Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Swine postweaning diarrhea (PWD) is a disease of considerable economic importance and is commonly associated with Escherichia coli. However, the vimlence mechanisms of E. coli associated with PWD have not all been elucidated. In the present study, a collection of 32 porcine E. coli 045 strains isolated from PWD were examined genotypically for the presence of virulence detenninants and phenotypically for adherence to mammalian cells in vivo and in vitro and for the expression of virulence factors related to their pathogenicity. Our results indicated that these isolates did not possess the virulence determinants, LT, STap, STb, VT1, VT2, F4, F5, F6, and F41 of enterotoxigenic or verotoxigenic E. coll. However, the majority of the strains carry eae^-related nucleotide sequences and are able to induce attaching and effacing (A/E) lesions in experimentally inoculated gnotobiotic piglets in vivo and on pig ileal expiants in vitro. The A/E lésions induced by these strains were characterized by intimate adherence of bacteria to the intestinal epithelial cell membrane with effacement of the microvilli, identical to those observed in the natural infection of pigs and to those induced by human A/E E. coli (AEEC). We also observed that the severity and extent of A/E lésions appeared to be related to the time of onset and the severity of the diarrhea in the inoculated piglets indicating an implication of A/E lesions in the induction of diarrhea in the experimentally inoculated piglets. However, none of these 045 isolates exhibited localized adherence to HEp-2 cells. The A/E-positive 045 isolates expressed an antigenically related 97 kDa outer membrane protein. The amino-terminal sequence of this protein showed 100% identity in the stretch of all known thirteen amino acids to the EaeA protein derived from the eaeA genes of human enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli, indicating that it is the eaeA gene product of porcine A/E isolates. The EaeA protein of E. coli 045 is serologically related to the EaeA protein of rabbit and human AEEC strains. It has an apparent isoelectric point of 8.4, is located in the bacterial outer membrane and is exposed on the bacterial surface. Most notably, the capacity of 045 isolates to induce A/E lesions appears to be correlated to the production of the EaeA protein, suggesting that expression of the EaeA protein is important for bacterial attachment to and effacement of enterocytes. Thus, we demonstrated that the E. coli 045 isolates associated with PWD in pigs are AEEC and that expression of the EaeA protein plays an important role in the pathogenicity of these isolates. We suggest that E. coli isolates capable of inducing A/E lesions could be one of the causative agents of swine PWD. / Escherichia coli (E. colî) est une bactérie gram-négative appartenant à la famille des entérobactéries. Elle constitue une grande partie de la flore intestinale normale chez l'homme et les animaux. Toutefois, certaines souches peuvent entraîner des infections intestinales ou extra-intestinales (237). Actuellement, les souches de E. coli responsables d'infections intestinales peuvent être regroupées en sept différentes classes: E. coli entérotoxinogènes (ETEC); E. coli entéroinvasifs (EIEC); E. coli entéropathogènes (EPEC); E. coli entérohémorrhagiques (EHEC); E. coli vérotoxinogènes (VTEC); E. coli adhèrent de manière diffuse (DAEC); E. coli entéroaggregatifs (EAggEC) (214). E. coli est capable d'induire la diarrhée, via divers mécanismes. En effet, ce micro-organisme possède différents facteurs de virulence spécifiques interagissant avec la muqueuse intestinale. Les ETEC adhèrent à la muqueuse de l'intestin grêle, grâce à des adhésines fimbriaires, sécrètent des entérotoxines provocant ainsi une diarrhée aqueuse. Les EIEC envahissent les cellules épithéliales du côlon et entraînent une dysenterie (217). Les EPEC sont responsables d'un grand nombre de diarrhées infantiles. Ils sont définis comme des souches non-entéroinvasives qui ne produisent aucune entérotoxine classique (73). Les EPEC adhèrent intimement à la muqueuse intestinale causant la destruction des microvillosités. Ce type de phénomène est appelé communément des lésions attachantes et effaçantes (A/E). Le nom de AEEC a été attribué aux souches d’E. coli produisant ce type de lésions (73). Les EHEC sécrètent des vérotoxines (VT) et sont de plus en plus souvent incriminés dans des épidémies de colite hémorragique. Ces souches sont également des AEEC. Les VTEC produisent une vérotoxine. Quant aux infections induites par DAEC et par EAggEC, leur mécanisme pathogène demeure actuellement peu connu (214). Parmi les différentes catégories d'E. coli diarrhéiques, seuls les ETEC et les VTEC ont été formellement identifiés chez le porcelet (99). D'autres classes d'E. coli entéropathogènes existent probablement chez le porcelet; toutefois, leur rôle demeure méconnu. En période post-sevrage, la diarrhée constitue l'une des principales causes de morbidité et de mortalité (99). La pathogénicité de ce type de diarrhée apparaît beaucoup plus complexe que celle des diarrhées néonatales. Des agents infectieux tels que E. coli, le rotavirus et le coronavirus de la gastro-entérite transmissible sont régulièrement mis en évidence chez les porcelets diarrhéiques en période post-sevrage (99). Les E. coli sont impliqués dans 50% et plus de cas de diarrhée qui apparaissent généralement pendant la première semaine post-sevrage. La majorité des souches isolées chez ces porcelets appartiennent aux classes ETEC (155, 242), ou VTEC (122). Il existe toutefois d'autres souches d'E. coli impliquées dans les troubles de diarrhée post-sevrage. Au Québec, nous avons caractérisé des souches appartenant au sérogroupe 045 qui sont associées à la diarrhée post-sevrage du porcelet et à des lésions d'A/E. Cependant, le mécanisme impliqué dans le développement de ces diarrhées reste encore inconnu. Les objectifs de notre étude étaient multiples: (l) caractériser génotypiquement plusieurs souches 045 afin d'identifier la présence de facteurs de virulence spécifiques aux ETEC, VTEC et AEEC; (2) déterminer la capacité de ces souches à causer les lésions d'A/E au niveau de l'épithélium intestinal de porcelets gnotobiotiques et une toxicité au niveau des cellules HEp-2; (3) développer une technique in vitro permettant d'étudier la capacité des différentes souches d'E. coli 045 d'induire les lésions d'A/E; (4) identifier les principales structures membranaires d'E. coli responsables du développement des lésions d'A/E. Dans le but de caractériser génotypiquement des souches 045, nous avons démontré que les 32 souches d'E. coli 045 examinées étaient majoritairement négatives pour les sondes spécifiques aux entérotoxines LT, STap, STb, VT2 et pour les fimbriae F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) et F41 rencontrés chez ETEC et VTEC. Parmi ces souches, une seule était positive pour STb et trois l'étaient pour le fimbriae F4. De plus, les souches isolées ont été examinées aussi pour la présence de eaeA Ç"E. coli attaching and effacing") b^jA ("bundle-forming pili") et EAF ("E. coli adherence factor"). Ces gènes étant associés aux souches AEEC chez l'homme. Des 32 souches isolées, 25 hybridaient avec une sonde spécifique au gène eaeA et 11 avec une sonde spécifique à la protéine EAF. Cependant, aucune souche n'a réagit avec la sonde spécifique au gène bjpA. Ces résultats indiquent que les souches 045 n'appartiennent ni à la famille des ETEC ni à celle des VTEC, mais possèdent certains facteurs de virulence des AEEC. Dans le but de déterminer la capacité des souches 045 à provoquer les lésions d'A/E au niveau de l'épithélium intestinal de porcelets gnotobiotiques et une toxicité au niveau des cellules HEp-2, nous avons démontré que 10 des 12 souches eaeA-positives causent les lésions d'A/E chez les porcs nouveau-nés infectés expérimentalement, alors qu'aucune lésion d'A/E n'a été décelée avec les trois souches eaeA-négatives. De plus, nous avons observé un attachement intime des bactéries à la surface cellulaire et un effacement des microvillosités accompagnés d'une formation de structures en piédestal et en forme de coupe. Ces lésions semblent être identiques à celles décrites pour les souches d'EPEC chez l'homme. Cependant, contrairement aux souches AEEC humaines, aucune souche porcine n'a pu démontré une adhérence au niveau des cellules HEp-2. Chez le porc inoculé, nous avons pu observer une corrélation entre la sévérité des lésions et celle de la diarrhée. Cette observation indique que les lésions d'A/E pourraient être impliquées dans l'induction de la diarrhée. Nos résultats démontrent l'importance du gène eaeA dans les souches porcines. Nous avons également montré que les souches d'E. coli 045 font partie intégrante de la famille des AEEC. Nos résultats suggèrent aussi l'existence de différents mécanismes de pathogénicité chez les souches 045. Afin de déterminer la capacité des souches d'E. coli 045 à induire des lésions d'A/E, nous avons développé une nouvelle technique m vitro utilisant la culture de l'iléon de porcelet nouveau-né. Lors de l'inoculation des cultures avec des isolats 045, nous avons observé un attachement des bactéries et un effacement des microvillosités accompagnés de structures en piédestal et en forme de coupe. L'attachement initial