Les lymphocytes T (LT) CD8 jouent un rôle majeur dans la protection de l'hôte contre les parasites intracellulaires. Les LT CD8 reconnaissent des antigènes (ag) présentés par les molécules du CMH I à la surface des cellules présentatrices d'antigènes (CPA). En fonction de l'origine des ag, deux voies d'apprêtement et de présentation sont connues et caractérisées : la voie 'classique' pour les ag endogènes et viraux, et la voie 'croisée' pour les ag exogènes internalisés. Néanmoins, il existe des situations physiologiques de présentation d'ag exogènes par les molécules du CMH I qui ne correspondent à aucune de ces deux voies. C'est le cas lors de l'infection par Toxoplasma gondii (T. gondii). Les mécanismes d'apprêtement dans ce contexte infectieux sont encore mal connus. T. gondii est un parasite intracellulaire obligatoire résidant dans une vacuole qui est un compartiment distinct d'un phagosome. L'infection des cellules se fait par un mécanisme d'entrée actif qui induit la formation et la maturation de la vacuole parasitophore (PV). Les protéines de granules denses (GRA) sont une large famille de protéines du parasite, essentielles à la maturation de la PV. Les protéines GRA sont sécrétées sous forme soluble dans la vacuole, puis certaines sont adressées vers différentes structures membranaires, tel que le réseau membranaire intravacuolaire (IVN : intravacuolar network) et la membrane limitante de la PV (PVM), auxquels elles s'associent de manière périphérique ou transmembranaire. L'une de ces protéines GRA, GRA6, est l'ag source de l'épitope immunodominant HF10. Des travaux ont mis en évidence, dans une lignée de cellules dendritiques (DC), le rôle de la protéine SNARE Sec22b dans la fusion membranaire entre des vésicules du réticulum endoplasmique (RE) et la PV, et dans la présentation de l'ag soluble Ova sécrété par T. gondii. Nous avons étudié le rôle de Sec22b sur la présentation d'ag fortement associés aux membranes (GRA6) dans des DC primaires et des macrophages par le CMH I en utilisant un protocole de déplétion par transduction lentivirale de shRNA. Nos résultats ont confirmé le rôle de Sec22b sur la présentation de l'ag soluble dans les DC, ce qui n'est pas le cas dans les macrophages. Enfin, dans les DC et les macrophages, nous avons montré que Sec22b n'impacte pas la présentation d'ag fortement associés aux membranes tel que GRA6. En parallèle, notre équipe a mis en évidence que GRA6 est insérée dans la PVM, avec le Cter exposé du côté du cytosol de la cellule hôte. Auparavant, notre équipe a publié que la présentation efficace d'épitope dérivé de GRA6 requiert sa localisation au Cter de la protéine. Ces données nous ont incitées à étudier l'impact de la topologie d'ag transmembranaires, sur leur accessibilité à la voie d'apprêtement et de présentation CMH I. Nous avons développé un modèle d'étude pour comparer l'apprêtement et la présentation par le CMH I de l'épitope HF10 en fonction de son exposition : côté cytosol de la cellule hôte, ou, côté lumière de la vacuole. Les mesures de présentation antigénique par des macrophages et des DC primaires infectés ont révélé une diminution de la présentation de HF10 lorsqu'il est exposé du côté lumière de la vacuole. Mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence de nouveaux éléments dans la compréhension de la régulation de l'immunogénicité des ag de T. gondii aux niveaux cellulaire et moléculaire. / CD8 T lymphocytes play a major role for host protective immunity against intracellular parasites. CD8 T cells recognize antigens (Ag) presented by MHC I on the surface of antigen-presenting cells (APCs). Depending on the origin of Ag, two different processing and presentation pathways have been described: the classic one for endogenous and viral Ag, and the cross-presentation pathway for internalized exogenous Ag. Nevertheless, there are physiological conditions of exogenous Ag presentation by MHC I which do not fit any of these two pathways. It is the case for Toxoplasma gondii (T. gondii) infection. The mechanisms of processing in this infectious context are still unclear. T. gondii is an obligate intracellular parasite residing in a vacuole, a distinct compartment of a phagosome. Infection occurs via an active mechanism that induces the formation and maturation of parasitophorous vacuole (PV). Dense granule proteins (GRA) are a large parasite protein family, essential for the maturation of PV. GRA proteins are secreted as soluble proteins in the vacuole, and some are addressed to different membrane structures, such as the membrane intravacuolar network (IVN) and the vacuole limiting membrane (PVM). One of these GRA proteins (GRA6) is the source of an immunodominant epitope (HF10). Previous work highlighted in one dendritic cell line (DC), the role of SNARE Sec22b protein in membrane fusion between vesicles of the endoplasmic reticulum (ER) and the PV, and