PEREIRA, D. A. Proteases e inibidores de proteases em látex vegetal e intestino de lagartas: aspectos sobre resistência e suscetibilidade das plantas alvo. 2014. 116 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2015-01-22T18:10:27Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_dapereira.pdf: 2673759 bytes, checksum: 7774cf88f545c534e580605cea0c8aa2 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2016-01-27T22:52:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_dapereira.pdf: 2673759 bytes, checksum: 7774cf88f545c534e580605cea0c8aa2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-27T22:52:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_dapereira.pdf: 2673759 bytes, checksum: 7774cf88f545c534e580605cea0c8aa2 (MD5) Previous issue date: 2014 / Plant latex is produced and stored in channels formed by highly specialized cells structures. A remarkable feature of these fluids is the presence of complex proteolytic systems. Many studies report that latex possesses a variety of defense proteins against insects and fungi. However, some insects overlap this defense and feed on latex-producing plants, for example Pseudosphinx tetrio and Danaus plexippus, both of the order Lepidoptera. The biochemical aspects of insect resistance to latex defense proteins are still not widely elucidated. This issue was addressed in this work. Initially, the proteolytic activity of Pseudosphinx tetrio gut was characterized and evaluated in its ability to degrade latex proteins of its host plant (Plumeria rubra) and non-host plants (Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora). Furthermore, we assessed whether protease inhibitors from latex fluids (C. procera, P. rubra and Cr. grandiflora) inhibit intestinal proteases from P. tetrio and D. plexippus and vice versa. The effect of latex enzymes on peritrophic membrane (PM) of D. plexippus was also assessed. Intestinal proteases from P. tetrio are predominantly of serine type and their activities are higher in basic pHs. P. tetrio gut proteases rapidly and completely digested latex proteins of its host plant and C. procera and partially digested proteins from Cr. grandiflora. D. plexippus larvae were not affected when fed on artificial diet containing latex proteins (1%) from non-host plants. In vitro assays detected serine and cysteine peptidase inhibitors in both gut homogenates and latex fluids. Protease inhibitors from latex inhibited the proteolytic activity of gut homogenates of both larvae. Nevertheless, in vivo analysis demonstrated that latex inhibitors do not affect the development of D. plexippus. Only the gut homogenate from D. plexippus showed inhibitory activity towards proteases latex from its host plant (Calotropis procera). Slight changes were observed in the protein profile of the PMs from D. plexippus subjected to latex protein fractions in vivo, whilst in vitro treatment resulted in more severe damage. This study concludes that proteolysis and inhibition of proteolysis are involved in the defensive systems of both caterpillars and their host plants. Even though latex peptidase inhibitors inhibit gut peptidases (in vitro), the ability of gut peptidases to promptly digest latex proteins (in vivo) regardless of their origin seems to be a pivotal event favoring caterpillars overcoming plant defense. / O látex vegetal é produzido e estocado em sistemas de canais formados por células altamente especializadas, os laticíferos. Uma característica marcante destes fluidos é a presença de sistemas proteolíticos complexos. Muitos estudos relatam que proteínas de defesa contra insetos e fungos são encontradas em látex. No entanto, alguns insetos sobrepõem esta defesa e alimentam-se de plantas laticíferas, como Pseudosphinx tetrio e Danaus plexippus, ambas da ordem Lepidoptera. As bases bioquímicas da resistência de insetos às proteínas defensivas do látex ainda não são amplamente elucidadas. Esta problemática foi abordada neste trabalho. Inicialmente a atividade proteolítica do extrato intestinal de P. tetrio foi caracterizada e avaliada sua capacidade de degradar as proteínas do látex de sua planta hospedeira, Plumeria rubra, bem como de plantas laticíferas não hospedeiras (Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora). Além disso, foi avaliado se inibidores de proteases de fluidos laticíferos (C. procera, P. rubra e Cr. grandiflora) inibem as proteases intestinais de P. tetrio e D. plexippus e vice-versa. Em