des bactéries aux entérocytes a été observé deux à quatre heures après l'inoculation et les lésions de type A/E ont été observées huit heures après l'inoculation. Nous proposons ici un modèle in vitro permettant d'étudier la capacité des E. coli à causer des lésions de type A/E. Les résultats obtenus montrent que 22 des 24 isolais 045 eaeA-positifs induisent des lésions de type A/E dans les explants de l'iléon. De plus, in vitro, certaines souches sont plus pathogènes que d'autres. Cette différence de rapidité dans l'induction des lésions d'A/E est probablement due aux facteurs de virulence de la bactérie. Ces résultats indiquent que certains déterminants impliqués dans le développement des lésions d'A/E pourraient être présents dans certains isolats et absents dans d'autres. Utilisant des modèles in vitro et in vivo, nous avons aussi démontré que seuls les isolats eaeA-positïîs sont capables d'induire les lésions d'A/E typiques. Nos résultats suggèrent donc que le déterminant eaeA joue un rôle important dans l'induction des lésions d'A/E. Cependant, ti-ois isolats eaeA-positïîs n'ont pas induit ce type de lésions. Quatre hypothèses sont déjà suggérées: (l) une défectuosité du gène eaeA; (2) une régulation de l'expression du gène eaeA; (3) l'absence d'un déterminant dont la fonction est similaire au BFP; (4) ou alors l'intervention d'un facteur inconnu. Afin d'identifier les structures de surface d'E. coli du sérotype 045 impliquées dans le développement des lésions d'A/E, l'expression de la protéine EaeA ou intimine, produit du gène eaeA, a été déterminé sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) et immunobuvardage. Les résultats obtenus montrent que la majorité (20/22) des souches attachantes et effaçantes d'E. coli expriment une protéine de 97 kDa, alors que cette protéine est absente dans les dix souches non attachantes et non effaçantes. D'autre part, la séquence d'acides aminés N-terminale de la protéine de 97 kDa démontre une homologie avec la protéine EaeA déduite par le gène eaeA des souches EPEC et EHEC humaines. Les résultats du séquençage protéique suggèrent également que la maturation de la protéine EaeA des AEEC ainsi que celle de la protéine EaeA des EPEC et des EHEC s'effectue au niveau du 40e acide aminé. Le premier acide aminé inconnu de la protéine de 97 kDa de la souche 045 porcine correspond au 40 acide aminé (asparagine) de la protéine EaeA des EPEC et des EHEC. Ces conclusions ont été obtenues par comparaison avec le gène eaeA. Une électrophorèse (isoelectric focusing) de la protéine EaeA purifiée par la technique d'immunoaffinité indique que le pl de la protéine EaeA est de 8.4 comparé au pl de 9.5 de la protéine EaeA des souches humaines (358). La protéine EaeA du sérotype 045 constitue une des protéines de la membrane externe des bactéries. Enfin, en utilisant le sémm polyclonal généré par une immunisation de lapin avec des E. coli porcins 045, ou RDEC-1 ou encore en utilisant des anticorps (E2348/69) d'origine humaine, nous avons observé des réactions sérologiques croisées chez différentes espèces animales. Nous avons produit des anticorps monoclonaux spécifiques à la protéine EaeA de souche porcine. L'hybridome Cil, dirigé spécifiquement contre la protéine EaeA, réagit avec une protéine EaeA des souches AEEC de lapin, mais ne reconnaît pas les souches d'origines humaine et canine. Cet anticorps monoclonal semble reconnaître la forme conformationnelle de l'épitope ainsi que sa forme dénaturée. Par immunobuvardage, cet anticorps réagit également avec la protéine EaeA de la souche de lapin (RDEC-1), mais ne réagit pas avec des souches d'origine humaine (E2348/69) ou canine (89-4221). Nous avons démontré, à l'aide d'anticorps polyclonaux, par immunobuvardage et ELISA, que les protéines EaeA sont spécifiques des sérogroupes 045, excepté pour la souche 81-4420. Dans la présente étude, nous avons observé par ELISA des variations dans la production des protéines EaeA parmi les isolats porcins A/E 045. Une ix n correlation significative (p < 0.05) a été observée entre la quantité de protéine EaeA exprimée et la sévérité des lésions d'A/E induites m vivo par les isolats du sérogroupe 045. Ces résultats montrent une corrélation entre la production de la protéine EaeA et la capacité d'induire les lésions d'A/E. D'autre part, la quantité de protéine EaeA produite in vitro, pourrait aussi déterminer la sévérité des lésions d'A/E in vivo. Utilisant une technique d'immunofluorescence (IF) et un test de sensibilité de la protéine EaeA à certaines protéases, nous avons démontré que la protéine EaeA est localisée A la surface de la bactérie. D'une part, l'anticorps Cil réagit avec la bactérie entière indiquant