in the presentation of soluble Ova Ag, secreted by T. gondii. We have studied the role of Sec22b on Ag presentation of membrane-bound Ag (GRA6) in primary DC and macrophages by MHC I, using lentiviral transduction of shRNA. Our results confirmed the role of Sec22b on soluble Ag presentation in DC, which is not the case in macrophages. Finally, in DC and macrophages, we have shown that Sec22b does not impact on Ag presentation of membrane-bound Ags, such as GRA6. Besides this, our team highlighted that GRA6 is inserted in the PVM, with Cter exposed towards the host cell cytosol. Previously, our team published that effective presentation of the epitope derived from GRA6 requires its location at Cter of the protein. The association of these data prompted us to study the impact of Ag transmembrane topology on accessibility to MHC I processing and presentation. We developed a model to compare MHC I presentation of the HF10 epitope based on its exposition: at host cell cytosol, or, at vacuole lumen. Antigen presentation measurements by infected primary macrophages showed a decrease in HF10 presentation when exposed to the vacuole lumen side. My PhD work shed new light on the regulation of immunogenicity of T. gondii Ag at the cellular and molecular levels.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

MHCII molecules expose a weave of antigens, which send survival or activation signals to T lymphocytes. The ongoing process of peptide binding to the MHC class II groove implicates three accessory molecules: the invariant chain, DM and DO. The invariant chain folds and directs the MHCII molecules to the endosomal pathway. Then, DM exchanges the CLIP peptide, which is a remnant of the degraded invariant chain, for peptides of better affinity. Expressed in highly specialized antigen presenting cells, DO competes with MHCII molecules for DM binding and favors the presentation of receptor-internalized antigens. Altogether, these molecules exhibit potential immunomodulatory properties that can be exploited to increase the potency of peptide vaccines. DO requires DM for maturation and to exit the ER. Interestingly, it is possible to monitor this interaction through a conformation change on DOβ that is recognized by the Mags.DO5 monoclonal antibody. Using Mags.DO5, we showed that DM stabilizes the interactions between the DO α1 and β1 chains and that DM influences DO folding in the ER. Thus, the Mags.DO5+ conformation correlates with DO egress from the ER. To further evaluate this conformation change, directed evolution was applied to DO. Of the 41 unique mutants obtained, 25% were localized at the DM-DO binding interface and 12% are at the solvent-exposed β1 domain, which is thought to be the Mags.DO5 epitope. In addition, I used the library to test the ability of HLA-DO to inhibit HLA-DM and sorted for the amount of CLIP. Interestingly, most of the mutants showed a decrease inhibitory effect, supporting the notion that the intrinsic instability of DO is a required for its function. Finally, these results support the model in which DO competes against classical MHCII molecules by sequestering DM chaperone’s function. MHCII molecules are also characterized by their ability to present superantigens, a group of bacterial or viral toxins that coerces MHCII-TCR binding in a less promiscuous fashion than what is observed in a canonical setting. While the mechanism of how bacterial superantigens form trimeric complexes with TCR and MHCII is well understood, the mouse mammary tumor virus superantigens (vSAG) are poorly defined. In the absence of a crystal structure, I chose a functional approach to examine the relation between vSAG, MHCII and TCR with the goal of uncovering the overall trimolecular architecture. I showed that TCR concomitantly binds both the MHCII α chain and the vSAG and that TCR-MHCII docking is almost canonical when coerced by vSAGs. Because many peptides may be tolerated in the MHCII groove, the pressure exerted by vSAG seems to tweak conventional TCR-MHCII interactions. Furthermore, my results demonstrate that vSAG binding to MHCII molecules is conformation-dependent and abrogated by the CLIP amino-terminal residues extending outside the peptide-binding groove. In addition, they also suggest that vSAGs cross-link adjacent MHCIIs and activate T cells via a TGXY motif. / Les molécules du CMH présentent une panoplie d'antigènes qui, lorsque reconnus par un lymphocyte T spécifique, indique à ce dernier de survivre ou de s'activer. Le processus menant à la liaison d'un peptide à la poche du CMH de classe II, implique trois molécules accessoires, soit la chaine invariante, DM et DO. La chaine invariante replie et dirige les molécules du CMHII jusqu'à la voie endosomale. Ensuite, DM échange CLIP, peptide découlant de la dégradation de la chaine invariante, pour d'autres ayant une meilleure affinité. Exprimé seulement