A sinalização muscarínica exerce função modulatória sobre diferentes aspectos da cognição e emoções. Todos os cinco subtipos de receptores muscarínicos (mAChR), M1 a M5, são expressos no hipocampo de mamíferos e são ativados de forma sobreposta pela maioria dos fármacos, dificultando avanços significativos na compreensão da contribuição de cada componente desse sistema. A toxina muscarínica 3 (MT3) é um antagonista seletivo para o subtipo M4, permitindo a investigação das ações modulatórias deste receptor no aprendizado, memória e plasticidade sináptica. Os M4 são receptores acoplados à proteína G (GPCRs) que atuam via Gi/o desencadeando efeitos inibitórios sobre as células em que estão presentes. Estudos comportamentais anteriores indicam que a administração de MT3 imediatamente após o treino em uma tarefa aversiva produz efeito amnéstico, enquanto que a administração antes da evocação, causa facilitação. Uma explicação para estes resultados é que os circuitos locais envolvidos na consolidação e na evocação da memória diferem em sua natureza. Nesse contexto, sugere-se que o efeito amnéstico da MT3 sobre a consolidação seja consequência da supressão da inibição de interneurônios GABAérgicos; enquanto que na evocação, esse efeito se daria sobre as sinapses glutamatérgicas. Assim, no presente trabalho, com o objetivo de investigar como o receptor M4 modula a plasticidade sináptica de longa duração e interage com uma dessas sinalizações, no caso a GABAérgica, utilizou-se a técnica de eletrofisiologia in vivo de hipocampo de ratos anestesiados. Para tanto, foram realizados registros extracelulares do potencial excitatório pós-sináptico de campo (fEPSP) de CA1 evocados por estimulação contralateral da via Colateral de Schaffer com infusão dos fármacos 15 min antes ou depois da estimulação elétrica de alta ou baixa frequência (HFS: 10 trens 0,5 Hz, 20 pulsos 100 Hz; ou LFS: 600 pulsos 1 Hz, respectivamente). MT3 (4,0 μg/μl), bicuculina (0,06 μg/μl), baclofen (0,2 μg/μl) e veículo, isoladamente ou combinados, não alteraram a amplitude da resposta evocada basal ou a facilitação por pulso pareado (FPP) 15 min após a infusão. MT3 aparentemente atenuou, mas não de forma significativa, a potenciação de longa duração (LTP) em relação ao controle (potenciação 60 min após a HFS de 31,8% e 66,0%, respectivamente). Além disso, não houve diferença significativa entre a amplitude do fEPSP no período basal e 60 min após a HFS sob ação da MT3. Bicuculina, embora não tenha abolido a LTP e nem causado alteração na FPP, produziu uma potenciação de apenas 36,4%. Baclofen promoveu uma potenciação semelhante à dos controles. A administração de baclofen também reduziu significativamente a FPP em relação ao basal. A administração conjunta de MT3 com bicuculina ou baclofen promoveu uma potenciação semelhante ao controle. MT3 não apresentou efeito sobre a manutenção da LTP quando aplicada 15 min após a HFS. Por fim, não foi possível induzir a depressão de longa duração (LTD) com o protocolo de LFS utilizado. Embora não tenha ocorrido diferença estatisticamente significativa entre os grupos devido ao baixo número de animais utilizados, os dados sugerem a possibilidade de uma amplitude reduzida da LTP quando da injeção de bicuculina. Baclofen alterou a FPP em relação ao fEPSP basal, o mesmo não tendo sido observado no grupo controle. Com a administração concomitante de MT3, tais alterações deixam de ser identificadas. Ainda que os achados experimentais sejam inconclusivos e preliminares, este trabalho permitiu a padronização da técnica de eletrofisiologia in vivo em animal anestesiado o que abre portas para futuras investigações. / The cholinergic muscarinic system exerts modulatory function over different aspects of cognition and emotion. All five muscarinic receptors subtypes (mAChR), M1 to M5, are expressed at mammals hippocampus and at least two of them are simultaneously activated by most of the drugs, hindering significant advances on the role of each component of this system. The muscarinic toxin 3 (MT3) is a selective antagonist for the M4 subtype, allowing the investigation of the modulatory actions of this receptor over learning, memory and synaptic plasticity. The M4 are G protein coupled receptors (GPCRs) that act through Gi/o triggering inhibitory effects on which cells they are occur. Previous behavioral studies have shown that administration of MT3 soon after aversive task training exerts amnestic effects over memory, while administration prior to recall, leads to facilitation. A possible explanation to these results could be that the local circuits involved on memory consolidation and recall are different in nature. On this perspective, the amnestic effect of MT3 over memory consolidation should be consequence of GABAergic interneurons inhibition suppression; while the effect on recall, should be over glutamatergic synapses modulation. Thereby, the present work, with the objective to investigate how the M4 receptor modulates long-term synaptic plasticity and interacts with the GABAergic system, in vivo electrophysiological approach of anesthetized rats’ hippocampus was applied. Hence, field excitatory postsynaptic potentials (fEPSP) from CA1 were recorded after stimulation of contralateral Schaffer