El PCI es una proteína de 39 aminoácidos con una estructura globular central de 27 residuos y dos colas, N- terminal y C- terminal. La parte globular de la proteína presenta una hélice 310, como única estructura secundaria regular, así como 4 bucles ("loops") y está estabilizada por tres puentes disulfuro formados por las cisteínas C8- C27, C12- C24 y C18- C34. La presencia de estos puentes disulfuro nos permite estudiar el replegamiento del PCI a través de la captura de los intermediarios que se forman en el proceso de plegamiento a partir de la proteína reducida. Esto permite conocer el número de intermediarios dependientes de disulfuro, su diversidad, su estructura y sus propiedades, proporcionándonos información sobre el mecanismo de plegamiento.En una primera fase del presente trabajo, hemos estudiado el aislamiento y la purificación de los intermediarios con tres puentes disulfuro (denominados "scrambled species") a partir de la mezcla de intermediarios que se obtiene tras efectuar el replegamiento del PCI a partir de PCI purificado o a partir de cultivos de E. Coli que expresan PCI. Así mismo, hemos realizado una caracterización estructural de los intermediarios "scrambled" aislados en forma pura, se han determinado sus constantes de inhibición, éstas son del orden mM (unas 1000 veces superiores a la estimada para el PCI nativo). También se ha determinado cuáles son las cisteínas implicadas en cada uno de los puentes disulfuro de la estructura de tales especies mediante digestión proteolítica y mediante reducción química parcial de un puente disulfuro. Finalmente se ha realizado un análisis conformacional por estudios de Dicroísmo Circular y Resonancia Magnética Nuclear, técnicas que nos han permitido observar que tales intermediarios no presentan una estructura mayoritaria definida.En una segunda fase, hemos estudiado la última etapa del camino de plegamiento del PCI, etapa donde las especies '"scrambled"" rompen y vuelven a formar sus puentes disulfuro para dar lugar a la estructura nativa. Con este fin se ha estudiado la estabilidad relativa de estos intermediarios frente a agentes desnaturalizantes y se han llevado a cabo experimentos cinéticos de su evolución a estructura nativa. Estos experimentos han probado que el plegamiento del PCI no tiene lugar a través de una vía única sino que se dan múltiples vías paralelas. Se han observado que los intermediarios que son más estables frente a agentes desnaturalizantes son los que presentan una evolución más lenta hacia la forma nativa.Finalmente en una tercera fase, se ha estudiado la influencia de agentes redox en la producción de PCI recombinante y en otras proteínas relacionadas. Se observó que la expresión de éstos en E. Coli, en forma secretada al medio, se acumulaba gran parte de la proteína en forma de intermediarios tipo "scrambled". Se ha determinado que la forma más eficiente para convertir estas especies en proteína nativa, consiste en la adición al medio tras el cultivo de agentes redox para catalizar el proceso de "reshuffling". De esta forma se consiguen importantes mejoras en el rendimiento de la producción. / Potato carboxipeptidase inhibitor (PCI) contains 39 amino acids. 27 residue composed the central globular structure and the rest composed the queue N- terminal and C- terminal. The globular part of the protein presents an helix 310, as the only secondary structure regular, and 4 loops. The protein is stabilised by tree disulfide bridges composed by the cystines: C8-C27, C12- C24 I C18- C34.The presents of this disulfide bridges let us to study the refolding of PCI by trapping the intermediates formed during the folding pathway of the reduced protein. This process let us know the number of intermediates disulfide dependents, his diversity, his structure and his proprieties, giving us information of the folding pathway.In a first stage of this work, we studied how to isolate and purification the intermediates with tree disulfide bridges (denominated "scrambled spices") by the intermediates obtained from the refolding of PCI, from the PCI purification or from E.Coli cultives. With the pure "scrambled" intermediates we have done a structural characterisation and we have defined their inhibitor constants. Also we defined which are the cystines implicated in each disulfide bridge by proteolysis and by partial chemical reduction to one disulfide bridge. Finaly we have done a conformacional analysis by Circular Dicroism and Nuclear Magnetic Resonance. This techniques reveal us that the intermediates don't have a main structure defined.In a second stage, we have been studied the last step of the folding pathway from PCI. During this step the scrambled spices break and refold their disulfide bridges to give the native structure. We studied the relative stability of the intermediates in front of disnatured agents and kinetics experiments of their evolution a native structure. This experiments reveal that the folding of the PCI isn't by one path, it is by multiple parallel pathways. We have seen that the most stable intermediates in front of disnature agents are the most slow to native structure.Finally in a third stage, we studied the effect of redox agents in the production of recombinant PCI and other relation proteins. We have seen that most protein was accumulate in intermediates type scrambled during the E.Coli expression. We determined that the most efficient conversion to the native form is by the addition of agents redox in the medium after the grow, this agents catalite the reshuffling process. By this form we have good improve in the production rendiment.