ainsi la présence de la protéine native EaeA à la surface bactérienne. D'autre part, la dégradation de la protéine EaeA de la souche 045 AEEC par la papaïne a été observée lorsque (a) la cellule bactérienne est intacte; (b) les OMPs et la protéine EaeA purifiée sont soumis à des concentrations croissantes de papaïne, indiquant que la protéine EaeA est exposée A la surface externe de la bactérie. La localisation sur la surface externe de la bactérie est probablement nécessaire pour que la protéine EaeA puisse se lier à un ligand présent sur les cellules de mammifères. En conclusion, nous avons démontré qu'E. coli du sérogroupe 045, associé à la diarrhée post-sevrage du porc, induit des lésions attachantes et effaçantes m vivo et in vitro. Ces souches sont donc des AEEC. Leur capacité d'induire des lésions d'A/E semble être liée à la présence du gène eaeA et non au gène bjpA ou au facteur EAF. Nos résultats suggèrent que la protéine EaeA du sérotype 045 joue um rôle important dans la pathogénicité de la bactérie. En tenant compte des différents sérogroupes et de la presence ou absence du gène bjpA, les isolats d’E. coli du sérogroupe 045 différent des EPEC humains. Cependant, ces isolats ressemblent beaucoup plus aux EPEC humains qu'à toute autre catégorie d'E. coli diarrhéique. Nous considérons donc que les isolats d'E. coli caractérisés dans cette étude sont des EPEC-porcins (EPEC-P).

Les diarrhées post-sevrages causées par des infections à Escherichia coli entérotoxinogène positif pour le fimbriae F4 (ETEC F4), entraînent des pertes économiques importantes chez les producteurs de porc. Depuis quelques années, l’utilisation de probiotiques, comme additif alimentaire pour prévenir ce type d’infection entérique et réduire les traitements aux antimicrobiens, suscite un intérêt grandissant en production porcine. Le but du présent travail est de déterminer l’influence de l’administration des probiotiques Pediococcus acidilactici (PA) et Saccharomyces cerevisiae boulardii (SCB) sur la colonisation et l’attachement des ETEC F4, l’accumulation de fluide intestinal et l’expression de cytokines dans l’iléon de porcelets sevrés. Dès la naissance, différentes portées de porcelets ont été affectées aux traitements suivants : PA, SCB, PA + SCB, témoin et témoin avec antibiotiques (ATB). Une dose quotidienne de probiotiques (1 × 109 UFC) a été administrée aux porcelets des groupes probiotiques durant la lactation et après le sevrage. Sept jours après le sevrage, à 28 jours d’âge, des porcelets positifs pour le récepteur intestinal spécifique pour F4 ont été infectés oralement avec une souche ETEC F4. Les porcelets ont été euthanasiés 24 heures après l’infection (jour 29) et différents échantillons intestinaux ont été prélevés. Chez les porcelets recevant des probiotiques, l’attachement des ETEC F4 à la muqueuse iléale était significativement diminué chez les groupes PA ou SCB en comparaison avec le groupe ATB. Finalement, l’expression de cytokines intestinales était plus élevée chez les porcs du groupe PA + SCB en comparaison avec les porcelets témoins. En conclusion, les résultats de cette étude suggèrent que l’administration de probiotiques pourrait être une alternative pour limiter les infections à ETEC F4 chez le porc. / Postweaning diarrhea (PWD) associated with F4-positive enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC F4) causes important economic losses in swine production. Since a couple of years, the use of probiotics as feed additives to prevent such enteric infections and reduce the use of antimicrobial treatments, has gained in interest. The aim of the present study is to evaluate the effects of Pediococcus acidilactici (PA) and Saccharomyces cerevisiae boulardii (SCB), on ETEC F4 colonization and attachment, accumulation of intestinal fluid and cytokines expression in weaned pig’s ileum. At birth, different litters of pigs were allocated to the following treatments: PA, SCB, PA + SCB, control (CTRL) and control with antibiotics (ATB). Probiotics (1 × 109 CFU) were administered daily to probiotics group during the lactation period and after weaning. One week after weaning, at 28 days of age, all F4-receptor-positive pigs were orally challenged with an ETEC F4 strain. Pigs were slaughter 24 hours later (day 29) and different intestinal samples were collected. In pigs treated with PA or SCB, the attachment of ETEC F4 to the ileal mucosa was significantly reduced in comparison with the ATB group. Finally, intestinal cytokines were upregulated in PA + SCB group in comparison with the CTRL group. In conclusion, these results suggest that administration of probiotics could be an alternative to attenuate ETEC F4 infection in pigs.