Collateral pathway with drugs infusion 15 min before or after high or low frequency electric stimulation (HFS: 10 trains 0.5 Hz, 20 pulses 100 Hz; LFS: 600 pulses 1 Hz, respectively). Neither MT3 (4.00 μg/μl), bicuculline (0.06 μg/μl), baclofen (0.20 μg/μl) nor vehicle, isolated or combined, changed the baseline evoked response amplitude 15 min after infusion nor the paired-pulse facilitation ratio (PPF). MT3 apparently attenuated, but not significantly, the long-term potentiation (LTP) compared to control (31.8% and 66.0% potentiation 60 min after HFS, respectively). In addition, there was no significant difference between baseline and 60 min after HFS fEPSP amplitude at MT3 group. Bicuculline, although did not abolish LTP neither changed PPF, it did produce a potentiation of only 36.4%. Baclofen induced a potentiation similar to control group. Baclofen administration also significantly reduced PPF compared to baseline. The simultaneous administration of MT3 and bicuculline or baclofen led to a potentiation similar to the control group. MT3 did not show any effect over LTP maintenance when applied 15 min after HFS. Lastly, it was not possible to induce long-term depression (LTD) with the used LFS protocol. Although there was no statistical significance between groups due to the low animal numbers used, data suggest that bicuculline had reduced LTP amplitude. Baclofen did alter PPF and the same was not observed on control group. When bicuculline or baclofen were injected with MT3, those alterations were not observed. These are inconclusive and preliminary results, notwithstanding this work allowed to set up the in vivo electrophysiology technique in anesthetized animals what will provide new tools for future research.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-12-01T12:26:58Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Mariana Barros.pdf: 1911747 bytes, checksum: f5c0832d347da9436db27522938984b9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-01T12:26:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese Mariana Barros.pdf: 1911747 bytes, checksum: f5c0832d347da9436db27522938984b9 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / CAPES / A nutrição no início da vida e o exercício físico podem alterar a excitabilidade cerebral, interferindo em processos de desenvolvimento e em parâmetros eletrofisiológicos. A depressão alastrante cortical (DAC) é um fenômeno relacionado com a excitabilidade cerebral. Em estudos anteriores, demonstramos potenciação da atividade elétrica cortical espontânea (ECoG) após a DAC. Nesta tese investigou-se a influência das condições de lactação e do exercício de natação, no início da vida e na idade adulta, sobre essa potenciação. Ratos Wistar machos foram amamentados em ninhadas com 6 ou 12 filhotes (grupos L6 e L12). A natação, precoce e tardia, foi realizada entre 8-23 e 60-75 dias de vida, respectivamente. O ECoG foi registrado aos 90-120 dias. Com um algoritmo específico (software Matlab™), determinou-se a amplitude do ECoG. Diferenças intergrupos de peso corporal e encefálico (L12<L6) confirmaram a deficiência nutricional do grupo L12. Diferenças, no mesmo animal, entre as amplitudes do ECoG antes e depois da DAC confirmaram a potenciação pós-DAC. Um grupo que não sofreu DAC não apresentou potenciação do ECoG. A natação precoce reduziu, e a tardia aumentou, essa potenciação do ECoG. A deficiência nutricional (condição L12) atenuou esse efeito. Estes dados sugerem que “condição de lactação”, “exercício de natação” e “idade ao exercício” modulam a potenciação do ECoG. A relevância desses resultados na fisiopatologia de doenças neurológicas dependentes da excitabilidade cerebral, como enxaqueca com aura e epilepsia, merecem futura investigação. / Nutrition in early life and physical exercise can alter brain excitability, interfering with development processes and electrophysiological parameters. Cortical spreading depression (CSD) is a phenomenon related to brain excitability. In previous studies, we demonstrated spontaneous brain electrical activity (ECoG) potentiation after CSD. In this thesis investigated the influence of the lactation conditions and swimming exercise in early life and adulthood, on this potentiation. Male Wistar rats were suckled in litters with 6 or 12 pups (L6 and L12 groups). The swimming, early and late, was carried out between 8-23 and 60-75 days of age, respectively. The ECoG was recorded at 90-120 days. With a specific algorithm (software Matlab ™), we determined the amplitude of the ECoG. Intergroup differences in body- and brain- weight (L12 <L6) confirmed the nutritional deficiency of the L12 group. Differences, in the same animal, between ECoG amplitudes before and after the CSD confirmed the post-CSD potentiation. A group that did not suffer CSD displayed no ECoG potentiation. Early swimming reduced, and later increased, this ECoG potentiation. The nutritional deficiency (L12 condition) attenuated this effect. These data suggest that "lactation condition", "swimming exercise" and "age to exercise" modulate ECoG potentiation. The relevance of these findings in the pathophysiology of brain excitability-dependent neurological diseases, such as migraine with aura and epilepsy, deserve further investigation.