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La proteína RfaH de E. coli es un regulador transcripcional perteneciente a la ampliamente conservada familia NusG, que incrementa la expresión de genes distales en operones estrechamente relacionados con virulencia. Esta expresión controlada toma lugar de manera posterior al reclutamiento específico de RfaH a una hebra de ADN expuesta en la superficie del complejo de elongación de transcripción, pausado en la secuencia nucleotídica ops. RfaH posee un dominio C-terminal plegado en forma de α-hélice (αCTD) compactada contra la superficie de unión a polimerasa de ARN (ARNP) del dominio N-terminal e inhibiéndolo, mientras que el de su parálogo NusG corresponde a un plegamiento barril-β (βCTD) sin interacción a la ARNP y con alta movilidad. Sin embargo, cuando ambos dominios de RfaH se disocian (evento necesario para unirse a la ARNP), el dominio C-terminal sufre un cambio de plegamiento desde α-hélice a un barril-β idéntico estructuralmente al de NusG, permitiendo la activación del NTD, y además reclutando la proteína ribosómica S10 para acoplar la transcripción con la traducción. RfaH es la primera proteína metamórfica cuyo cambio estructural está asociado a un cambio funcional. Debido a la escasa estabilidad de RfaH en solución la mayoría de los estudios termodinámicos han sido computacionales, sugiriendo la presencia de un intermediario que conecta ambos estados; sin embargo, a la fecha no se ha realizado un análisis profundo que conecte las dinámicas observadas computacionalmente con datos experimentales contrastables. En este trabajo de tesis se evaluó si el plegamiento del dominio C-terminal de RfaH ocurre previo al desplegamiento del NTD, con especial énfasis en las características termodinámicas de aquél proceso. Esto se realizó mediante distintos enfoques computacionales incluyendo modelos basados en estructura y dinámica molecular de confinamiento. Computacionalmente, se utilizaron modelos nativo-céntricos para simular el desplegado mecánico de RfaH en ambos estados nativos. A pesar de que estos modelos se han usado consistentemente para estudiar fenómenos de plegamiento, las magnitudes computacionales o “reducidas” no se encuentran calibradas respecto a su contraparte experimental. Por ello, inicialmente se estudió el desplegado mecánico de 35 proteínas depositadas en el PDB para poder estimar la capacidad de estos modelos de reproducir características experimentales. Utilizando ponderación por orden de contacto, se obtuvo una aproximación lineal de las fuerzas estimadas/experimentales (R=0,934) con un error estándar de 56 pN. Al realizar simulaciones de estiramiento de RfaH en estas condiciones, se observó consistentemente que el CTD se despliega independiente del NTD. A una velocidad de 100 nm∙s-1, la disociación y desplegado del αCTD ocurre a 43 ± 6 pN, mientras que el βCTD se despliega a los 35 ± 5 pN dando lugar a la formación de un intermediario β-extendido, que expone su núcleo hidrofóbico y se despliega a los 29 ± 4 pN. Utilizando este enfoque también se modeló el replegamiento del CTD en ambos estados. Mostrando alta histéresis para el caso del αCTD, y distribuciones de trabajo solapantes con las del desplegamiento para ambos pasos de desplegamiento del βCTD, permitiendo estimar un ΔG de 12,0 y 8,7 kcal mol-1 para la reacción βCTD ⇄ I ⇄ desplegado, respectivamente. Por otro lado, se calculó la estabilidad de ambos estados mediante dinámica molecular de confinamiento, entregando un ΔG = 6,5 kcal∙mol-1 para la reacción αRfaH ⇄ βRfaH. Una descomposición a nivel de residuo de esta diferencia de energía muestra alta correlación con la estabilidad relativa calculada a partir de espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio. Esto permitió identificar una estabilidad diferencial de segmentos al interior de RfaH, en la cual los residuos 129-146 están altamente estabilizados en el αCTD asociado al NTD, mientras que las otras dos regiones 115-128 y 147-162 favorecen enormemente un plegamiento βCTD, y apoyan la predicción energética predicha por las dinámicas de confinamiento. Este trabajo corresponde a la primera investigación termodinámica de la transición de RfaH, dando luces además de los directores en secuencia de esta transformación, y caracterizando su estabilidad y vía por la cual se conecta con el estado desplegado / The idea of a singular native state has been overruled by metamorphic