Les diarrhées post-sevrages causées par des infections à Escherichia coli entérotoxinogène positif pour le fimbriae F4 (ETEC F4), entraînent des pertes économiques importantes chez les producteurs de porc. Depuis quelques années, l’utilisation de probiotiques, comme additif alimentaire pour prévenir ce type d’infection entérique et réduire les traitements aux antimicrobiens, suscite un intérêt grandissant en production porcine. Le but du présent travail est de déterminer l’influence de l’administration des probiotiques Pediococcus acidilactici (PA) et Saccharomyces cerevisiae boulardii (SCB) sur la colonisation et l’attachement des ETEC F4, l’accumulation de fluide intestinal et l’expression de cytokines dans l’iléon de porcelets sevrés. Dès la naissance, différentes portées de porcelets ont été affectées aux traitements suivants : PA, SCB, PA + SCB, témoin et témoin avec antibiotiques (ATB). Une dose quotidienne de probiotiques (1 × 109 UFC) a été administrée aux porcelets des groupes probiotiques durant la lactation et après le sevrage. Sept jours après le sevrage, à 28 jours d’âge, des porcelets positifs pour le récepteur intestinal spécifique pour F4 ont été infectés oralement avec une souche ETEC F4. Les porcelets ont été euthanasiés 24 heures après l’infection (jour 29) et différents échantillons intestinaux ont été prélevés. Chez les porcelets recevant des probiotiques, l’attachement des ETEC F4 à la muqueuse iléale était significativement diminué chez les groupes PA ou SCB en comparaison avec le groupe ATB. Finalement, l’expression de cytokines intestinales était plus élevée chez les porcs du groupe PA + SCB en comparaison avec les porcelets témoins. En conclusion, les résultats de cette étude suggèrent que l’administration de probiotiques pourrait être une alternative pour limiter les infections à ETEC F4 chez le porc. / Postweaning diarrhea (PWD) associated with F4-positive enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC F4) causes important economic losses in swine production. Since a couple of years, the use of probiotics as feed additives to prevent such enteric infections and reduce the use of antimicrobial treatments, has gained in interest. The aim of the present study is to evaluate the effects of Pediococcus acidilactici (PA) and Saccharomyces cerevisiae boulardii (SCB), on ETEC F4 colonization and attachment, accumulation of intestinal fluid and cytokines expression in weaned pig’s ileum. At birth, different litters of pigs were allocated to the following treatments: PA, SCB, PA + SCB, control (CTRL) and control with antibiotics (ATB). Probiotics (1 × 109 CFU) were administered daily to probiotics group during the lactation period and after weaning. One week after weaning, at 28 days of age, all F4-receptor-positive pigs were orally challenged with an ETEC F4 strain. Pigs were slaughter 24 hours later (day 29) and different intestinal samples were collected. In pigs treated with PA or SCB, the attachment of ETEC F4 to the ileal mucosa was significantly reduced in comparison with the ATB group. Finally, intestinal cytokines were upregulated in PA + SCB group in comparison with the CTRL group. In conclusion, these results suggest that administration of probiotics could be an alternative to attenuate ETEC F4 infection in pigs.