74 ± 0.05) effects. which were attenuated by atropine. In hypertensive non-anesthetized rats IM-7 (1, 5, 10, 20 e 30 mg/Kg, i.v.) induced hypotensive and bradicardic effects. These effects were abolished after pre-treatment with atropine (2 mg/Kg, i.v.). In isolated hypertensive rat mesenteric artery rings IM-7 (1pM-1 mM), elicited concentration-dependent relaxation of PHE-induced contraction (pD2 = 5.64  0.09). After removal of the vascular endothelium IM-7 effects were significantly attenuated (pD2 = 3.8 ± 0.07 p < 0.001), suggesting the participation of endothelium derived relaxant factors in the IM-7 induced vasorelaxant effect. Similar results were obtained in the presence of L-NAME (100 M), ODQ (10μM), or atropine (100 nM). In endothelium denuded rings incubed with KCl 20 mM the relaxant response was not attenuated. Furthermore, in absence of extracellular calcium, IM-7 concentration-dependently depressed the vasoconstrictions derived from CaCl2. Similar results were obtained in contractions induced by 5-HT, cumulative administration of PHE or Na3VO4. These results demonstrate that IM-7 induced best pharmacological profile comparing with the other imidazolidinic derivatives. In normotensive rats, the inotropic e chronotropic effects induced by IM-7 are probably due to activation of muscarinic receptors. In hypertensive rats, the hypotensive, bradicardic and vasorelaxant effects seem to involve muscarinic receptor activation. Furthermore, IM-7 exerts a vasorelaxant effect by inhibiting calcium influx and contractile apparatus. / Derivados imidazolidínicos apresentam uma ampla variedade de atividades biológicas, dentre elas a antiarrítmica e anti-hipertensiva. O efeito vasorerrelaxante de seis derivados hidantoínicos foi avaliado neste estudo. Dentre estas substâncias, os efeitos cardiovasculares induzidos por IM-7 foram avaliados empregando-se abordagens in vivo e in vitro. Em anéis de artéria mesentérica superior de rato, as substâncias HPA-01 e IM-3 apresentaram discreto efeito vasorrelaxante. Concentrações cumulativas de IM-2 e IM-6 induziram vasoconstrição e vasorrelaxamento na presença e na ausência do endotélio, respectivamente, enquanto HPA-02 não causou efeitos significativos. Em ratos normotensos não anestesiados, o bloqueio com hexametônio ou com L-NAME não foi capaz de alterar os efeitos hipotensor e bradicárdico induzidos por IM-7. Em átrio isolado de rato, este derivado hidantoínico causou efeitos cronotrópico (Emáx = 65,45 ± 11,4% ; pD2 = 3,94 ± 0,02 ) e inotrópico (Emáx = 68,58 ± 8,0% ; pD2 = 6,74 ± 0,05 ) negativos, que foram atenuados na presença da atropina. Em ratos com hipertensão L-NAME não-anestesiados, IM-7 (1, 5, 10, 20 e 30 mg/Kg, i.v.) induziu hipotensão e bradicardia, os quais foram abolidos na presença da atropina (2 mg/Kg, i.v.). Em artéria mesentérica superior isolada de rato hipertenso, IM-7 induziu vasorrelaxamento em anéis pré-contraídos com fenilefrina (FEN) (pD2 = 5,64  0,09) e esse efeito foi significantemente atenuado após a remoção do endotélio (pD2 = 3,8 ± 0,07 p < 0,001), sugerindo a participação de fatores relaxantes endoteliais. Resultados similares foram obtidos após a incubação de L-NAME (100 M), ODQ (10 M) ou atropina (100 nM). Em anéis sem endotélio, incubados com KCl 20 mM, o vasorrelaxamento induzido por IM-7 não foi atenuado. IM-7 reduziu contrações induzidas por 80 mM de KCl em anéis sem endotélio (pD2 = 3,84 ± 0,05) de maneira similar ao observado em contrações induzidas por fenilefrina. Concentrações isoladas de IM-7 (10-5, 10-4 e 10-3) reduziram significativamente as contrações induzidas por CaCl2. Resultados similares foram observados nas contrações induzidas por serotonina (5-HT) e pela administração cumulativa de FEN ou Na3VO4. As contrações transientes induzidas por FEN (10 M) não foram alteradas. Estes resultados demonstram que dentre os derivados hidantoínicos avaliados, IM-7 apresentou melhor atividade farmacológica. Em ratos normotensos, os efeitos inotrópicos e cronotrópicos negativos induzidos por esta substância, possivelmente decorrentes da ativação muscarínica, justificam a bradicardia observada em estudos anteriores. O vasorrelaxamento independente de endotélio provavelmente é decorrente da atuação desta substância sobre a maquinaria contrátil na musculatura lisa vascular. Em ratos hipertensos, IM-7 induziu hipotensão, bradicardia e vasorrelaxamento provavelmente de origem muscarínica. Além disso, este derivado hidantoínico também parece ser capaz de inibir o influxo de cálcio e atuar na maquinaria contrátil para promover vasodilatação

