Made available in DSpace on 2014-10-09T12:52:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Um método de cromatografia líquida de alta eficiência por fase reversa (RP-HPLC) para análise qualitativa e quantitativa do hormônio folículo estimulante humano íntegro (hFSH), foi estabelecido e validado quanto à exatidão, precisão e sensibilidade. O FSH humano é um hormônio glicoprotéico dimérico largamente utilizado em medicina reprodutiva tanto para diagnóstico quanto para terapia. A metodologia desenvolvida preserva a integridade da proteína, permitindo a análise da forma heterodimérica intacta, e não somente de suas subunidades, como é normalmente obtida na maioria das condições geralmente empregadas. Esta técnica foi também utilizada para a comparação da hidrofobicidade relativa de preparações de hFSH hipofisária, urinária e derivadas de células de ovário de hamster chinês (CHO) bem como de outros dois hormônios glicoprotéicos, sintetizados na hipófise anterior: hormônio humano estimulante da tireóide (hTSH) e hormônio luteinizante humano (hLH). O menos hidrofóbico dos três hormônios analisados foi o hFSH, seguido do hTSH e do hLH. Uma diferença significativa (p<0,005) foi observada entre o tempo de retenção (tR) das preparações hipofisária e recombinante de hFSH, refletindo diferenças estruturais nas suas cadeias de carboidratos. Duas isoformas principais foram detectadas no hFSH urinário, incluindo uma forma que foi significativamente diferente (p<0,005) das preparações hipofisária e recombinante. Foram demonstradas linearidade da curva dose-resposta (r=0,9965, n=15) para esta metodologia de RP-HPLC, bem como uma precisão inter-ensaio, cujo coeficiente de variação é menor que 4%, para a quantificação de diferentes preparações de hFSH e uma sensibilidade da ordem de 40 ng. Foram também analisados o comportamento cromatográfico e a hidrofobicidade relativa das subunidades individuais das preparações recombinantes e hipofisária de hFSH. Além disso, a exata massa molecular das subunidades individuais de hFSH e do heterodímero foram simultaneamente determinadas por espectrometria de massa MALDI-TOF. A presente metodologia representa, em nossa opinião, uma ferramenta essencial para a caracterização e controle de qualidade deste hormônio, que ainda não consta das principais farmacopéias. / Dissertacao (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Mammotropes were successfully identified in the anterior pituitary gland of Miniopterus schreibersii using immunocytochemical (ICC) staining at the light and electron microscopy level. Mammotropes were distributed throughout the gland, were polygonal in shape and during secretory activity contained numerous large secretory granules (350 - 800nm). Using double ICC labelling, prolactin and growth hormone were never co-localiszed and found in individual cells only. Plasma prolactin levels were successfully measured on a monthly basis using radioimmunoassay and monthly pituitary prolactin levels were quantified using morphometric analysis of immunogold ICC staining and densitometry with polyacrylamide gels. Seasonal changes in the ultrastructure of mammotropes, and pituitary and plasma prolactin concentrations in female Miniopterus schreibersii indicated that there was an increase in prolactin secretion during the second half of the period of delayed implantation and that prolactin secretion remained elevated during normal embryonic development and lactation. This suggests that prolactin may be part of the luteotropic and lactogenic complex, and that the hormone might be responsible for terminating the period of delayed implantation. The latter is supported by experiments, where exogenous prolactin initiated precocious implantation during early delayed implantation, and treatment with bromocryptine (which inhibits prolactin synthesis) retarded implantation. Activation of mammotropes to synthesise prolactin and an increase of plasma prolactin levels occurred shortly after the winter solstice (21 June), suggesting that increasing daylength may be the environmental cue, which terminates the period of delayed implantation in Miniopterus schreibersii.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / LHX3 is a LIM-homeodomain transcription factor that has essential roles in pituitary and nervous system development in mammals. Children who are homozygous for recessive mutations in the LHX3 gene present with combined pituitary hormone deficiency disease (CPHD) characterized by deficits of multiple anterior pituitary hormones. Most LHX3 patients also present with additional defects associated with the nervous system including a characteristic limited head rotation and sometimes deafness. However, of the 10 types of LHX3 mutation described to date, one mutation type (W224ter) does not result in the limited head rotation, defining a new form of the disease. W224ter patients have CPHD but do not have nervous system symptoms. Whereas other mutations in LHX3 cause loss of the entire protein or its activity, the W224ter mutation causes specific loss of the carboxyl terminal of the LHX3 protein—a region that we have shown to contain critical regulatory domains for pituitary gene activation. To better understand the molecular and cellular etiology of CPHD associated with LHX3 gene mutations, I have generated knock-in mice that model the human LHX3 W224ter disease. The resulting mice display marked dwarfism, thyroid disease, female infertility, and reduced male fertility. Immunohistochemistry, real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR), and enzyme-linked immunosorbant assays (ELISA) were used to measure hormones and regulatory factor protein and RNA levels, an approach which is not feasible with human patients. We have generated a novel mouse model of human pediatric CPHD. Our findings are consistent with the hypothesis that the actions of the LHX3 factor are molecularly separable in the nervous system and pituitary gland.