chez certaines cellules présentatrices, DO compétitionne avec les molécules du CMHII pour la liaison à DM et ainsi favorise la présentation d'antigènes internalisés par des récepteurs membranaires. Ensemble, ces protéines ont un potentiel immunomodulatoire pouvant être exploité afin d'augmenter l'efficacité de vaccin peptidique. DO requiert DM pour arriver à maturité et sortir du RE. Cette interaction, qui induit un changement de conformation dans la chaine β de DO, peut être sondée à l'aide de l'anticorps monoclonal Mags.DO5. En utilisant cet anticorps, nous avons montré que DM stabilise l'interaction entre les domaines α1 et β1 de DO et influence son repliement dans le RE. Donc, la conformation qui révèle l’épitope Mags.DO5 corrèle avec la migration de DO hors du RE. Afin d'étudier plus précisément ce changement de conformation, DO fut contraint à une ronde d’évolution dirigée. Des 41 mutants obtenus, 25% se retrouvent à l'interface DO- DM et 12% se retrouvent à la surface exposée au solvant du domain β1, région hypothétique de l'épitope Mags.DO5. De plus, la bibliothèque de mutants a été testée pour son habileté à inhiber l'activité de DM. La plupart des mutants montre une activité inhibitrice diminuée, ce qui supporte le model où DO compétionne les molécules du CMHII en séquestrant le rôle chaperon de DM. Les molécules du CMHII ont l'unique habileté de présenter les superantigènes, une famille de toxines virales et bactériennes qui force l'interaction CMHII-TCR de façon beaucoup moins spécifique qu'en contexte canonique. Alors que la façon dont les superantigènes bactériens s'assemblent avec le CMHII et le TCR soit bien comprise, la nature du complexe trimoléculaire découlant des superantigènes du virus de la tumeur mammaire de la souris (vSAG) reste mal définie. En l'absence d'une structure cristalline, une approche fonctionnelle a été choisie pour examiner la relation des vSAGs avec le CMHII et le TCR avec le but de dévoiler l'architecture de ce multi-complexe protéique. Je montre que le TCR lie parallèlement la chaine α du CMHII et vSAG, ce qui résulte en une interaction presque canonique. Puisque différents peptides peuvent être tolérés lors de cet ancrage, il semble que vSAG ajuste les interactions CMHII-TCR conventionnelles. En outre, mes résultats montrent que vSAG reconnait un épitope conformationnel et que cette liaison peut être abrogée par l'extension amino-terminale du peptide CLIP, laquelle s'étend en deçà de la niche. Finalement, mes résultats suggèrent que vSAG peut réticuler plusieurs CMHII adjacents et active les cellules T via son motif TGXY.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les protéines solubles sont généralement faiblement immunogènes, ce qui constitue unelimite pour le développement de vaccins sous unitaires à base de protéines. Mes travaux de thèseont eu pour objectif de décrypter certains mécanismes moléculaires et cellulaires qui contribuent àl’immunogénicité et d’en tirer partie pour développer des approches originales permettantd’améliorer la capacité des protéines à déclencher la réponse immunitaire. Pour cela, j’aiprincipalement utilisé le transactivateur transcriptionnel (Tat) du VIH-1. J’ai montré quel’oligomérisation de Tat permet à un mécanisme de collaboration B-TH-2 d’induire la réponseimmunitaire en absence d’adjuvant. J’ai identifié le déterminant minimal responsable de l’effet etmontré qu’il confère la propriété adjuvante à d’autres antigènes. J’ai ensuite montré que laprésentation aux cellules T restreinte aux CMH I et CMH II est accrue lorsque les protéines sontdotées de la capacité à lier des sucres sulfatés d’expression ubiquitaire: les héparanes sulfate. Cestravaux ont permis de définir de nouvelles approches pour améliorer l’immunogénicité de protéinessusceptibles d’être intégrées dans des préparations vaccinales. / Soluble proteins are usually poorly immunogenic, which is a limit to the development ofsubunit vaccines based on proteins. My thesis work aimed to decipher some molecular and cellularmechanisms that contribute to the immunogenicity and to exploit them to develop innovativeapproaches to improve the ability of proteins to trigger the immune response. For this purpose, Imainly used the transcriptional transactivator (Tat) of HIV-1. I showed that the oligomerization of Tatenables a B-TH-2 collaborative mechanism to induce the immune response in the absence ofadjuvant. I identified the minimum region determining the effect and showed that it confers the selfadjuvantingproperty to other antigens. In the second part of my work, I showed that the MHC I andMHC II restricted presentation to T cells is increased when the proteins are endowed with the abilityto bind ubiquitous sulfated polysaccharides: heparan sulfates. This work helped to define newapproaches to improve the immunogenicity of proteins that are likely to be included in vaccinepreparations.