proteins such as RfaH. This is a transcription factor composed of two domains: The N-terminal (NTD, 100 residues) and C-terminal (52 residues) domains. In solution this protein is autoinhibited, and it becomes activated by completely refolding its C-terminal domain from its initial α-hairpin to a β-barrel when binding to the transcriptional machinery. Through multiple molecular dynamics approaches, it was possible to computationally characterize and predict the folding pathways of both RfaH states, and estimate the free-energy difference required for converting them. Using structure-based models, the single-molecule mechanical unfolding of α-folded RfaH was simulated, which takes place by two sequential events: the simultaneous dissociation and unfolding of its α-helical C-terminal domain (αCTD), and a secondary unfolding of the NTD. On the other hand, when starting from the β-folded C-terminal domain (βCTD), RfaH unfolding occurs mediated by two different intermediates: first, the β-barrel opens and becomes solvent exposed turning into an extended-β intermediate. In a tertiary transition, this intermediate is unfolded and only the NTD remains structured, which shares the same folding characteristics as when unfolding from the α-state RfaH. Analysis of the unfolding of 35 different proteins using structure-based models allowed for estimation of forces from simulations. Using this approach, reversible unfolding of CTD was performed, yielding high hysteresis between the un- and refolding of the αCTD; and overlapping work distributions for such processes in the βCTD, enabling equilibrium free energy calculation through Crooks fluctuation theorem. Thus, the predicted ΔG° values for the reaction βCTD ⇄ Intermediate ⇄ unfolded are 12.0 and 8.7 kcal mol-1 respectively. By using confinement molecular dynamics, it was possible to estimate the free energy of the RfaH metamorphosis (αRfaH ⇄ βRfaH) calculated to be 6.5 kcal mol-1. The further decomposition of this free energy is highly correlated with thermodynamic analysis of hydrogen-deuterium mass spectrometry experiments performed for both CTD states. Altogether, this research provides insights into the folding mechanism and thermodynamics of the metamorphic RfaH protein, constituting a significant step forward in understanding the molecular determinants behind the duality of metamorphic proteins

Magíster en Bioquímica área de Especialización en Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar al Título de Bioquímico / La topología de una proteína, definida como el camino tridimensional que sigue la cadena polipeptídica en el espacio, impone restricciones naturales al conjunto de movimientos que esta puede realizar para alcanzar su estado nativo. Por esta razón esta propiedad define el mecanismo de plegamiento de una proteína. Sin embargo, en los últimos años se han descrito proteínas que obligan a la cadena polipeptídica a buscar su camino de plegamiento a través de intrincados y complejos movimientos, es el caso de las proteínas anudadas. Estas proteínas suponen un desafío para las teorías de plegamiento actuales y han abierto nuevas interrogantes respecto al mecanismo de plegamiento de las proteínas. La primera proteína anudada fue identificada en el año 2000, desde entonces se han descrito muchas otras llegando a representar del 2% del Protein data bank (PDB). Esta baja abundancia relativa de proteínas anudadas contrasta con lo observado en simulaciones de modelos de polímeros que indican que la probabilidad de formar este tipo de estructuras es alta. Esto hace pensar que las proteínas evitan la formación de nudos. No obstante no se conoce la tendencia natural de una proteína a anudarse. Otra interrogante que nace del estudio de proteínas anudadas tiene relación con la función que cumplen estas estructuras en las proteínas que las presentan y cómo estas proteínas logran plegarse. Se ha demostrado que algunos motivos anudados se conservan en distintas familias y superfamilias a pesar de su baja identidad de secuencia. Esta evidencia sugiere que dichos motivos podrían aportar alguna ventaja comparativa a las proteínas que los presentan. En este aspecto, estudios teóricos y evidencias experimentales indican que la topología anudada podría aumentar la estabilidad de las proteínas. Sin embargo, ninguno de dichos estudios explica cómo la topología anudada confiere estabilidad. En este trabajo tratamos de