Toxinas Cry provenientes de Bacillus thuringiensis, também denominadas de δ- endotoxinas, possuem ampla atividade inseticida e são específicas para insetos de diferentes ordens, não sendo nocivas a mamíferos, aves, anfíbios ou répteis. Devido a esta característica, seus genes vêm sendo utilizados no desenvolvimento de plantas transgênicas, visando o controle de insetos-praga de culturas de importância econômica. Dentre estas, destaca-se o algodoeiro que tem como principais pragas o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) e a lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda), ambas causadoras de grandes prejuízos econômicos. Assim, este trabalho objetivou: caracterizar uma estirpe de Bt (S811) tóxica contra S. frugiperda e A. grandis, identificar e clonar os genes codificadores de toxinas Cry potenciais para o controle dessas pragas, expressar os genes em sistema heterólogo Escherichia coli e testar a toxicidade das toxinas contra as pragas em questão. Os resultados obtidos nas análises da estirpe por microscopia eletrônica revelaram a presença de cristais esféricos e bipiramidais, enquanto que a análise de SDS-PAGE detectou proteínas de massa molecular com cerca de 140 kDa e 80 kDa. Posteriormente, uma caracterização gênica, utilizando oligonucleotídeos específicos para genes cry, identificou três genes, cry1Ab, cry1Ia e cry8, sendo estes dois últimos de maior interesse. O gene cry8, que foi isolado pela técnica TAIL-PCR, codifica uma proteína com 58% de identidade de aminoácidos com outras toxinas Cry8, enquanto que o gene cry1Ia12 (isolado com oligonucleotídeos específicos) codifica uma proteína que possui 99% de identidade com as outras proteínas do tipo Cry1Ia descritas na literatura. As porções tóxicas dos genes foram clonadas e expressadas em E. coli produzindo as proteínas recombinantes Cry8 e Cry1Ia12 de aproximadamente 70 kDa (cada uma). As proteínas recombinantes causaram mortalidade de 50% para larvas de A. grandis com 230 μg/ml e 160 μg/ml de Cry1Ia12 e Cry8, respectivamente, enquanto que para larvas de S. frugiperda, apenas Cry1Ia12 foi tóxica causando mortalidade de 50% com 5 μg/ml. Todos estes estudos contribuirão para o desenvolvimento de plantas transgênicas de algodão, bem como para a geração de novas moléculas com maior toxicidade e especificidade utilizando a evolução molecular in vitro (DNA shuffling) destes genes. / Cry toxins or δ-endotoxins, produced by Bacillus thuringiensis, show broad activity against several orders of insects. In addition, they are harmless to mammals, birds, amphibian, and reptiles. Because of these characteristics, several genes have been used in the development of transgenic plants to control pests in important crops. Among them, the cotton crop is very important in Brazil and it has the cotton boll weevil, Anthonomus grandis, and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, as the major pests in this crop, which cause several economic damages. The objective of this work was: to characterize a Bt strain (S811), which is toxic towards S. frugiperda and A. grandis, to identify and clone the coding genes of the Cry toxins with potential to control these pests, to express the genes in Escherichia coli heterologous system, and to test the toxicity of the recombinant proteins towards the reported pests. Electronic microscopic analysis revealed the presence of bipyramidal and spherical crystals and SDS-PAGE analysis showed proteins with 140 kDa and 80 kDa of molecular weight mass. Further gene characterization, using specific primer sets to detect cry genes, identified three genes, cry1Ab, cry1Ia e cry8, although the cry1Ia e cry8 were the genes of major interest. The cry8 gene was isolated through TAIL-PCR techniques and encodes a protein 58% identical to other Cry8 toxins, while the protein deduced from cry1Ia12 gene showed 99% identity with other Cry1Ia toxins previously described. The cry1A12 and cry8 gene toxic fragments were cloned and expressed in E. coli, and the 70 kDa recombinant proteins of were tested against A. grandis and S. frugiperda. Cry1Ia12 toxin caused 50% mortality at 230 μg/ml and 5 μg/ml towards both A. grandis and S. frugiperda, respectively. Cry8 toxin caused 50% mortality only against A. grandis at 160 μg/ml. In addition to the transgenic cotton development program, these results will permit the generation of new molecules with higher toxicity and specificity for these pests through in vitro molecular evolution (DNA shuffling) of these genes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2008. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2009-09-09T20:09:03Z No. of bitstreams: 1 2008_MagnoRodriguesDeCFilho.pdf: 3767597 bytes, checksum: e25e4aa820c240d103c847e47dcd1fb0 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-10-02T14:21:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_MagnoRodriguesDeCFilho.pdf: 3767597 bytes, checksum: e25e4aa820c240d103c847e47dcd1fb0 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-02T14:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_MagnoRodriguesDeCFilho.pdf: 3767597 bytes, checksum: e25e4aa820c240d103c847e47dcd1fb0 (MD5) Previous issue date: 2008 / Um breve levantamento de patógenos foliares em área de produção comercial de mudas de eucalipto em um viveiro comercial de eucalipto no município de Luziânia (GO) revelou a ocorrência de cinco patógenos: C. scoparium, Pleospora sp., Hainesia sp., Pestalotiopsis sp. e Rhizoctonia solani (Capítulo I). Dentre esses patógenos de eucalipto (Eucalyptus sp.), destaca-se a mancha foliar causada pelo Cylindrocladium spp. Morgam (Teleomorfo: Calonectria sp. De Not). Esta enfermidade é especialmente importante em viveiros para a produção de mudas de eucaliptos, especialmente na clonagem de híbridos da espécie. O controle da doença tem sido baseado, principalmente, no tratamento das plantas com a aplicação de fungicidas em todos os estágios da clonagem do eucalipto. No capitulo II, foram testados os meios de cultura líquidas SG (Sacarose-Glicose), BD (Batata-Dextrose) e SDY (Extrato de levedura) para a produção de esporos de C. scoparium. O meio liquido SG possibilitou a produção de conídios dos dois isolados do patógeno que se mostraram infectivos em folhas de eucalipto. Para elaborar um programa de controle biológico contra doenças de plantas, é necessária seleção de antagonistas bem adaptados com alto grau de controle contra os fitopatógenos e, preferencialmente, que promovam o crescimento e enraizamento das miniestacas. Neste trabalho foram selecionados cinco isolados de Trichoderma por meio de testes in vitro e in vivo, foi avaliado o controle biológico de dois isolados de Cylindrocladium scoparium em folhas destacadas, a habilidade dos isolados do antagonista como produtores do hormônio de crescimento ácido Indolacético (AIA) e quanto à capacidade de colonização endofítica, em mudas de clones híbridos (G-100) de eucalipto. Estudou-se a promoção de crescimento e enraizamento de mudas de Eucalyptus urophillla obtidas por sementes e no híbrido G-100 (Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophilla) obtido por clonagem. Também foi estudada a capacidade de esporulação dos isolados de Trichoderma em dois substratos sólidos: grãos de arroz parboilizado de milheto. Os experimentos in vitro consistiram em pareamento de colônias e exposição do patógeno a metabólitos voláteis e não voláteis produzidos por Trichoderma spp. Observaram-se alterações morfológicas em hifas e inibição no crescimento micelial de C. scoparium. Em folhas destacadas de eucalipto, os cinco isolados de Trichoderma conferiram proteção contra a doença, sendo que o isolado CEN 517 de C. scoparium mostrou-se mais agressivo comparado ao CEN 494 de C. scoparium, quando quantificados os níveis de incidência da mancha foliar. Os dados obtidos na esporulação dos antagonistas em arroz parboilizado e milheto revelaram grande variação entre esses isolados. O isolado CEN 