Bibliography: leaves 182-210.

published_or_final_version / abstract / toc / Zoology / Master / Master of Philosophy

The hypothalamic-pituitary-thyroid axis operates to maintain the circulating concentration of thyroid hormones. Thyrotropin releasing hormone (TRH) is the major hypothalamic messenger controlling the pituitary-thyroid unit. However, the pituitary-thyroid unit responses to various modalities of TRH exposure are not well characterized. Also, interactions between the thyroid axis and other mammalian organ systems, specifically other hormone axes, to maintain the organism's homeostatic state are not well characterized. This work was designed to clarify the response of the pituitary-thyroid unit to TRH and to assess the effects of physiological levels of the rat's primary adrenal cortical hormone, corticosterone, on the thyroid axis. Adult rats were given equal amounts of TRH by intravenous (I.V.) bolus injection or constant intraperitoneal (I.P.) infusion. Both methods resulted in significant increases in plasma thyroid stimulating hormone (TSH), although the time course and peak plasma value varied with the TRH dosage and administration method. Despite the differences in plasma TSH elicited, the thyroid gland responses were similar. Thus, the pituitary is sensitive to the rate and dose of TRH administration. Also, the thyroid is sensitive to plasma levels of TSH but reaches maximum stimulation at submaximal circulating TSH levels. Adrenalectomized female rats, with I.P. and I.V. catheters, were infused with corticosterone (B) to achieve plasma levels within the rat's physiological range. Plasma samples were drawn before and after submaximal TRH (250 ng/100 g Body Weight) administration for assay of TSH and B concentrations. B in the lower half of its physiological range significantly inhibited the increase in plasma TSH observed 10 and 30 minutes after TRH administration. Also, direct stereotaxic infusion of B (50 ng) followed by TRH (1 ng) into the anterior pituitary inhibited the observed increase in plasma TSH. These studies indicate that homeostatic thyroid axis hormone concentrations are maintained by a feedback loop mechanism which is modulated by adrenal hormones. Specifically, physiological levels of corticosterone decrease pituitary sensitivity to TRH in the rat. In addition, the pituitary and thyroid gland exhibit different response patterns to hormonal stimulation.

Bibliography: leaves 182-210 / vii, 210 leaves : ill ; 30 cm. / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / Thesis (Ph.D.)--Dept. of Obstetrics and Gynaecology, University of Adelaide, 1985

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:36:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:55:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:06:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:36:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A prolactina humana (hPRL) é um hormônio polipeptídico secretado pela hipófise anterior sob regulação do hipotálamo, envolvido em uma variedade de processos biológicos como o desenvolvimento da glândula mamária e lactação. O produto recombinante é importante no diagnóstico médico e no tratamento de insuficiência da lactação. Este hormônio pode ocorrer sob a forma de proteína não glicosilada (NG-hPRL) e glicosilada (G-hPRL), com pesos moleculares de aproximadamente 23 e 25 kilodalton (kDa), respectivamente; possui um único sítio de N-glicosilação localizado na asparagina (Asn) posição 31, que é parcialmente ocupado, representando assim um modelo particularmente interessante de glicosilação. A atividade biológica da G-hPRL é muito menor comparada à NG-hPRL (~4 vezes) e sua função fisiológica ainda não é bem definida: a porção de carboidrato parece ter um importante papel na biossíntese, secreção, atividade biológica, e sobrevivência plasmática do hormônio. O objetivo principal desse trabalho foi comparar as estruturas dos N-glicanos presentes na prolactina glicosilada hipofisária (G-hPRL-NHPP) com a recombinante. Para obter a G-hPRL recombinante foi realizada uma produção em escala laboratorial a partir de células de ovário de hamster chinês (CHO) geneticamente modificadas e adaptadas ao crescimento em suspensão. Foi adicionada, ao meio de cultura cicloheximida (CHX), cujo efeito principal foi aumentar a relação G-hPRL/NGhPRL que passou de 5% para 38%, facilitando assim a purificação da G-hPRL. A G-hPRL foi purificada em duas etapas, uma troca catiônica seguida de purificação por cromatografia liquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC) que se demonstrou eficiente na separação das duas isoformas de hPRL. A G-hPRL recombinante IPEN foi assim analisada por diversas técnicas confirmando a sua pureza e atividade biológica, incluindo comparações com outras amostras de referências de origem hipofisária adquirida junto ao National Hormone & Peptide Program (NHPP-E.U.A.) . Foi realizada também a determinação inédita de Nglicanos presentes na G-hPRL produzida por células CHO e na G-hPRL nativa, produzida pela hipófise humana, possibilitando comparar as duas estruturas de carboidratos e alcançando assim uma das principais metas desse projeto. Entre as principais diferenças encontradas nas estruturas dos dois N-glicanos, destacam-se a baixa quantidade de ácido siálico (NeuAc), a alta porcentagem de glicanos sulfatos (74,0%) e com fucose (Fuc) (93,3%) presentes na amostra hipofisária e a tendência da preparação recombinante de apresentar glicanos com maior peso molecular e com uma menor variação nas isoformas. / Dissertação (Mestrado) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP