O desvio apical é um fator bastante relevante na terapia endodôntica pela possibilidade de conduzir o tratamento proposto ao insucesso. Este estudo se propôs a realizar uma avaliação in vitro da ocorrência de desvio apical e sua magnitude nas instrumentações manual com limas de aço-inoxidável, rotatória de giro contínuo com o sistema K3 e rotatória de giro alternado com contra-ângulo NSK e limas de aço-inoxidável, em raízes mésio-vestibulares de molares superiores. A amostra foi formada por 60 raízes que, após a inclusão numa modificação da mufla de Bramante, foram seccionadas longitudinalmente. De acordo com o ângulo e raio da curvatura do seu canal, as raízes foram paritariamente divididas em três grupos. Uma das metades de cada raiz teve sua face interna digitalizada por scanner de mesa. As raízes foram remontadas nas muflas e seus canais instrumentados. A mesma metade de cada raiz teve sua face interna novamente digitalizada em três momentos distintos: primeiro, na confecção do preparo apical com a lima 30, após com a lima 35 e, por fim, com a lima 40. Cada imagem pós operatória (limas 30, 35 e 40) foi sobreposta à imagem pré-opertória no programa Adobe Photoshop. Após, foram transferidas ao programa AutoCad, onde o desvio apical foi mensurado. Para a comparação entre as limas dos três grupos foram utilizados os testes nãoparamétricos de Friedman e Wilcoxon que encontraram diferença significativa. (p=0,000) Para a comparação entre os três grupos foi utilizado o teste não-paramétrico Kruskal-Wallis (p=0,000) que demonstrou haver diferença significativa entre os grupos estudados. / Apical transportation has considerable relevance in endodontic therapy, as it may lead to treatment failure. This study conducted an in vitro comparative analysis of apical transportation produced in mesiobuccal roots of upper molars by (i) manual instrumentation using stainless steel files, (ii) K3 rotary Ni-Ti system, and (iii) a reciprocating NSK handpiece, also with stainless steel files. The sample comprised 60 roots that were inserted in a Bramante muffle and then longitudinally sectioned. Roots were subdivided pair-wise into three groups according to canal angle and radius. The inner surface of one root half was digitized using a scanner. Roots were then reassembled onto the muffles and had their canals instrumented. The same root half had its inner surface digitized again after instrumentation with three different file sizes: 30, 35 and 40. Each image obtained therefrom was superimposed over the pre-operative image using the Adobe Photoshop software. After, images were transferred to the AutoCad software for apical transportation measurements. The non-parametric Friedman and Wilcoxon tests were adopted to compare results for the three different file sizes, and showed the statistically significant differences between the results obtained (p=0,000). Similarly, the comparison between the three treatment groups by the nonparametric Kruskal-Wallis test revealed statistically significant differences.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-23Bitstream added on 2014-06-13T18:31:25Z : No. of bitstreams: 1 vilela_pgf_me_sjc.pdf: 389414 bytes, checksum: e94b74337996f5291f23f9666ba4f093 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A proposta desta pesquisa foi avaliar a capacidade de diferentes concentrações de endotoxinas (LPS) de Escherichia coli induzir secreção de MMP-3 e MMP-8 por macrófagos in vitro, em diferentes períodos de tempo. Para tanto, monócitos humanos da linhagem U937, diferenciados em macrófagos maduros com phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), foram ativados com 0 (controle), 5, 10 e 20 EU/mL e a produção de MMP- 3 e MMP-8 foi avaliada em três períodos de tempo (24, 48 e 72 h) por ensaios imunoenzimáticos (ELISA). Os resultados foram analisados estatisticamente (ANOVA e teste de Tukey, 5%). Pode-se verificar que houve significativo aumento da produção de MMP-3 (p<0,05) e redução da produção de MMP-8 após ativação com diferentes concentrações de LPS em relação ao controle, nos períodos de 24, 48 e 72 h. Em praticamente todos os grupos (incluindo os controles), pode-se verificar que a produção de MMP-3 ou MMP-8 aumentou significativamente em relação ao aumento do tempo. Pode-se concluir que: a) diferentes concentrações de endotoxinas apresentaram capacidade de induzir aumento significativo da produção de MMP-3 nos períodos de 24, 48 e 72 h, independente da concentração utilizada, sugerindo que esta ativação é dependente da presença de endotoxina e não da dose; b) a presença de diferentes concentrações de endotoxinas induziu significativa redução da produção de MMP-8 em relação ao controle, em todos os períodos de tempo avaliados. / The aim of this study was to evaluate the capacity of different concentrations of endotoxins (LPS) of Escherichia coli to induce secretion of MMP-3 and MMP-8 in macrophages in vitro, in the periods of 24, 48 and 72 h. For this purpose, human monocytes line U937 were differentiated into mature macrophages with phorbol-12-myristate-13- acetate (PMA) and were activated with different concentrations of endotoxins: 0 (control), 5, 10 and 20 EU/ml and the production of MMP-3 and MMP-8 were evaluated at three periods of time (24, 48 e 72 h) by immunoenzymatic assays (ELISA). The results were analyzed statistically by ANOVA and Tukey’s test, 5%. Significant increase in the production of MMP-3 (p<0.05) after the activation with different concentrations of LPS in relation to the control at the periods of 24, 48 and 72 h were observed. Regarding MMP-8, significant reduction in the production after the activation with different concentrations of endotoxins in relation to the control was observed at all the periods evaluated. Basically in all groups (including the controls) the production of MMP-3 and MMP-8 increased significantly in relation to the time. It could be concluded that: a) different concentrations of endotoxins were able to induce significant increase in the production of MMP-3 at the periods of 24, 48 and 72 h, independently of the concentration used, suggesting that this activation is dependent of the presence of the endotoxin and dosis-independent; b) the presence of different concentrations of endotoxins induced significant reduction in the production of MMP-8 in relation to the control in all the periods of evaluation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-04-01Bitstream added on 2014-06-13T18:20:14Z : No. of bitstreams: 1 kabbach_w_me_arafo.pdf: 487757 bytes, checksum: 39ad2a660914605ee0e6795c22edba78 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo do presente estudo foi avaliar in vitro a variação de temperatura e a microdureza Knoop superficial do esmalte durante o processo de clareamento dental com peróxido de hidrogênio a 35% sob irradiação da luz halógena com o comprimento de onda de 400 a 500nm (HL), luz emitida por diodo com comprimento de onda de 460 de 480 (LED) e laser de diodo (DL) de alta intensidade e comprimento de onda de 810nm, em dentes humanos extraídos. Inicialmente investigou-se a variação de temperatura superficial através da termografia de infravermelho e a temperatura do interior da câmara pulpar por meio de termopares em incisivos inferiores humanos, quando submetidos ao clareamento dental com peróxido de hidrogênio a 35% nas cores vermelha (HP) e verde (HPM) irradiados por: HL e LED. Quatro grupos (n=10) foram divididos de acordo com o gel clareador e a fonte de luz. Os resultados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey (p < 0,05). Os valores médios e desvios padrão do aumento de temperatura dentro da câmara pulpar com a HL foram de 4.4 ± 2.1 °C para HP, e 4.5 ± 1.2 °C para HPM; enquanto que nos grupos usando LED, foram 1.4 ± 0.3 °C para HP, e 1.5 ± 0.2 °C para HPM. Para todas as temperaturas superficiais a variação máxima dos grupos irradiados com HL foi 6.5 ± 1.5 °C para HP, e 7.5 ± 1.1 °C usando HPM; enquanto para os grupos usando LED, foram 2.8 ± 0.7 °C usando HP, e 3 ± 0.8 °C para HPM. Não houve diferença estatística entre o aumento da temperatura pulpar e superficial entre os grupos usando os diferentes géis (p < 0,05). As médias de temperatura foram significativamente maiores para os grupos usando HL quando comparados com aqueles irradiados com LED (p < 0,05). Ainda foi investigada a variação de temperatura superficial e assim determinado o tempo de demora para ser atingida a variação crítica de temperatura... / The objective of this in vitro study was to evaluate the variation of temperature and Knoop microhardness on enamel surface during the bleaching process whith 35% hydrogen peroxide under irradiation by halogen light whit the wavelength of 400 to 500nm (HL), LED whit the wavelength of 460 to 480nm and high intensity diode laser LED whit the wavelength of 810nm (LD) on extracted human teeth. Initially were investigated the variation of surface temperature (infrared thermography) and the temperature of the interior of the pulp chamber (thermocouples) in human mandibular incisors when subjected to dental bleaching with 35% hydrogen peroxide in the colors red (HP) and green(HPM) irradiated by: HL and LED. Four groups (n = 10) were divided according to the bleaching gel and light source. The results were submitted to the analysis of variance and Tukey test (p < 0.05). The mean values and standard deviations of the temperature increase inside the chamber pulp with HL were 4.4 ± 2.1 °C using HP and 4.5 ± 1.2 °C using HPM; while in LED groups, were 1.4 ± 0.3 °C to HP, and 1.5 ± 0.2 °C using HPM. For all surface temperatures, the maximum variation of the groups irradiated with HL was 6.5 ± 1.5 °C to HP and 7.5 ± 1.1 °C using HPM; while for the groups using LED, were 2.8° ± 0.7 °C using HP, and 3 ± 0.8 °C for HPM. There were no statistical difference between the increase of pulp and superficial temperature between groups using the various gels (p < 0.05). Mean temperatures were significantly higher for groups using HL compared with those irradiated with LED (p < 0.05). Was investigated the variation of surface temperature and thus given the time-delay to hit the critical variation of temperature (5.5 °C for the pulp chamber and 10 °C for periodontal). Forty-five human inferior incisors were divided into 3 groups and submitted to dental bleaching using...(Complete abstract, click electronic access below)