A glândula pineal é um órgão transdutor da informação fótica ambiental para o meio interno do organismo, provendo melatonina para a circulação sistêmica, a qual sinaliza o período de escuro e sincroniza os ritmos endógenos de acordo com as variações ambientais (Reiter, 1993). Várias evidências apontam para uma comunicação bidirecional entre a pineal e o sistema imune. Foi identificado na glândula pineal de ratos o fator de transcrição NFkB, uma via de trasncrição preferencial para citocinas e glicocorticóides e que modula a síntese de melatonina. TNF&#945; inibe transientemente enquanto corticosterona potencia a transcrição do gene da Aa-nat, enzima chave na síntese de melatonina (Ferreira et al., 2005; Fernandes et al., 2006). LPS é um constituinte da membrana de bactérias gram-negativas e potente indutor de inflamação sistêmica e local. A sinalização de LPS é mediada por receptores toll-like 4 (TLR4) que leva à indução da enzima sintase de óxido nítrico induzivel (iNOS) e subsequente formação de óxido nítrico (NO). O objetivo deste trabalho foi demonstrar a expressão de TLR4 e a resposta funcional da via de transdução de LPS. Foram usados ratos Wistar fêmeas (1-2 meses). O RNAm total foi extraído de pineais controle e usados em RT-PCR com primers específcos contra os transcritos tlr-4, Cd14 e o controle interno Gapdh. Para a imunohistoquímica, secções de pineal de animais perfundidos com solução fixadora seguida de fixação com PAF 4% foram usadas com o anticorpo contra TLR4, sendo o controle negativo obtido na ausência de anticorpo. Os pinealocitos foram obtidos por tripsinização seguida de dispersão mecânica. O acúmulo de NFkB em extratos nucleares de pineais de animais tratados in vivo com LPS (1 mg/kg, iv, 2h) foi analisado por EMSA. A produção de NO foi medida por microscopia confocal em células carregadas com o cromóforo fluorescente DAR-4M-AM (5&#956;M, 30min). RT-PCR revelou a presence constitutiva do RNAm de tlr-4 e Cd14 em pineais de rato. O estudo imunohistoquímico indicou uma marcação positiva para TLR4 em localização citoplasmática e nuclear, sendo abolida qualquer marcação na ausência do anticorpo. Um aumento na translocação nuclear de NFB foi observada nos animais tratados com LPS. LPS também levou a uma resposta funcional com aumento na reatividade da iNOS e aumento na produção de NO de maneira dependente de tempo e da concentração de LPS (0,1 to 10 &#956;g/mL). O máximo aumento da produção de NO foi observado com LPS 1 &#956;g/mL por 2 h. Este efeito foi inibido com o pré-tratamento com L-NAME (0.1mM, 30min) e 1400W (1&#956;M, 30 min). Estes resultados demonstram que a glândula pineal de rato está instrumentada a responder ao desafio com LPS através da indução da via NFkB mediada por TLR4. Além disso, funcionalmente esta estimulação induz um significante aumento da imunoreatividade à iNOS e produção de NO. Estes dados corroboram com a hipótese do eixo imune-pineal com supressão da produção de melatonina no início de uma resposta de defesa. / Accumulating evidences put the pineal gland and the immune system reciprocally linked by bidirectional communication. Rat pineal gland constitutively activated NFkB, which plays a role on melatonin synthesis, is a preferential transduction pathway for cytokines and glucocorticoids (Ferreira et al., 2005; Fernandes et al., 2006). TNF&#945; transiently inhibits, while corticosterone potentiates, noradrenaline-induced Aa-nat gene transcription, a key enzyme in melatonin synthesis. Lipopolysaccharides (LPS) are the major components of the outer membrane of Gram-negative bacteria, which makes them prime targets for recognition by the immune system. Toll-like receptor 4 (TLR4) conveys LPS signaling which induces expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and subsequent nitric oxide (NO) formation. An attempt has been made to demonstrate the expression of TLR4 in the rat pineal glands as well as the characterization of functional response and the transduction pathway following LPS challenge. Female Wistar rats (1-2 months) were used. Total RNA was extracted from control pineals and used in real time RT-PCR with specific primers against tlr-4 and Cd14 transcritps and the housekeeping