Les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité de classe I (CMH I) contrôlent la plasticité synaptique dans le système nerveux central (SNC) et plusieurs travaux expérimentaux suggèrent des interactions antigène-dépendantes entre des neurones infectés par des virus et les lymphocytes T CD8. Cependant, le rôle de la présentation des antigènes par le CMH I des neurones sur la physiopathologie de l'infection par Toxoplasma gondii (T. gondii) n'a pas encore été clarifié. Après la dissémination aigue sous forme de tachyzoites, T. gondii se convertit en bradyzoites, forme persistante dans les neurones du SNC. Chez les individus immunocompétents, la toxoplasmose latente est associée à des variations des fonctions cognitives ainsi qu'à des pathologies neuropsychiatriques. Les sujets dont le système immunitaire est dysfonctionnel peuvent développer une encéphalite létale causée par T. gondii, qui est caractérisée par une réplication du parasite, une infiltration massive et des agrégats leucocytaires et l'activation des cellules gliales. Les lymphocytes T (LT) CD8 et le CMH I sont des facteurs-clés contrôlant la résistance à l'encéphalite. Utiliser les LT CD8 pour éliminer les kystes chez des sujets à risque est une piste thérapeutique intéressante en raison de l'absence d'approches pharmacologiques ciblant les bradyzoites. A ce jour, les mécanismes et la pertinence fonctionnelle de la présentation des antigènes dérivés de T. gondii par les neurones restent à déterminer, ainsi que la contribution des différents stades parasitaires au contrôle de l'infection. L'utilisation de nouveaux parasites exprimant un antigène immunodominant uniquement au stade tachyzoite a permis de montrer que la reconnaissance par les LT CD8 d'antigènes issus des tachyzoites est suffisante pour une protection efficace contre l'encéphalite.[...] / In the Central Nervous System (CNS), Major Histocompatibility Complex class I (MHC I) molecules regulate synaptic plasticity and evidence suggests antigen-specific interactions between virus-infected neurons and CD8 T cells. Yet, little is known about the impact of neuronal MHC I presentation on the pathophysiology of infection by the neurotropic Toxoplasma gondii (T. gondii) parasite. Following acute dissemination as tachyzoites, T. gondii converts into bradyzoites that persist inside cysts within neurons of the CNS. In immunocompetent hosts, latent toxoplasmosis is associated with cognitive changes and neuropsychiatric disorders. Hosts with sub-optimal immune responses may develop a lethal T. gondii Encephalitis (TE), characterized by parasite replication, granuloma-like structures with massive immune cell influx and glial cell activation. CD8 T cells and MHC I are key determinants of TE resistance. Harnessing CD8 T cells in at-risk individuals may turn helpful in the future as we are currently lacking an effective pharmacological approach to eradicate bradyzoites. Yet the mechanisms and functional relevance of neuronal MHC I presentation of T. gondii remain unexplored, as well as which stage of the parasite contributes to efficient control of the infection. Using new T. gondii parasites with restricted expression of the immunodominant antigen at the tachyzoite stage, this work showed that CD8 T cell recognition of tachyzoite antigens at early stages of brain invasion is enough to protect from TE. Interestingly, by comparing situations of toxoplasmosis with varying TE severity and by pioneering antigen presentation assays with T. gondii-infected primary neurons, we revealed that TE susceptibility may be underlied by sub-optimal MHC I presentation of tachyzoites antigens by neurons. At last, we describe a mouse model that allows conditional deletion of a MHC I allele that is essential for TE resistance (H-2Ld). [...]

Malgré le statut immunologique particulier du système nerveux central (SNC), l'immunothérapie active représente une approche intéressante dans le traitement des tumeurs cérébrales. Loin d'être immunologiquement muet, le SNC possède même son propre réseau de cellules immunocompétentes spécialisées : les cellules microgliales. D'origine myeloïdes, elles sont capables de jouer le rôle de cellules présentatrices d'antigènes (CPA) après activation et sont idéalement situées pour induire une réponse immunitaire cytotoxique anti-tumorale efficace La manipulation de la microglie pour augmenter les réponses immunes représentent donc une approche thérapeutique particulièrement attractive dans le traitement de ces cancers. Afin de mieux caractériser les cellules microgliales, nous avons développé un modèle de souris rendues aplasique par irradiation, au sein duquel seule la microglie peut jouer le rôle de CPA. Ainsi, nous avons pu observé que dans des conditions adéquates (CpG-ODN, GM-CSF, sCD40L) les cellules microgliales sont douées in vivo d'une activité de présentation antigénique croisée et que celle-ci conduit à l'activation des LT CD8+ spécifique. En parallèle, nous avons évalué un protocole d'immunothérapie active dans un modèle préclinique de tumeur cérébrale basé sur l'implantation stéréotaxique de cellules E.G7-OVA. Ce protocole se base sur l'injection de CpG-ODN, une molécule d'origine microbienne permettant d'activer les cellules du système immunitaire et plus précisément les CPA infiltrant les tumeurs, et sur l'élimination temporaire des lymphocytes T régulateurs, des cellules qui assimilent les antigènes tumoraux à des peptides du soi et conduisent à l'anergie du système immunitaire. Les résultats obtenus montrent que ce traitement induit le rejet de la tumeur pour l'ensemble des souris et que ce rejet est dépendant de la présence des cellules NK (" natural killer ").

No description available.