O objetivo deste estudo foi de tentar isolar e cultivar células da polpa de dentes decíduos humanos hígidos com diferentes graus de rizólise e avaliá-las após a expansão in vitro para parâmetros apresentados por células-tronco. Para tanto, o tecido pulpar foi obtido a partir de 30 dentes de crianças de 6 a 12 anos. A exodontia dos dentes foi indicada pelo cirurgião-dentista responsável pelo tratamento da criança. Os responsáveis pelos pacientes assinaram um termo de doação de material biológico aprovado pelo comitê de ética da UFRGS. Do total de dentes, 21 estavam em processo avançado de rizólise (grupo I), sendo que 17 possuíam raiz totalmente reabsorvida e 4 apresentavam cerca de de raiz residual. Os 9 dentes restantes não apresentavam reabsorção visível (grupo II). Todos os dentes extraídos foram imersos em meio de cultura para o transporte ao laboratório. Na capela de fluxo laminar, o tecido pulpar foi removido e incubado com colagenase tipo I e submetido a dissociação mecânica. A suspensão obtida foi semeada em placa de 12 poços e o meio de cultura trocado após 24 horas e após a cada 4 dias até a confluência de 90% ser atingida, quando eram realizadas as passagens. Na quinta e décima passagens, as células foram avaliadas pela citometria de fluxo quanto a seu fenótipo para CD29, CD34, CD44, CD45, CD90, CD117, CD133, CD146, CD184, STRO-1 e HLA-DR e para determinar a presença/ausência da expressão gênica de OCT4, por meio de RT-PCR. Nas mesmas passagens, as células foram submetidas a avaliação do seu crescimento in vitro e foram induzidas à diferenciação adipogênica, osteogênica e condrogênica. O isolamento das células foi considerado com sucesso em 25 amostras nas quais células aderidas foram verificadas após 24h. Apenas 17 destas atingiram confluência de 90%. Não foi possível estabelecer cultura do grupo II (n=9). O estabelecimento das culturas e a capacidade de proliferação foram independentes da quantidade de tecido pulpar remanescente coletado. As células nas quinta e décima passagens foram positivas para CD29, CD44 e CD90 (>95%) e para a expressão gênica de OCT-4. Positividade moderada foi vista para CD117 e CD133 e expressão inferior a 3% para CD34, CD45, HLA-DR, CD184 e STRO-1 em todas as análises. Foi pequena também, a marcação de CD146. O CD146 está relacionado com as células-tronco localizadas nos pericitos, sendo descrito como possível nicho das células-tronco pulpares. Todas as culturas foram capazes de diferenciação nas 3 linhagens celulares citadas. Portanto, as células isoladas eram células-tronco, pois foram aderentes ao plástico, positivas para marcadores característicos de células-tronco mesenquimais e pluripotentes. Considerando os baixos níveis de expressão de CD146, nós podemos sugerir que o nicho perivascular não é o único provedor das células-tronco pulpares. A facilidade de obtenção das células parece estar ligada ao processo de rizólise, visto que as células do tecido pulpar do grupo I apresentaram-se capazes de proliferação in vitro, enquanto que no grupo II esta não foi suficiente para permitir o estabelecimento das culturas. / The aim of this study was to isolate and grow cells from the pulp of human sound deciduous teeth with different levels of resorption, and evaluate stem cell parameters after growing them in vitro. Pulp tissue was removed from 30 different patients, aged from 6 to 12. A free informed term of consent was signed by the patient’s next of kin, approved by UFRGS’s Ethical Committee. From all the teeth, 21 were in advanced levels of resorption (group I): 17 had completely reabsorbed roots and 4 had ⅓ of residual roots. The 9 teeth left did not show any visible re-absorption (group II). The teeth were immersed in culture medium to be transported to the lab. In aseptic conditions, pulp tissue was removed, incubated with type I collagenase and mechanically dissociated. The suspension was seeded onto 12 well plates and the medium was changed every 4 days until the culture reached 90% confluence, when a passage was performed. The phenotype of the cells was analyzed on fifth and tenth passages, by flow cytometry for the following markers: CD29, CD34, CD44, CD45, CD90, CD117, CD133, CD146, CD184, STRO-1 and HLA-DR; and RT-PCR for OCT-4. On the same passages, cells were differentiated into adipocytes, osteoblasts and chondrocytes. Cell isolation was successful in 25 samples, where adherent cells were observed after 24h. Only 17 of these samples reached 90% confluence. It was not possible to establish cell culture from group II teeth (n=9). Cell growth and ability to proliferate in vitro were not dependent on the amount of pulp tissue that was collected. Cells on both fifth and tenth passages were positive for CD29, CD44 and CD90 (>95%) and also for the expression of OCT-4. Moderate labelling was observed for CD117 and CD133, while an expression lower than 3% for CD34, CD45, HLA-DR, CD 184 and STRO-1 was detected. Low amounts of CD146 were found in all analysis. CD146 is related to pericytes stem cells and therefore can be pulp stem cells niche. All cultures were able differentiate into all 3 cell types. According to these findings, the isolated pulp cells can be considered stem cells: they were adherent to plastic, positive for stem cell related markers and pluripotent. Considering the cells expressed low levels of CD146, we can infer that the perivascular niche isn’t the only source of pulpar stem cells. The easiness to obtain cells seems to be related to the root resorption process, because the cells from group I were able to proliferate in vitro, while group II cells were not.

As células-tronco provenientes da polpa de dentes decíduos esfoliados (SHED) são uma fonte promissora de células-tronco para a terapia regenerativa. Já foi demonstrado que elas podem se diferenciar em células endoteliais, mas os mecanismos envolvidos nesse processo ainda são desconhecidos. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo elucidar os mecanismos moleculares relacionados à diferenciação endotelial dessas células. Para isso, um meio de cultura para células endoteliais (EGM-2MV), suplementado por 50ng/mL rhVEGF, foi utilizado com sucesso como estímulo para as SHED se diferenciarem em células endoteliais em cultura de monocamada. Uma vez que, elas expressaram os marcadores endoteliais VEGFR-2 e CD-31. Além disso, quando as SHED foram expostas ao meio de diferenciação, a fosforilação de STAT-3 (um marcador de células-tronco) foi inibida de acordo com a concentração utilizada, enquanto a fosforilação de ERK e AKT foi estimulada. Quando um inibidor de ERK foi adicionado ao meio, a fosforilação de STAT-3 aumentou. Por outro lado, quando um inibidor de STAT-3 foi adicionado ao meio de cultura, a fosforilação de ERK aumentou. A inibição de ERK também impediu a diferenciação endotelial. Para confirmar esse resultado, shRNA MEK-1 SHED também falharam em expressar VEGFR-2 quando estimuladas. Além disso, scaffolds de fatias dentais foram semeadas com shRNA VEGFR-1 SHED ou shRNA controle e implantadas no subcutâneo de camundongos imunodeficientes. Após recuperados, um tecido muito semelhante à polpa dental foi formado no interior das fatias. No entanto, havia menos células CD-31 positivas nos vasos sanguíneos dos implantes semeados com VEGFR-1 shRNA SHED, sugerindo um papel do VEGFR-1 na formação de vasos sanguíneos. Em conclusão, o VEGFR-1 e a via de sinalização de ERK estão envolvidos no processo de diferenciação das SHED em células endoteliais. / Stem Cells from Exfoliated Deciduous Teeth (SHED) are a promising source of stem cells for regenerative therapy. It was already shown they can differentiate into endothelial cells, but the mechanisms involved in this process remain unclear. Therefore, the following study aimed to elucidate the molecular mechanisms related to endothelial differentiation of SHED. For this purpose, a culture media for endothelial cells (EGM-2MV), supplemented with 50ng/ml rhVEGF, was successfully used as stimuli for SHED to undergo endothelial differentiation in monolayer culture, as they expressed the endothelial markers VEGFR-2 and CD- 31. Moreover, when SHED were exposed to the differentiation medium, STAT-3 phosphorilation (a stemness marker) was inhibited while the ERK and AKT phosphorilation was stimulated. When an ERK inhibitor was added to the medium, the STAT-3 phosphorilation increased in a dependent concentration manner. On the other hand, when a STAT-3 inhibitor was added the ERK phosphorilation increased. The ERK inhibition also arrested endothelial differentiation. To confirm this results, shRNA MEK-1 SHED also failed to express VEGFR-2 when stimulated. Additionally, tooth slice scaffolds were seeded with shRNA VEGFR-1 SHED or shRNA control SHED and implanted, subcutaneously, into immunodeficient mice. After retrieved, a dental pulp-like tissue had been formed inside the tooth slice. However, there were fewer CD-31 positive blood vessels in the shRNA VEGFR-1 implants suggesting a role of VEGFR-1 in the formation of blood vessels by SHED. In conclusion, the VEGFR-1 and ERK pathway are involved in the process of differentiation of SHED into endothelial cells.

As células-tronco mesenquimais (CTMs) tornaram-se um grande interesse para a ciência por serem capazes de estimular a regeneração tecidual, apresentarem habilidade de se expandir e diferenciar em cultura e, consequentemente, apresentarem diversas possibilidades terapêuticas, bem como para a engenharia de tecidos. Muitos dos tecidos dentários também apresentam nichos de CTMs. O fácil acesso à polpa dos dentes decíduos, em virtude da esfoliação dental, a torna uma fonte muito atraente para a terapêutica e a engenharia de tecidos. Todos os avanços advindos das terapias baseadas em células-tronco tornam a preservação das fontes celulares, por longos períodos de tempo, um assunto de suma importância. Para que isso possa ocorrer, métodos de armazenamento devem ser adotados, tanto para as culturas celulares já estabelecidas, quanto para os tecidos inteiros. Uma das formas mais comuns de manutenção de culturas e de tecidos é a criopreservação em nitrogênio líquido. Contudo, existem poucas evidências no sentido de estabelecer um protocolo eficaz para o congelamento do dente decíduo intacto. Dessa forma, esse trabalho objetivou isolar, cultivar e caracterizar, para parâmetros apresentados para CTMs, as células pulpares após a criopreservação de dentes decíduos intactos por 7 dias. Para isso, vinte e seis dentes decíduos foram alocados em 2 grupos experimentais, sendo: grupo 1, células pulpares de dentes decíduos criopreservados intactos (grupo Crio) e grupo 2, células pulpares de dentes decíduos isoladas imediatamente após a exodontia (grupo fresco - controle). As células pulpares de ambos os grupos foram isoladas, cultivadas, analisadas por citometria de fluxo (CD14, CD29, CD34, CD45, CD73, CD90 e HLA-DR), submetidas aos protocolos de diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica, e aos ensaios de proliferação celular (WST-8). A morfologia celular de ambos os grupos foi avaliada por microscopia confocal. Os resultados demonstraram uma taxa de cultivo de 30% para o grupo Crio e 61% para o grupo Fresco. Não houve diferença estatística entre os grupos para os marcadores de superfície analisados. As células de ambos os grupos foram capazes de se diferenciar em células das 3 linhagens testadas. Para o ensaio de proliferação, não houve diferença estatística entre os grupos ao longo dos tempos testados (p>0,05), embora a média de dias entre o isolamento e a quinta passagem foi menor para o grupo controle (p=0,035). As células do grupo Crio mostraram morfologia alterada. Assim, conclui-se ser possível obter células-tronco da polpa de dentes decíduos congelados pelo protocolo sugerido, sem alterações imunofenotípicas. No entanto, esse protocolo demonstrou baixas taxas de sucesso de isolamento, menor capacidade de diferenciação e de proliferação, além de alteração da morfologia celular. / Mesenchymal stem cells (MSC) became of great value for science for being capable of stimulating tissue regeneration and showing ability to proliferate and differentiate when cultured properly. Dental tissues also present MSC niches as well. Mesenchymal stem cells from the pulp of deciduous teeth are considered an easy access source during a specific period of time in the patients life, when teeth are undergoing exfoliation; therefore, very attractive for cell based therapeutics and tissue engineering. All advances seen in cell based therapies for the last years depend on cell or tissue preservation for long periods of time. Thus, storage methods must be adopted for cultures of cells and whole tissues. The most common technique to preserve cell cultures and tissues is cryopreservation with liquid nitrogen. However, fragile evidence concerns the cryopreservation of intact deciduous teeth. This research aimed to isolate, cultivate and characterize the dental pulp cells of intact cryopreserved deciduous teeth and compare to the dental pulp cells of non-cryopreserved deciduous teeth. Thirteen pairs of deciduous teeth were donated from patients in orthodontic treatment and were randomly allocated in two different groups. The first group was made of cryopreserved intact deciduous teeth (Cryo group), and in second group pulp cells were isolated from fresh teeth (Fresh group). The cells of both groups were isolated, cultivated and characterized for mesenchymal stem cell parameters, and then compared for isolation and proliferation rates, surface markers expression (CD14, CD29, CD34, CD45, CD73, CD90 and HLA-DR), differentiation ability and morphology. The culture rate was 30% for the cryopreserved group and 61% for the fresh. There were no statistical differences between the groups for the surface markers tested. Cells in both groups were capable of differentiating in the 3 mesenchymal lineages. For the proliferation assay, there was no statistical difference between groups throughout the time tested although the mean time between isolation and the fifth passage was lower for the control group (p=0,035). Cells from Cryo group showed altered morphology. The present study showed that Dental Pulp Stem Cells can be obtained from cryopreserved intact deciduous teeth without changes in the immunophenotypical profile, however low success rates for isolation, differentiation ability and morphological alterations were observed.

Objetivo: O objetivo do presente estudo foi avaliar morfologicamente os tecidos pulpar e periapical de molares de ratos com a polpa vital e expostos ao meio bucal durante o desenvolvimento radicular, além de detectar a localização do STRO-1 e do BMP4 nos mesmos. Métodos: Foram utilizados 24 ratos machos da linhagem Wistar com quatro semanas de idade. A fim de induzir a necrose, foi realizada a exposição pulpar dos primeiros molares inferiores esquerdos em condições não-assépticas e deixando a polpa exposta ao ambiente oral (grupo teste). Os molares inferiores do lado direito não sofreram intervenção e serviram como grupo controle. A eutanásia dos animais foi realizada nos tempos de 7, 10, 13 e 16 semanas de vida (o equivalente a 3, 6, 9 e 12 semanas após a intervenção). Após, as mandíbulas foram dissecadas e processadas para a análise histológica através de Hematoxilina-Eosina e Imunohistoquímica. Foram comparadas, entre os grupos, em cada um dos períodos, a reação inflamatória periapical, as características do tecido pulpar (células inflamatórias, vascularização, odontoblastos, degeneração, destruição tecidual), fechamento do forame e presença de reabsorções. Resultados: Todos os dentes do grupo teste apresentaram necrose pulpar e a interrupção do desenvolvimento radicular. Enquanto isso, os dentes do grupo controle apresentaram o desenvolvimento normal dos tecidos dentários. Quanto à imunohistoquímica, foi constatada a marcação pelo BMP-4 no tecido pulpar dos dentes do grupo controle. Não houve, no entanto, marcação nos dentes do grupo teste. Para o STRO-1, a marcação foi mais evidente na região dos vasos sanguíneos, tanto no grupo controle, quanto no grupo teste. Para nenhum dos anticorpos, foi constatada marcação na região da papila apical. Conclusão: No presente estudo, a técnica imunohistoquímica não foi suficiente para a avaliação da presença de células-tronco na região da papila de dentes com rizogênese incompleta e necrose pulpar. É possível que a presença de infecção e a reação inflamatória tenham bloqueado a expressão do STRO-1 e do BMP-4. / Objective: the aim of this study was to characterize the features of live and necrotic dental pulps of molar teeth in rats with developing roots, and to assess the expression of STRO-1 and BMP-4. Methods: twenty-four 4-month-old male Wistar rats were used. To induce necrosis, the pulps of the first lower left molars were exposed to the oral environment. The lower right molars served as the control non-operated group. Euthanasia of animals was carried out at 7, 10, 13 and 16 weeks and the jaws were dissected and processed for histological analysis by hematoxylin-eosin and immunohistochemistry. The periapical inflammatory reaction, the characteristics of the pulp tissue (inflammatory cells, vascularity, odontoblasts, degeneration, tissue destruction), closure of the foramen and presence of resorptions were described at each period. Results: all teeth from the test group presented pulp necrosis, occurring discontinuation of root development. Meanwhile, the teeth of the control group showed normal development of dental tissues. BMP-4-positive cells were detected in the pulp of teeth from the control group. However, there was no expression in teeth of the test group. For STRO-1, expression was more evident in the blood vessels, both for the control group and for the test group. Apical papilla evidenced no BMP-4 nor STRO-1 expression. Conclusion: Immunohistochemistry was not sufficient to evaluate the presence of stem cells in the apical papilla region of nonvital immature teeth. It is possible that the inflammatory process has blocked the expression of STRO-1 and BMP-4., Probably, infection has negatively modulated this expression.

Objetivo: O objetivo do presente estudo foi avaliar morfologicamente os tecidos pulpar e periapical de molares de ratos com a polpa vital e expostos ao meio bucal durante o desenvolvimento radicular, além de detectar a localização do STRO-1 e do BMP4 nos mesmos. Métodos: Foram utilizados 24 ratos machos da linhagem Wistar com quatro semanas de idade. A fim de induzir a necrose, foi realizada a exposição pulpar dos primeiros molares inferiores esquerdos em condições não-assépticas e deixando a polpa exposta ao ambiente oral (grupo teste). Os molares inferiores do lado direito não sofreram intervenção e serviram como grupo controle. A eutanásia dos animais foi realizada nos tempos de 7, 10, 13 e 16 semanas de vida (o equivalente a 3, 6, 9 e 12 semanas após a intervenção). Após, as mandíbulas foram dissecadas e processadas para a análise histológica através de Hematoxilina-Eosina e Imunohistoquímica. Foram comparadas, entre os grupos, em cada um dos períodos, a reação inflamatória periapical, as características do tecido pulpar (células inflamatórias, vascularização, odontoblastos, degeneração, destruição tecidual), fechamento do forame e presença de reabsorções. Resultados: Todos os dentes do grupo teste apresentaram necrose pulpar e a interrupção do desenvolvimento radicular. Enquanto isso, os dentes do grupo controle apresentaram o desenvolvimento normal dos tecidos dentários. Quanto à imunohistoquímica, foi constatada a marcação pelo BMP-4 no tecido pulpar dos dentes do grupo controle. Não houve, no entanto, marcação nos dentes do grupo teste. Para o STRO-1, a marcação foi mais evidente na região dos vasos sanguíneos, tanto no grupo controle, quanto no grupo teste. Para nenhum dos anticorpos, foi constatada marcação na região da papila apical. Conclusão: No presente estudo, a técnica imunohistoquímica não foi suficiente para a avaliação da presença de células-tronco na região da papila de dentes com rizogênese incompleta e necrose pulpar. É possível que a presença de infecção e a reação inflamatória tenham bloqueado a expressão do STRO-1 e do BMP-4. / Objective: the aim of this study was to characterize the features of live and necrotic dental pulps of molar teeth in rats with developing roots, and to assess the expression of STRO-1 and BMP-4. Methods: twenty-four 4-month-old male Wistar rats were used. To induce necrosis, the pulps of the first lower left molars were exposed to the oral environment. The lower right molars served as the control non-operated group. Euthanasia of animals was carried out at 7, 10, 13 and 16 weeks and the jaws were dissected and processed for histological analysis by hematoxylin-eosin and immunohistochemistry. The periapical inflammatory reaction, the characteristics of the pulp tissue (inflammatory cells, vascularity, odontoblasts, degeneration, tissue destruction), closure of the foramen and presence of resorptions were described at each period. Results: all teeth from the test group presented pulp necrosis, occurring discontinuation of root development. Meanwhile, the teeth of the control group showed normal development of dental tissues. BMP-4-positive cells were detected in the pulp of teeth from the control group. However, there was no expression in teeth of the test group. For STRO-1, expression was more evident in the blood vessels, both for the control group and for the test group. Apical papilla evidenced no BMP-4 nor STRO-1 expression. Conclusion: Immunohistochemistry was not sufficient to evaluate the presence of stem cells in the apical papilla region of nonvital immature teeth. It is possible that the inflammatory process has blocked the expression of STRO-1 and BMP-4., Probably, infection has negatively modulated this expression.