262 (T. harzianum) apresentou maior produção de esporos em ambos os substratos, aos 07 e 11 dias de incubação (capítulo III). Nos experimentos para a avaliação da promoção de crescimento,utilizando cinco isolados de Trichoderma selecionados nos ensaios de laboratório, o isolado CEN 262 apresentou um incremento significativo da matéria seca das raízes, da parte aérea e da altura das mudas. In vitro, constatou-se a produção de AIA pelos seguintes isolados: CEN 209, CEN 500 e CEN 262. O isolado CEN 262 apresentou concentração do hormônio 19 vezes maior que o CEN 209. Os isolados CEN 162, CEN 262, CEN 498 demonstraram capacidade de colonizar raízes de eucalipto (capítulo IV). _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / A brief survey of leaf pathogens in a commercial production area of eucalyptus seedlings in a commercial nursery in the municipality of Luziânia (GO) showed the occurrence of five pathogens: C. scoparium, Pleospora sp., Hainesia sp., Pestalotiopsis sp. and Rhizoctonia solani (Chapter I). Among these pathogens of eucalyptus (Eucalyptus spp.), leaf spot caused by Cylindrocladium spp. Morgam (Teleomorph: Calonectria sp. de Not) stands out. This disease is especially important in nurseries that produce eucalyptus seedlings, especially in the cloning of hybrid species. Control of the disease has been based mainly on treating plants with fungicides at all stages of eucalyptus cloning. In Chapter II, liquid culture media SG (Sucrose-Glucose), BD (Potato-Dextrose) and SDY (Yeast extract) were tested to produce spores of C. scoparium. The SG liquid medium enabled the production of conidia of two pathogen isolates, which were showed to be infective in eucalyptus leaves. To draw up a biological control program against plant diseases, it is necessary and appropriate to select well adapted antagonists with a high degree of control against the plant pathogens and, preferably, to promote growth and rooting of the minicuttings. In this study five isolates of Trichoderma were selected through in vitro and in vivo tests. The biological control of two isolates of Cylindrocladium scoparium in detached leaves was evaluated, as well as the ability of the antagonist isolates to produce indoleacetic acid (IAA) growth hormone and for endophytic colonization in seedlings of hybrid clones (G-100) of eucalyptus. The promotion of plant and root growth was studied in Eucalyptus urophillla seedlings obtained from seeds and in the hybrid G-100 (Eucalyptus urophilla x Eucalyptus grandis) obtained by cloning. The capacity of Trichoderma isolates to sporulate in two solid substrates, grains of parboiled rice and millet, was also studied. The in vitro experiments consisted of pairing colonies and exposing the pathogen to volatile and non-volatile metabolites produced by Trichoderma spp. Morphological changes were observed in hyphae and inhibition of micelial growth of C. scoparium. On detached eucalyptus leaves, the five Trichoderma isolates gave protection against the disease, and isolate CEN 517 of C. scoparium proved to be more aggressive than CEN 494 of C. scoparium, when the levels of incidence of leaf spot were quantified.The results obtained for sporulation of antagonists in grains of parboiled rice and millet showed great variation between these isolates. The isolate CEN 262 (T. harzianum) showed higher production of spores in both substrates, at 07 and 11 days of incubation (Chapter III).In experiments to evaluate growth promotion, using five isolates of Trichoderma selected in laboratory tests, isolate CEN 262 (Trichoderma harzianum) showed a significant increase in dry roots, shoots and height of the seedlings. In vitro, the production of IAA was observed in the following isolates: CEN 209, CEN 500 and CEN 262. Isolate CEN 262 presented concentration of the hormone that was 19 times greater than that of CEN 209. CEN 162, CEN 262 and CEN 498 isolates demonstrated capacity to colonize roots of eucalyptus (Chapter IV).

Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram-positiva que produz cristais protéicos durante a fase de esporulação. Os cristais, são formados por proteínas Cry e apresentam atividade tóxica específica a determinadas classes de insetospraga, sendo o seu uso bastante difundido na agricultura. O presente trabalho teve como objetivo gerar uma biblioteca de variantes, do gene cry8Ha1, isolado da estirpe S811 de B. thuringiensis e selecionar variantes com atividade melhorada para pragas do algodoeiro. A biblioteca foi construída por meio da técnica de DNA shuffling e selecionada contra os insetos-praga Anthonomus grandis e Spodoptera frugiperda pela técnica de Phage display. As variantes foram selecionadas pela afinidade aos receptores presentes nas membranas dos intestinos do bicudo-do-algodoeiro (A.grandis) e da lagarta-do-cartucho (S. frugiperda), principais pragas do algodoeiro. Após expressão em fago, proteínas variantes foram testadas em bioensaios contra larvas dos insetos-alvo (A. grandis e S. frugiperda) e seqüenciadas. Os resultados de atividade, mostraram variantes mais efetivas para as duas pragas-alvo, quando comparado com a proteína original Cry8Ha1. O mutante Cry/BI-25 (ativo contra A. grandis) foi selecionado, por diferir estatisticamente do controle, e subclonado no vetor de expressão em bactéria. A proteína foi purificada e utilizada em bioensaio contra larvas de A. grandis. Os resultados indicaram um aumento de atividade entomotóxica de 333% da proteína mutante (Cry/BI-25) quando comparada com a proteína original (Cry8Ha1). A nova molécula, Cry/BI-25, está sendo utilizada em programas de melhoramento de plantas de algodão visando a obtenção de plantas resistentes à praga-alvo. / Bacillus thuringiensis is a gram-positive bacterium that produces protein crystals during its sporulation phase. These crystals are formed by Cry proteins that show specific toxicity to some insect-pest classes, which makes their use very common in agriculture. This work aimed at obtaining a library of cry8Ha1 gene variants, isolated from B. thuringiensis S811 and the selection of gene variants, whose products would have an improved insecticidal activity against cotton insect-pests. The library was constructed using DNA shuffling and selected against the insectpests Anthonomus grandis and Spodoptera frugiperda using Phage display. The variants were selected by affinity to Brush Border Membrane Vesicles (BBMVs) of A. grandis and S. frugiperda midguts. After phage expression, variant proteins were tested in bioassays against the target insects and their genes sequenced. The mutant Cry/BI-25 showed higher insecticidal activity against A. grandis and was subcloned to a bacterium expression vector. The purified expressed protein Cry/BI-25 is 333% more active when compared with protein original (Cry8Ha1). Gene variants selected against S. frugiperda are still under analysis. The new improved protein Cry/BI-25 will be used in cotton plant transformation experiments, with the purpose of developing insect-pest resistant GM cotton plants.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ecologia, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-31T18:07:02Z No. of bitstreams: 1 2016_MichelyFerreiraSantosdeAquino.pdf: 3251444 bytes, checksum: 3d66478dbb9c0ac9088d011d4d883c31 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-04-03T14:56:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MichelyFerreiraSantosdeAquino.pdf: 3251444 bytes, checksum: 3d66478dbb9c0ac9088d011d4d883c31 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-03T14:56:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MichelyFerreiraSantosdeAquino.pdf: 3251444 bytes, checksum: 3d66478dbb9c0ac9088d011d4d883c31 (MD5) / O conhecimento da fauna de parasitoides associada aos percevejos adultos, bem como os mecanismos envolvidos na busca de hospedeiros e o impacto do parasitismo podem contribuir no desenvolvimento de ferramentas para o manejo de percevejos praga da soja. Os objetivos deste trabalho foram conhecer a fauna de parasitoides de percevejos adultos em áreas de produção de soja do Brasil; verificar a influência da composição da paisagem na abundância de percevejos e taxas de parasitismo; estudar o efeito de diferentes métodos de manejo agronômico da soja sobre o parasitismo de percevejos e estudar o impacto do parasitismo por Hexacladia smithii (Hymenoptera: Encyrtidae) na biologia de Euschistus heros (Hemiptera: Pentatomidae). Amostragens sistemáticas (com pano de batida) em áreas de soja revelaram que não houve variação da fauna de percevejos e parasitoides nas principais regiões produtoras do país. A