adição, foi analisado o efeito de enzimas laticíferas sobre a membrana peritrófica (MP) de D. plexippus. As proteases intestinais de P. tetrio são predominantemente do tipo serínica e suas atividades são maiores em pHs básicos. O extrato intestinal de P. tetrio rapidamente e completamente digeriu as proteínas do látex de sua planta hospedeira e de C. procera, bem como digeriu parcialmente as proteínas do látex de Cr. grandiflora. Larvas de D. plexippus se desenvolveram plenamente quando alimentadas com dieta artificial contendo 1% das frações proteicas dos látex de plantas não hospedeiras. Ensaios in vitro indicaram que ambos, extratos intestinais e látex das espécies em estudo, possuem inibidores de proteases serínicas e cisteínicas. Inibidores provenientes dos fluidos laticíferos em estudo inibiram a atividade proteolítica dos extratos intestinais de ambas as larvas. Entretanto, análise in vivo demonstrou que estes inibidores não afetam o desenvolvimento de D. plexippus. Somente o extrato intestinal de D. plexippus apresentou atividade inibidora de proteases do látex de sua planta hospedeira (Calotropis procera). Apenas discretas mudanças foram observadas no perfil proteico das MPs de D. plexippus submetidas às frações proteicas dos fluidos laticíferos in vivo, enquanto que o tratamento in vitro resultou em danos mais acentuados. A partir dos resultados obtidos conclui-se que proteólise e a inibição de proteólise fazem parte do sistema defensivo das larvas especialistas em plantas laticíferas e de suas plantas hospedeiras. Embora inibidores de proteases de fluidos laticíferos sejam capazes de inibir as proteases intestinais das larvas (in vitro), in vivo, a habilidade das proteases intestinais em prontamente digerir as proteínas do látex parece ser crucial para a sobreposição da defesa vegetal.

AGUIAR, Valéria Cavalcanti de. Aspectos bioquímicos, toxicológicos e alergênicos do látex da planta Calotropis procera (Ait.) R. BR. 2006. 182 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2006. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-28T14:13:28Z No. of bitstreams: 1 2006_tese_vcaguiar.pdf: 2761351 bytes, checksum: d8feb2c818b400fccdafa1af61997ce7 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T14:46:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_tese_vcaguiar.pdf: 2761351 bytes, checksum: d8feb2c818b400fccdafa1af61997ce7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T14:46:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_tese_vcaguiar.pdf: 2761351 bytes, checksum: d8feb2c818b400fccdafa1af61997ce7 (MD5) Previous issue date: 2006 / The latex of the lactiferous plant Calotropis procera (Ait.) R. Br. is an important biologically active compound that displays relevant properties like antiinflammatory and antidiarrhea activities, although the latex has previously been shown to produce considerable toxic effects on animals. Another question is that it is not known yet whether the latex proteins from C. procera induce allergenic effects, just like the latex proteins from Hevea brasiliensis. The potential of the latex as a pharmaceutical, therefore, depends on separating the curative properties from the toxic and allergenic properties, but there has been a lack of scientific investigation in this area. The objective of the present study was to investigate biochemical, toxicological and allergenic aspects of the latex from the plant C. procera, through the study of in vitro and in vivo digestibility, evaluation of acute and subchronic toxicity by oral route, and analysis of immune response induction by subcutaneous and oral route of its fractions. The latex was fractionated into three distinct fractions according to their water solubility and molecular size. The fractions were named as: latex proteins (LP), corresponding to the major latex proteins; dialysis proteins (DP), representing low molecular size substances; and rubber latex (RL), which was highly insoluble in water. LP fraction was investigated in some biochemical aspects, like its protein profile by SDS-PAGE analysis and its amino acid composition determination. Latex proteins were also subjected to in vitro digestion with trypsin, chemotrypsin, pepsin and Streptomyces griseus protease and in vitro digestibility was evaluated by gel filtration and SDS-PAGE analysis. The in vivo digestibility of LP was analyzed when experimental animals ingested this fraction for 35 days. The volume uptake of LP was recorded