O objetivo deste estudo foi de tentar isolar e cultivar células da polpa de dentes decíduos humanos hígidos com diferentes graus de rizólise e avaliá-las após a expansão in vitro para parâmetros apresentados por células-tronco. Para tanto, o tecido pulpar foi obtido a partir de 30 dentes de crianças de 6 a 12 anos. A exodontia dos dentes foi indicada pelo cirurgião-dentista responsável pelo tratamento da criança. Os responsáveis pelos pacientes assinaram um termo de doação de material biológico aprovado pelo comitê de ética da UFRGS. Do total de dentes, 21 estavam em processo avançado de rizólise (grupo I), sendo que 17 possuíam raiz totalmente reabsorvida e 4 apresentavam cerca de de raiz residual. Os 9 dentes restantes não apresentavam reabsorção visível (grupo II). Todos os dentes extraídos foram imersos em meio de cultura para o transporte ao laboratório. Na capela de fluxo laminar, o tecido pulpar foi removido e incubado com colagenase tipo I e submetido a dissociação mecânica. A suspensão obtida foi semeada em placa de 12 poços e o meio de cultura trocado após 24 horas e após a cada 4 dias até a confluência de 90% ser atingida, quando eram realizadas as passagens. Na quinta e décima passagens, as células foram avaliadas pela citometria de fluxo quanto a seu fenótipo para CD29, CD34, CD44, CD45, CD90, CD117, CD133, CD146, CD184, STRO-1 e HLA-DR e para determinar a presença/ausência da expressão gênica de OCT4, por meio de RT-PCR. Nas mesmas passagens, as células foram submetidas a avaliação do seu crescimento in vitro e foram induzidas à diferenciação adipogênica, osteogênica e condrogênica. O isolamento das células foi considerado com sucesso em 25 amostras nas quais células aderidas foram verificadas após 24h. Apenas 17 destas atingiram confluência de 90%. Não foi possível estabelecer cultura do grupo II (n=9). O estabelecimento das culturas e a capacidade de proliferação foram independentes da quantidade de tecido pulpar remanescente coletado. As células nas quinta e décima passagens foram positivas para CD29, CD44 e CD90 (>95%) e para a expressão gênica de OCT-4. Positividade moderada foi vista para CD117 e CD133 e expressão inferior a 3% para CD34, CD45, HLA-DR, CD184 e STRO-1 em todas as análises. Foi pequena também, a marcação de CD146. O CD146 está relacionado com as células-tronco localizadas nos pericitos, sendo descrito como possível nicho das células-tronco pulpares. Todas as culturas foram capazes de diferenciação nas 3 linhagens celulares citadas. Portanto, as células isoladas eram células-tronco, pois foram aderentes ao plástico, positivas para marcadores característicos de células-tronco mesenquimais e pluripotentes. Considerando os baixos níveis de expressão de CD146, nós podemos sugerir que o nicho perivascular não é o único provedor das células-tronco pulpares. A facilidade de obtenção das células parece estar ligada ao processo de rizólise, visto que as células do tecido pulpar do grupo I apresentaram-se capazes de proliferação in vitro, enquanto que no grupo II esta não foi suficiente para permitir o estabelecimento das culturas. / The aim of this study was to isolate and grow cells from the pulp of human sound deciduous teeth with different levels of resorption, and evaluate stem cell parameters after growing them in vitro. Pulp tissue was removed from 30 different patients, aged from 6 to 12. A free informed term of consent was signed by the patient’s next of kin, approved by UFRGS’s Ethical Committee. From all the teeth, 21 were in advanced levels of resorption (group I): 17 had completely reabsorbed roots and 4 had ⅓ of residual roots. The 9 teeth left did not show any visible re-absorption (group II). The teeth were immersed in culture medium to be transported to the lab. In aseptic conditions, pulp tissue was removed, incubated with type I collagenase and mechanically dissociated. The suspension was seeded onto 12 well plates and the medium was changed every 4 days until the culture reached 90% confluence, when a passage was performed. The phenotype of the cells was analyzed on fifth and tenth passages, by flow cytometry for the following markers: CD29, CD34, CD44, CD45, CD90, CD117, CD133, CD146, CD184, STRO-1 and HLA-DR; and RT-PCR for OCT-4. On the same passages, cells were differentiated into adipocytes, osteoblasts and chondrocytes. Cell isolation was successful in 25 samples, where adherent cells were observed after 24h. Only 17 of these samples reached 90% confluence. It was not possible to establish cell culture from group II teeth (n=9). Cell growth and ability to proliferate in vitro were not dependent on the amount of pulp tissue that was collected. Cells on both fifth and tenth passages were positive for CD29, CD44 and CD90 (>95%) and also for the expression of OCT-4. Moderate labelling was observed for CD117 and CD133, while an expression lower than 3% for CD34, CD45, HLA-DR, CD 184 and STRO-1 was detected. Low amounts of CD146 were found in all analysis. CD146 is related to pericytes stem cells and therefore can be pulp stem cells niche. All cultures were able differentiate into all 3 cell types. According to these findings, the isolated pulp cells can be considered stem cells: they were adherent to plastic, positive for stem cell related markers and pluripotent. Considering the cells expressed low levels of CD146, we can infer that the perivascular niche isn’t the only source of pulpar stem cells. The easiness to obtain cells seems to be related to the root resorption process, because the cells from group I were able to proliferate in vitro, while group II cells were not.