determinar las consecuencias que tiene sobre el mecanismo de plegamiento de una proteína el obligar a su cadena polipeptídica a anudarse. Para ello se comparó el proceso de plegamiento de una proteína anuda con la de su contraparte no-anudada. Experimentalmente esto sugiere dos desafíos importantes: primero, es necesario que la formación del nudo no altere significativamente la estructura de la proteína. Segundo, es indispensable poder controlar la topología del estado desplegado para asegurar la homogeneidad de los estados termodinámicos estudiados. El primer desafío fue abordado utilizando como modelo de estudio la proteína mARC de la superfamilia de factores de transcripción RHH. Esta es una versión monomérica del represor ARC del fago p22 generada al unir el extremo carboxilo de una subunidad con el extremo amino de la siguiente utilizando un péptido conector de 15 aminoácidos rico en glicina. Modelos por homología de mARC muestran que el péptido conector puede formar un lazo flexible que no genera contactos con el centro hidrofóbico de la proteína. De esta manera, dependiendo de la posición de dicho lazo se pueden generar dos conformaciones de mARC, una conformación anudada y otra no-anudada. El segundo desafío experimental fue abordado caracterizando el mecanismo de plegamiento de mARC utilizando pinzas ópticas. Esta aproximación permite estirar la proteína desde sus extremos y aplicar una fuerza sobre ella, de esta forma se puede controlar la topología del estado desplegado y con ello poder comparar la diferencia de energía libre entre el estado desplegado anudado y no-anudado de mARC. Por otra parte, mediante un rearreglo de los elementos de estructura secundaria de mARC puede generarse una permutante no circular de ella, pARC. Esta proteína presenta la misma arquitectura y estabilidad al equilibrio que mARC pero su topología le impide formar nudos. Así, esta permutante fue utilizada como control del efecto topológico del anudamiento de mARC. Los resultados obtenidos al estirar mARC a velocidad constante permitieron identificar dos tipos de moléculas con largos de contorno (L0 largo de una molécula completamente estirada) diferentes. Un grupo de moléculas presentó un L0 de 37 ± 7 nm, que coincide con lo esperado para la conformación anudada de mARC. El otro grupo mostró un L0 de 43 ± 7 nm, esperado para la conformación no-anudada de esta proteína. Al contrario, pARC sólo mostró un tipo de moléculas con un L0 de 22 ± 7 nm. De estos resultados se concluye que mARC está presente en dos conformaciones, una anudada y otra no anudada. De los experimentos de estiramiento a velocidad constante se obtuvo el trabajo irreversible, realizado fuera del equilibrio, asociado a las transiciones de desplegamiento y replegamiento de mARC y pARC. Utilizando el teorema de Crooks fue posible calcular, a partir de estos datos, el ΔG en condición de equilibrio para el desplegamiento de las conformaciones anudada (ΔG1= 21,8 ± 0,4 kcal/mol) y no-anudada (ΔG2= 12,3 ± 0,5 kcal/mol) de mARC así como también de pARC (ΔG3= 7 ± 0,4 kcal/mol). Estos resultados indican que mARC anudado es más estable que mARC no-anudado por 8,9 ± 0,9 kcal/mol, este valor corresponde al costo energético de anudar una cadena polipeptídica de 120 residuos en su estado desplegado. Esta es la primera vez que es posible determinar experimentalmente este valor. Además, esta diferencia de energía explica, cómo es que la topología anudada confiere estabilidad en esta proteína. Para caracterizar cinéticamente las proteínas se realizaron experimentos a fuerza constante. Sólo fue posible estudiar dos moléculas de mARC las cuales, a pesar de las diferencias que muestran en sus parámetros cinéticos calculados, corresponden a la conformación no-anudada de la proteína. No fue posible realizar estudios cinéticos con pARC / The topology of a protein, defined as the tridimensional path of the polypeptide chain in space, restricts the moves that the chain can perform for searching its native state. For this reason this property defines the folding mechanism of a protein. However, in recent years has been discovered some proteins that seek their native states through complex and intricate movements. Such is the case of knotted proteins which topology challenge current theories of protein folding and have opened new questions about protein folding mechanisms. The first knotted structure was identified in 2000, since then many