daily and samples of fecal material from animals were collected, treated and submitted to SDS-PAGE analysis and radial double immunodifusion assays, with polyclonal antibodies raised against LP. In relation to toxicological aspects, LP fraction was orally administered to experimental animals for 35 days, to allow subchronic toxicity evaluation. Increases in body mass were recorded and blood samples were analyzed weekly. After the test period, the animals were sacrificed and a number of biochemical and physiological parameters determined. These included sera determinations of blood glucose, total cholesterol, HDL-cholesterol, triglycerides, hepatic function tests (total proteins, albumin, alanine aminotransferase – ALT and aspartate aminotransferase – AST), renal function tests (urea and creatinin), total and differential leukocyte counts in blood and peritoneal fluid and analysis of sera proteins by SDS-PAGE. Animals had internal key organs (liver, kidneys, spleen, small intestine, large intestine, pancreas and stomach) dissected and the relative fresh masses were determined. In the acute toxicity evaluation, LP fraction was administered by oral route to experimental animals and behavioral changes in animals were also monitored. With reference to allergenic aspects, immunological responses of latex from C. procera were investigated by oral and subcutaneous routes in mice. Anti-sera against LP, DP and RL fractions were assayed for IgG and IgA titration by ELISA, while IgE and IgG1 were accessed by passive cutaneous anaphylaxis (PCA) in rats and mice, respectively. Protein profiles of LP and RL fractions were analyzed by SDS-PAGE. Concerning biochemical aspects results, LP fraction possesses appreciable amount of protein, low content of sulphurated amino acids (methionine and cysteine) and a considerable number of amino acids (arginine, lysine, phenylalanine and tyrosine) that represent cleavage sites to animal proteolytic enzymes studied. LP fraction was digested by the action of pepsin, trypsin and chemotrypsin as revealed by gel filtration and SDS-PAGE analyses. The full LP digestion was easily achieved by S. griseus protease treatment. Rabbit polyclonal antibodies raised against LP failed to detect cross-reactive molecules in faeces of experimental rats. Similar patterns of electrophoresis were observed for the negligible amounts of protein observed in the fecal materials of control and test animals. With relation to subchronic toxicity evaluation results, no death was observed during the experiment. Experimental and control animals presented similar growth rate and key organs exhibited similar relative fresh masses. Hepatic and renal functions, sera glycemic and lipidemic parameters were determined to be at normal levels. Likewise, the electrophoretic protein patterns of sera from untreated and treated animals exhibited quite similar profiles. Uptake of latex proteins did not induce acute inflammation into peritoneal cavity of rats as determined by the total and differential leukocytes counts. The most relevant result discovered was an apparent proliferative effect of the latex proteins upon blood lymphocytes that tended to increase, whilst neutrophils remained at normal level. It should be emphasized that the experimental rats were normal in their behavior, morphological and biochemical aspects, indicating that it is unlikely that they were under any pathological or infectious condition. Therefore, the increment of lymphocytes population in the blood serum should be attributed to the staking effect of the latex proteins rather than any harmful event. LP fraction was unable of presenting acute toxicity in experimental animals, because no behavioral changes in animals were observed. Concerning allergenic aspects results, none of the fractions induced antibodies level increases when mice received latex fractions by oral route and thus, did not develop allergy. Nonetheless, anti-sera of mice sensitized with LP and RL by subcutaneous administration displayed considerable immunological response, while DP did not induce antibodies synthesis. IgG level augmented consistently against LP and RL, while IgA response was detected to LP solely. LP and RL induced very strong PCA reactions suggesting that both fractions would contain latex substances involved in allergenicity. Furthermore, protein analysis of LP and RL suggests that RL still retain residual proteins, co-precipitated with rubber, abundantly