espécie de percevejo dominante foi E. heros. Os índices de parasitismo variaram entre 0,77 a 6,05% por espécies da ordem Diptera e Hymenoptera. O uso de metodologias de sensoriamento remoto revelou que a composição da paisagem influenciou a abundância de percevejos na cultura da soja. Esta variável foi positivamente relacionada à percentagem de cobertura de vegetação nativa, de soja e a interação vegetação nativa x soja x monocultura. O parasitismo não foi influenciado pela composição da paisagem. A distância desde a vegetação nativa influenciou a abundância de percevejos com maiores valores na distância de 200m. Maiores índices de parasitismo (11,2%) foram observados em áreas de soja com aplicação reduzida de inseticida (AI–) que em áreas de soja com frequente aplicação de inseticida [AI+ (4,11%)]. Bioensaios comportamentais em olfatômetro mostraram que fêmeas de H. smithii responderam ao feromônio sexual de E. heros. No estudo de biologia, o parasitismo de H. smithii reduziu a fecundidade de E. heros com consequente redução da taxa de crescimento populacional em 62,22% e 20,27% para Ro e rm, respectivamente, em comparação a fêmeas de E. heros não parasitadas. O efeito negativo do parasitismo também foi observado em simulações da dinâmica populacional de E. heros considerando diferentes condições de parasitismo, migração de percevejos e duração de ciclo da soja. Nessas simulações as populações de E. heros parasitadas tendem a crescer de forma mais lenta quando comparadas a populações não parasitadas. Os resultados obtidos contribuem com novas informações científicas da interação hospedeiro-parasitoide a escalas regional e local e entre indivíduos, considerando os sistemas de cultivo atuais e suas consequências. Estas informações podem subsidiar no futuro o desenvolvimento de programas de manejo integrado que considerem o controle biológico como uma das técnicas principais de controle de percevejos. / Knowledge of parasitoids fauna associated with adult stink bugs as well as the mechanisms involved in the search for hosts and the impact of parasitism can assist in developing tools for stinkbugs pest management. The objectives of this study were to know the parasitoids fauna of adult stink bugs in soybean production areas of Brazil; to check the influence of landscape composition in abundance of stink bugs, and also in the biological control; to study the effect of different management methods on parasitism of stink bug; to study the effect of Hexacladia smithii (Hymenoptera: Encyrtidae) in Euschistus heros biology (Hemiptera: Pentatomidae). Systematic samplings (with beat cloth) in soybean production areas revealed that there was no faunal variation of stink bugs and parasitoids along the main production areas in the country. Euschistus heros was the dominant stink bug. The parasitism ranging from 0.77 to 6.05% for Diptera and Hymenoptera species.The use of remote sensing methods with the aid of ArcGis program revealed that landscape composition influenced the abundance of stink bugs in soybeans. This variable was positively related to percentage of cover of native vegetation, soybean and interaction native vegetation x soybean x monoculture. The parasitism was not influenced by the composition of the landscape. The abundance of stink bugs was influenced by the distance from the native vegetation with higher values at distances of 200m Higher rates of parasitism (11.2%) were observed in soybean areas with reduced application of insecticide (AI–) than in areas of soybean with frequent application of insecticide [AI+ (4,11%)]. Behavioral olfactometer bioassays showed that H. smithii females were attracted to sexual pheromone of E. heros. In biology study, the parasitism of H. smithii reduced the fecundity of E. heros with consequent reduction in population growth rate in 62,22% e 20,27% for Ro e rm, respectively compared to E. heros females not parasitized. The negative effect of parasitism was also observed in simulations of population dynamics of E. heros considering different conditions of parasitism, migration of stink bugs and soybean cycle duration. In these simulations the populations of E. heros parasitized tend to grow more slowly compared with non-parasitized populations. The results contribute to new scientific information from the hostparasitoid interaction at regional and local scales and individual interactions, considering the current cropping systems and their consequences. This information may be important, in the future, for the development of integrated pest management programs that consider the biological control as one of the main technicals control of stink bugs.