others have been discovered reaching the 2% of the structures in the Protein data bank (PDB). The low relative abundance of the knotted structures contrast with simulation of polymer models showing that knotted structures are easy to exist in those systems. This suggests that proteins somehow have avoided knotted topologies. Another interesting thing to investigate about knotted proteins is the function that may have the knotted topology on this proteins and how that structures may fold. It has been determined that some knotted motifs are conserved in families and superfamilies despite of the low sequence identity. These results suggest that knotted motifs could provide some comparative advantage with respect to normal proteins. In this regard some theoretical and experimental evidence show that knotted topologies could enhance the stability of proteins. Nevertheless, none of these studies explain how this topologies does it. In this work we seek to elucidate the energetic consequence that brings the knotting of a polypeptide chain to its folding mechanism. For this, we compare the folding process of a knotted protein with their unknotted counterpart. In terms of experimental approach this problem impose two challenges, the first one is that the knot formation should don’t disturb the structure of the protein. The second one is that we must control de topology of the unfolded state in order to ensure the homogeneity of the thermodynamic species under experimentation. The first challenge was archived using the mARC protein from the RHH superfamily of transcription factors. This protein is a monomeric version of the ARC repressor from the p22 phage and it was constructed connecting the C terminus of the first subunit to the N terminus of the next one using a 15 residue glycine-rich polypeptide linker. Structural models mARC shows that the linker forms a flexible loop that doesn’t form contacts with hydrophobic core of the protein. Moreover, homology models indicate that the loop can move around the protein generating two conformations: a knotted and an unknotted one. The second challenge was addressed by characterizing the folding mechanism of mARC using optical tweezers. This approximation allows us to pull the protein from its C and N-terminal ends to control the topology of the unfolded state and thus to compare the energy differences between the knotted unfolded state and the unknotted unfolded state of mARC. In the other hand, by a rearrangement of the secondary structure of mARC it is possible to generate a non-cyclic permutant, pARC. This protein is reported to have the same architecture and folding stability of mARC but, its topology prevents knotting. So, pARC was used as a topological control of the effect of knotting the mARC protein. We found that mARC can be captured in two conformations characterized by different contour length (L0, total extension of a polymer chain). One group of molecules has a L0 of 43 ± 7 nm and corresponds to the expected for the unknotted conformation of mARC. The other group of molecules shows a L0 of 37 ± 7 nm and corresponds to the expected for the knotted conformation. On the contrary pARC only shows one type of molecules characterized by a L0 of 22 ± 7 nm. All together these results support the hypothesis that mARC is present in two conformations, one knotted and other unknotted. Moreover, applying Crook’s theorem to the irreversible work associated to the unfolding and refolding transitions of mARC and pARC allowed to determine the free energy (ΔG) at equilibrium required to the unfold the knotted (ΔG1= 21,8 ± 0,4 kcal/mol), unknotted (ΔG2= 12,3 ± 0,5 kcal/mol) conformations of mARC and pARC (ΔG3= 7 ± 0,4 kcal/mol). These results indicate that knotted mARC is more stable than their unknotted counterpart by 8,9 ± 0,9 kcal/mol mainly due to the energetic cost to tie the unfolded state of the protein. This value corresponds to the energetic cost of knotting a polypeptide chain of 120 residues in its unfolded state and explains the source of the stabilizing effect of the knotted topology in mARC. For the kinetic characterization we performed constant force experiments. It was only possible to study two molecules of mARC. Despite of the differences between the kinetic parameters calculated for them, both corresponds to the unknotted conformation of the protein / Fondecyt

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