found in LP, that could explain its similar allergenicity. No IgG1 reaction was detected in any of the anti-sera tested. It can be concluded that latex proteins were partially susceptible to digestive proteolysis when accessed by in vitro assays, and were digested and absorbed, or were absorbed in its intact form, when ingested and analyzed by in vivo tests. Toxic events or lethality associated with latex, as described in the literature, are not related to LP fraction. Latex proteins produced partial proliferative effect upon mononuclear cells, mainly lymphocytes and did not induce an acute inflammatory response, when administered by oral route. Allergenic effects could be detected, by subcutaneous route, with LP and RL fractions, and were not observed by oral route. Evidences for an inducible tolerance acquired to latex proteins by oral route were provided. Latex proteins may act as immune stimulants. The proteins from the latex remain an interesting source of biologically active molecules that should be studied in detail for their structural, functional and applicative properties. / O látex da planta lactífera Calotropis procera (Ait.) R. Br. é um composto biologicamente ativo importante que apresenta propriedades relevantes como as atividades antiinflamatória e antidiarréica, embora já tenha sido previamente mostrado que esse látex produz efeitos tóxicos consideráveis em animais. Um outro fato é que não é sabido, ainda, se as proteínas do látex de C. procera produzem efeitos alergênicos, assim como as proteínas do látex de Hevea brasiliensis. O potencial do látex como um fármaco, por essa razão, depende da separação das propriedades curativas das propriedades tóxicas e alergênicas, mas não existe investigação científica nessa área. O presente estudo teve como objetivo investigar aspectos bioquímicos, toxicológicos e alergênicos do látex da planta C. procera, através do estudo da digestibilidade in vitro e in vivo, avaliação da toxicidade subcrônica e aguda por via oral e análise da indução de resposta imune pelas vias subcutânea e oral das suas frações. O látex foi fracionado em três frações distintas de acordo com a sua solubilidade em água e tamanho molecular. As frações foram assim denominadas: proteínas do látex (PL), correspondendo às principais proteínas do látex; proteínas da diálise (PD), representando as substâncias de baixa massa molecular; e borracha do látex (BL) que é altamente insolúvel em água. A fração PL foi investigada, com relação a alguns aspectos bioquímicos, como seu perfil protéico por PAGE-SDS e análise da composição de seus aminoácidos. As proteínas do látex também foram submetidas à digestão in vitro com as enzimas proteolíticas pepsina, tripsina, quimiotripsina e protease de Streptomyces griseus e a digestibilidade in vitro foi avaliada por cromatografia de filtração em gel ou PAGE-SDS. A digestibilidade in vivo de PL foi analisada quando animais experimentais ingeriram essa fração por 35 dias. O volume de PL consumido foi registrado diariamente e amostras das fezes dos animais coletadas, tratadas e submetidas à PAGE-SDS e ensaios de imunodifusão radial dupla de Ouchterlony, com anticorpos policlonais contra PL. Com relação aos aspectos toxicológicos, a fração PL foi oralmente administrada a animais experimentais por 35 dias, para a avaliação da toxicidade subcrônica. Aumentos na massa corpórea foram registrados e amostras sangüíneas foram analisadas semanalmente. Após o período experimental, os animais foram sacrificados e um número de parâmetros bioquímicos e fisiológicos foram determinados. Esses incluíram determinações séricas de glicose sangüínea, colesterol total, HDL-colesterol, triglicerídeos, testes da função hepática (proteínas totais, albumina, alanina aminotransferase – ALT e aspartato aminotransferase – AST), testes da função renal (uréia e creatinina), contagens total e diferencial de leucócitos sangüíneos e do fluido peritonial e análise das proteínas séricas por PAGE-SDS. Os animais tiveram seus órgãos vitais (fígado, rins, baço, intestino delgado, intestino grosso, pâncreas e estômago) dissecados e as massas frescas relativas foram determinadas. Na avaliação da toxicidade aguda, a fração PL foi administrada por via oral a animais experimentais e a monitoração de alterações comportamentais desses animais também foi realizada. Quanto aos aspectos alergênicos, respostas imunológicas do látex de C. procera foram investigadas pelas vias oral e