As células-tronco provenientes da polpa de dentes decíduos esfoliados (SHED) são uma fonte promissora de células-tronco para a terapia regenerativa. Já foi demonstrado que elas podem se diferenciar em células endoteliais, mas os mecanismos envolvidos nesse processo ainda são desconhecidos. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo elucidar os mecanismos moleculares relacionados à diferenciação endotelial dessas células. Para isso, um meio de cultura para células endoteliais (EGM-2MV), suplementado por 50ng/mL rhVEGF, foi utilizado com sucesso como estímulo para as SHED se diferenciarem em células endoteliais em cultura de monocamada. Uma vez que, elas expressaram os marcadores endoteliais VEGFR-2 e CD-31. Além disso, quando as SHED foram expostas ao meio de diferenciação, a fosforilação de STAT-3 (um marcador de células-tronco) foi inibida de acordo com a concentração utilizada, enquanto a fosforilação de ERK e AKT foi estimulada. Quando um inibidor de ERK foi adicionado ao meio, a fosforilação de STAT-3 aumentou. Por outro lado, quando um inibidor de STAT-3 foi adicionado ao meio de cultura, a fosforilação de ERK aumentou. A inibição de ERK também impediu a diferenciação endotelial. Para confirmar esse resultado, shRNA MEK-1 SHED também falharam em expressar VEGFR-2 quando estimuladas. Além disso, scaffolds de fatias dentais foram semeadas com shRNA VEGFR-1 SHED ou shRNA controle e implantadas no subcutâneo de camundongos imunodeficientes. Após recuperados, um tecido muito semelhante à polpa dental foi formado no interior das fatias. No entanto, havia menos células CD-31 positivas nos vasos sanguíneos dos implantes semeados com VEGFR-1 shRNA SHED, sugerindo um papel do VEGFR-1 na formação de vasos sanguíneos. Em conclusão, o VEGFR-1 e a via de sinalização de ERK estão envolvidos no processo de diferenciação das SHED em células endoteliais. / Stem Cells from Exfoliated Deciduous Teeth (SHED) are a promising source of stem cells for regenerative therapy. It was already shown they can differentiate into endothelial cells, but the mechanisms involved in this process remain unclear. Therefore, the following study aimed to elucidate the molecular mechanisms related to endothelial differentiation of SHED. For this purpose, a culture media for endothelial cells (EGM-2MV), supplemented with 50ng/ml rhVEGF, was successfully used as stimuli for SHED to undergo endothelial differentiation in monolayer culture, as they expressed the endothelial markers VEGFR-2 and CD- 31. Moreover, when SHED were exposed to the differentiation medium, STAT-3 phosphorilation (a stemness marker) was inhibited while the ERK and AKT phosphorilation was stimulated. When an ERK inhibitor was added to the medium, the STAT-3 phosphorilation increased in a dependent concentration manner. On the other hand, when a STAT-3 inhibitor was added the ERK phosphorilation increased. The ERK inhibition also arrested endothelial differentiation. To confirm this results, shRNA MEK-1 SHED also failed to express VEGFR-2 when stimulated. Additionally, tooth slice scaffolds were seeded with shRNA VEGFR-1 SHED or shRNA control SHED and implanted, subcutaneously, into immunodeficient mice. After retrieved, a dental pulp-like tissue had been formed inside the tooth slice. However, there were fewer CD-31 positive blood vessels in the shRNA VEGFR-1 implants suggesting a role of VEGFR-1 in the formation of blood vessels by SHED. In conclusion, the VEGFR-1 and ERK pathway are involved in the process of differentiation of SHED into endothelial cells.