gene Gapdh (internal control). For immunohistochemistry, the pineals cryosections (8&#956;m) from perfused animals (Lanas fixative, 4% PAF, 15min) followed by fixation (4% PAF, 30min) were used with an antibody against rat TLR4, being the negative control performed in the absence of primary antibody. Pinealocytes were obtained by trypsinization followed by mechanical dispersion. The amount of NFB present in nuclear extracts of pinealocytes challenged with LPS (1&#956;g/ml, 15min) was assayed by EMSA. NO production was measured by confocal microscopy in cells loaded with the fluorescent dye DAR-4M-AM (5&#956;M, 30min). RT-PCR revealed specific constitutive tlr-4 and Cd14 mRNA levels in rat pineals. Immunohistochemistry (n=4) indicated TLR4-positive and -negative immunostaining in the nuclear and cytoplasmic compartments of the cells. All TLR4-positive immunostaining were significantly decreased when experiments were performed in the absence of the primary antibody. An increase in the nuclear translocation of NFKB was observed in LPS challenged cells. LPS (0.1 to 10 &#956;g/mL) also lead to a functional response, as it increased the immunoreactivity of iNOS and a time- and concentration-dependent manner the level of NO in cultured pinealocytes. The maximal NO content induced by LPS 1.0 &#956;g/mL was observed 2h after stimulation. Baseline levels were restored after 4-6h of LPS. The LPS stimulatory effect was fully abolished by the pre-treatments with L-NAME (0.1mM, 30min) and 1400W (1&#956;M). Therefore, our data show that pinealocytes are instrumented for answering to LPS challenge through TLR4-induced NFkB pathway. In addition we observed that this stimulation induces a significant increase in iNOS immunoreactivity and NO production. These data corroborates to the hypothesis that pineal melatonin production is suppressed at the beginning of a defense response.

Nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa vem descrevendo vários efeitos da SAA em células do sistema imune no que diz respeito à expressão e liberação de citocinas pró-inflamatórias. Neste estudo centramos nossa atenção na verificação dos efeitos da SAA sobre células mononucleares. Para isto, usamos três modelos experimentais. Em murinos, descrevemos a habilidade da SAA induzir a produção de NO por macrófagos peritoneais e, com uso de animais knockout para TLR4, sugerimos que SAA seja um ligante endógeno do TLR4. Em células mononucleares de sangue periférico humano, a SAA induz a expressão e liberação de CCL20, uma quimiocina importante na transição da resposta imune inata para adaptativa, bem como a expressão dos fatores M-CSF e VEGF. Em células THP-1, mostramos a cinética de fosforilação de proteínas tirosina quinases promovida pela SAA e comparamos com LPS, um estímulo pró-inflamatório clássico. Ainda em células THP-1 mostramos que a SAA induz a fosforilação de duas proteínas importantes no processo inflamatório por induzirem a ativação de NF&#954;B; a p38 e a ERK1/2. Com este estudo contribuímos com o conhecimento a respeito do papel regulatório da SAA em células mononucleares. A ação da SAA sobre estas células torna-se importante, pois estas são cruciais na resposta imune inata e também atuam como células acessórias na resposta imune adaptativa. Desta forma, evidencia-se que, no processo de fase aguda, a expressão e a síntese de SAA resultam na modulação de etapas que controlam este processo e sua progressão. / In the past few years, our research group has described various effects of serum amyloid A (SAA) on cells of the immune system regarding the expression and release of pro-inflammatory cytokines. In this study we have focused on the effects of SAA on mononuclear cells. In order to do this, we have used three experimental models. In the murine experimental model, we described SAA\'s ability to induce the production of NO through peritoneal macrophages and, by using knockout animals for TLR4, we suggested that SAA is an endogenous agonist of TLR4. In mononuclear cells of peripheral human blood, SAA induced the expression and release of CCL20, an important chemokine in the transition from the innate to the adaptive immune response, as well as the expression of M-CSF and VEGF-factors. In THP-1 cells, we showed the phosporylation kinetics of tyrosine protein kinases induced by SAA, and we compared it to LPS, a classic pro-inflammatory stimulus. We also demonstrated, in THP-1 cells, that SAA induced the phosphorylation of two proteins, namely p38 and ERK1/2, that are crucial in the inflammatory process because they induce the activation of transcription factors. With this study, we contributed to the knowledge of the regulatory role of SAA in mononuclear cells. Activity of SAA on these cells is highly important, for they are crucial in the innate immune response and act as accessory cells in the adaptive immune response. Hence it is evident that, in the acute phase process, the expression and synthesis of SAA result in the modulation of the phases that control this process and its progression.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseESCQ.pdf: 16215443 bytes, checksum: 498b5d348520a9ccfd63ba1b85af9b1c (MD5) Previous issue date: 2007-07-15 / Financiadora de Estudos e Projetos / Osteoporosis is attributed to an imbalance between bone formation and resorption, followed by bone mass loss and microarchitectural deterioration, leading to increased bone fragility and fracture risk. Nitric oxide (NO) is a signaling molecule with important regulatory effects on bone cell function. Nitric oxide donor nitroglycerin has been reported to alleviate ovariectomy-induced and corticosteroid-induced bone loss. The aim of the present study was to investigate the effect of NO on cancellous and cortical bone of orchiectomized rats. A total of 98 male Wistar rats (four months old) were randomly divided in the following groups - Experiment I: intact treated with saline (stomacal gavage - gv), orchiectomized treated with saline (gv), and orchiectomized treated with NO donor isosorbide dinitrate - ISDN (gv); Experiment II: intact treated with saline (subcutaneous injection - sc), orchiectomized treated with saline (sc), and orchiectomized treated with NO synthase inhibitor NG-nitro-L-arginine-methylester - L-NAME (sc); Experiment III: intact treated with saline (intraperitoneous injection - ip), orchiectomized treated with saline (ip), and orchiectomized treated with NO precursor L-arginine (ip); Basal group: one group was killed at the beginning of the study (four months old) and served as a baseline group. The animals were killed after 8 weeks of treatment. At death, both femurs and lumbar vertebrae (L5-6) were obtained from each rat, and changes in both cancellous and cortical bone mass and biomechanical competence were assessed. The treatment with NO donor isosorbide dinitrate protected the cortical bone mass of adult rats from the deleterious effects of castration. The protective effect of ISDN treatment on the cancellous bone mass was not as significant as the one observed on the cortical bone. The L-NAME treatment did not increase the deleterious effects induced by orchiectomy in both cancellous and cortical bone mass. No effect was observed with the L-arginine treatment, in the dose used in this study. In conclusion, this study suggest that NO donor isosorbide dinitrate can be used in the future as an alternative pharmacological strategy for the prevention of androgen deficiency osteoporosis, in men with proven hypogonadism and in eugonadal men. / A osteoporose é atribuída a um desequilíbrio entre a reabsorção e a formação óssea, seguido por perda de massa óssea e deterioração da microarquitetura óssea, levando ao aumento da fragilidade óssea e do risco de fraturas. O óxido nítrico (NO) é uma molécula sinalizadora com efeito regulatório importante sobre a função celular óssea. A nitroglicerina, um doador de NO, tem sido mostrada como uma substância eficiente para atenuar perdas ósseas induzidas por ovariectomia e por corticosteróide. O objetivo do presente estudo foi investigar o efeito do NO sobre o osso trabecular e o osso cortical de ratos orquiectomizados. Um total de noventa e oito ratos Wistar com quatro meses de idade foram aleatoriamente divididos nos seguintes grupos: Experimento 1 = intactos tratados com salina (gavagem estomacal - gv), orquiectomizados tratados com salina (gv), orquiectomizados tratados com o doador de NO dinitrato de isossorbida ISDN (gv); Experimento 2 = intactos tratados com salina (subcutânea - sc), orquiectomizados tratados com salina (sc), orquiectomizados tratados com o inibidor da síntese de NO NG-nitro-L-arginina-metil ester - L-NAME (sc); Experimento 3 = intactos tratados com salina (intraperitonial -ip), orquiectomizados tratados