subcutânea em camundongos. Anti-soros contra as frações PL, PD e BL foram analisados quanto a IgG e IgA por ELISA, enquanto IgE e IgG1 foram monitoradas por anafilaxia cutânea passiva (PCA) em ratos e camundongos, respectivamente. Os perfis protéicos das frações PL e BL foram analisados por PAGE-SDS. Com relação aos resultados dos aspectos bioquímicos, a fração PL possui uma quantidade apreciável de proteínas, baixo conteúdo de aminoácidos sulfurados (metionina e cisteína) e um número considerável de aminoácidos (arginina, lisina, fenilalanina e tirosina) que representam sítios de clivagem para as enzimas proteolíticas animais usadas. A fração PL foi digerida pela ação da pepsina, tripsina e quimiotripsina como revelado por análises de filtração em gel e PAGE-SDS. A digestão completa das proteínas do látex foi facilmente obtida pelo tratamento com a protease de S. griseus. Anticorpos policlonais de coelho produzidos contra PL não apresentaram reação cruzada com as moléculas presentes nas fezes dos ratos experimentais. Padrões semelhantes de eletroforese foram observados para as quantidades desprezíveis de proteína observadas nos materiais fecais dos animais controle e experimentais. Quanto aos resultados da avaliação da toxicidade subcrônica, nenhuma morte foi observada durante o experimento. Animais controle e experimentais apresentaram taxa de crescimento semelhante e os órgãos vitais exibiram massas frescas relativas similares. As funções hepática e renal, parâmetros glicêmicos e lipidêmicos séricos situaram-se em níveis normais. Os padrões protéicos eletroforéticos dos soros dos animais controle e experimental exibiram perfis muito similares. A fração PL não induziu inflamação aguda na cavidade peritonial dos ratos, como determinado pelas contagens total e diferencial de leucócitos. O resultado mais relevante detectado foi um aparente efeito proliferativo das proteínas do látex sobre os linfócitos sangüíneos que tenderam a aumentar, enquanto os neutrófilos permaneceram em nível normal. Deve ser enfatizado que os animais experimentais exibiram comportamento, aspectos morfológicos e bioquímicos normais, indicando ser improvável que os mesmos estivessem sob qualquer condição patológica ou infecciosa. Portanto, o incremento da população de linfócitos no soro sangüíneo deve ser atribuído a um efeito notável das proteínas do látex e não a qualquer evento prejudicial. A fração PL foi incapaz de induzir toxicidade aguda, pois nenhuma mudança comportamental foi observada nos animais experimentais. Com relação aos resultados dos aspectos alergênicos, nenhuma das frações induziu aumentos nos níveis de anticorpos, quando os camundongos receberam as frações do látex por via oral e, portanto, não desenvolveram alergia. Entretanto, anti-soros de camundongos sensibilizados com PL e BL por administração subcutânea apresentaram resposta imunológica considerável, e PD não induziu síntese de anticorpos. O nível de IgG aumentou consistentemente contra PL e BL, enquanto a resposta de IgA foi detectada unicamente contra PL. PL e BL induziram reações de PCA muito fortes, sugerindo que ambas as frações contêm substâncias do látex envolvidas na alergenicidade. Além disso, a análise protéica de PL e BL sugere que BL ainda retém proteínas residuais, co-precipitadas com a borracha, abundantemente encontradas na fração PL, que poderiam explicar as alergenicidades semelhantes. Nenhuma reação de IgG1 foi detectada em quaisquer dos anti-soros testados. Conclui-se que as proteínas do látex foram parcialmente susceptíveis à proteólise em ensaios in vitro e, ou foram digeridas e absorvidas, ou foram absorvidas íntegras, quando ingeridas em ensaios in vivo. Eventos tóxicos ou letalidade associados ao látex, como descritos na literatura, não estão relacionados com a fração PL. A fração PL produziu efeito proliferativo parcial sobre as células mononucleadas, principalmente linfócitos e não induziu resposta inflamatória aguda, quando administrada pela via oral. Efeitos alergênicos puderam ser detectados, por via subcutânea, com as frações PL e BL, e não foram observados por via oral. Evidências para uma possível tolerância sistêmica às proteínas do látex por via oral foram fornecidas. As proteínas do látex podem atuar como imunoestimulantes. As proteínas do látex permanecem uma fonte interessante de moléculas biologicamente ativas que devem ser estudadas em detalhe quanto às suas propriedades estruturais, funcionais e aplicativas.