com salina (ip), orquiectomizados tratados com o precursor de NO L-Arginina - L-ARG (ip); Basal, um grupo foi sacrificado no início do estudo (quatro meses de idade) para servir como linha de base. Os animais foram sacrificados por decapitação após oito semanas de tratamento. Os fêmures e as vértebras lombares (L5 e L6) foram retiradas de cada animal para verificação das mudanças que ocorreram na massa óssea e competência biomecânica do osso trabecular e cortical de cada grupo experimental. O tratamento com o doador de NO, ISDN, preveniu os efeitos deletérios da orquiectomia sobre o osso cortical e atenuou estes efeitos sobre o osso trabecular. O tratamento com L-NAME não intensificou o efeito osteopênico da castração e ainda amenizou tal efeito tanto no osso cortical quanto no osso trabecular. A suplementação com L-arginina realizada durante o período de oito semanas, na dose utilizada, não produziu efeitos significativos. Em conclusão, este estudo sugere que o doador de NO dinitrato de isossorbida pode ser usado no futuro como uma estratégia farmacológica alternativa para a prevenção de osteoporose causada por deficiência androgênica, que acomete homens portadores de hipogonadismo ou são submetidos a orquiectomia.

Nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa vem descrevendo vários efeitos da SAA em células do sistema imune no que diz respeito à expressão e liberação de citocinas pró-inflamatórias. Neste estudo centramos nossa atenção na verificação dos efeitos da SAA sobre células mononucleares. Para isto, usamos três modelos experimentais. Em murinos, descrevemos a habilidade da SAA induzir a produção de NO por macrófagos peritoneais e, com uso de animais knockout para TLR4, sugerimos que SAA seja um ligante endógeno do TLR4. Em células mononucleares de sangue periférico humano, a SAA induz a expressão e liberação de CCL20, uma quimiocina importante na transição da resposta imune inata para adaptativa, bem como a expressão dos fatores M-CSF e VEGF. Em células THP-1, mostramos a cinética de fosforilação de proteínas tirosina quinases promovida pela SAA e comparamos com LPS, um estímulo pró-inflamatório clássico. Ainda em células THP-1 mostramos que a SAA induz a fosforilação de duas proteínas importantes no processo inflamatório por induzirem a ativação de NF&#954;B; a p38 e a ERK1/2. Com este estudo contribuímos com o conhecimento a respeito do papel regulatório da SAA em células mononucleares. A ação da SAA sobre estas células torna-se importante, pois estas são cruciais na resposta imune inata e também atuam como células acessórias na resposta imune adaptativa. Desta forma, evidencia-se que, no processo de fase aguda, a expressão e a síntese de SAA resultam na modulação de etapas que controlam este processo e sua progressão. / In the past few years, our research group has described various effects of serum amyloid A (SAA) on cells of the immune system regarding the expression and release of pro-inflammatory cytokines. In this study we have focused on the effects of SAA on mononuclear cells. In order to do this, we have used three experimental models. In the murine experimental model, we described SAA\'s ability to induce the production of NO through peritoneal macrophages and, by using knockout animals for TLR4, we suggested that SAA is an endogenous agonist of TLR4. In mononuclear cells of peripheral human blood, SAA induced the expression and release of CCL20, an important chemokine in the transition from the innate to the adaptive immune response, as well as the expression of M-CSF and VEGF-factors. In THP-1 cells, we showed the phosporylation kinetics of tyrosine protein kinases induced by SAA, and we compared it to LPS, a classic pro-inflammatory stimulus. We also demonstrated, in THP-1 cells, that SAA induced the phosphorylation of two proteins, namely p38 and ERK1/2, that are crucial in the inflammatory process because they induce the activation of transcription factors. With this study, we contributed to the knowledge of the regulatory role of SAA in mononuclear cells. Activity of SAA on these cells is highly important, for they are crucial in the innate immune response and act as accessory cells in the adaptive immune response. Hence it is evident that, in the acute phase process, the expression and synthesis of SAA result in the modulation of the phases that control this process and its progression.