Toxinas Cry provenientes de Bacillus thuringiensis, também denominadas de δ- endotoxinas, possuem ampla atividade inseticida e são específicas para insetos de diferentes ordens, não sendo nocivas a mamíferos, aves, anfíbios ou répteis. Devido a esta característica, seus genes vêm sendo utilizados no desenvolvimento de plantas transgênicas, visando o controle de insetos-praga de culturas de importância econômica. Dentre estas, destaca-se o algodoeiro que tem como principais pragas o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) e a lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda), ambas causadoras de grandes prejuízos econômicos. Assim, este trabalho objetivou: caracterizar uma estirpe de Bt (S811) tóxica contra S. frugiperda e A. grandis, identificar e clonar os genes codificadores de toxinas Cry potenciais para o controle dessas pragas, expressar os genes em sistema heterólogo Escherichia coli e testar a toxicidade das toxinas contra as pragas em questão. Os resultados obtidos nas análises da estirpe por microscopia eletrônica revelaram a presença de cristais esféricos e bipiramidais, enquanto que a análise de SDS-PAGE detectou proteínas de massa molecular com cerca de 140 kDa e 80 kDa. Posteriormente, uma caracterização gênica, utilizando oligonucleotídeos específicos para genes cry, identificou três genes, cry1Ab, cry1Ia e cry8, sendo estes dois últimos de maior interesse. O gene cry8, que foi isolado pela técnica TAIL-PCR, codifica uma proteína com 58% de identidade de aminoácidos com outras toxinas Cry8, enquanto que o gene cry1Ia12 (isolado com oligonucleotídeos específicos) codifica uma proteína que possui 99% de identidade com as outras proteínas do tipo Cry1Ia descritas na literatura. As porções tóxicas dos genes foram clonadas e expressadas em E. coli produzindo as proteínas recombinantes Cry8 e Cry1Ia12 de aproximadamente 70 kDa (cada uma). As proteínas recombinantes causaram mortalidade de 50% para larvas de A. grandis com 230 μg/ml e 160 μg/ml de Cry1Ia12 e Cry8, respectivamente, enquanto que para larvas de S. frugiperda, apenas Cry1Ia12 foi tóxica causando mortalidade de 50% com 5 μg/ml. Todos estes estudos contribuirão para o desenvolvimento de plantas transgênicas de algodão, bem como para a geração de novas moléculas com maior toxicidade e especificidade utilizando a evolução molecular in vitro (DNA shuffling) destes genes. / Cry toxins or δ-endotoxins, produced by Bacillus thuringiensis, show broad activity against several orders of insects. In addition, they are harmless to mammals, birds, amphibian, and reptiles. Because of these characteristics, several genes have been used in the development of transgenic plants to control pests in important crops. Among them, the cotton crop is very important in Brazil and it has the cotton boll weevil, Anthonomus grandis, and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda, as the major pests in this crop, which cause several economic damages. The objective of this work was: to characterize a Bt strain (S811), which is toxic towards S. frugiperda and A. grandis, to identify and clone the coding genes of the Cry toxins with potential to control these pests, to express the genes in Escherichia coli heterologous system, and to test the toxicity of the recombinant proteins towards the reported pests. Electronic microscopic analysis revealed the presence of bipyramidal and spherical crystals and SDS-PAGE analysis showed proteins with 140 kDa and 80 kDa of molecular weight mass. Further gene characterization, using specific primer sets to detect cry genes, identified three genes, cry1Ab, cry1Ia e cry8, although the cry1Ia e cry8 were the genes of major interest. The cry8 gene was isolated through TAIL-PCR techniques and encodes a protein 58% identical to other Cry8 toxins, while the protein deduced from cry1Ia12 gene showed 99% identity with other Cry1Ia toxins previously described. The cry1A12 and cry8 gene toxic fragments were cloned and expressed in E. coli, and the 70 kDa recombinant proteins of were tested against A. grandis and S. frugiperda. Cry1Ia12 toxin caused 50% mortality at 230 μg/ml and 5 μg/ml towards both A. grandis and S. frugiperda, respectively. Cry8 toxin caused 50% mortality only against A. grandis at 160 μg/ml. In addition to the transgenic cotton development program, these results will permit the generation of new molecules with higher toxicity and specificity for these pests through in vitro molecular evolution (DNA shuffling) of these genes.

Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram-positiva que produz cristais protéicos durante a fase de esporulação. Os cristais, são formados por proteínas Cry e apresentam atividade tóxica específica a determinadas classes de insetospraga, sendo o seu uso bastante difundido na agricultura. O presente trabalho teve como objetivo gerar uma biblioteca de variantes, do gene cry8Ha1, isolado da estirpe S811 de B. thuringiensis e selecionar variantes com atividade melhorada para pragas do algodoeiro. A biblioteca foi construída por meio da técnica de DNA shuffling e selecionada contra os insetos-praga Anthonomus grandis e Spodoptera frugiperda pela técnica de Phage display. As variantes foram selecionadas pela afinidade aos receptores presentes nas membranas dos intestinos do bicudo-do-algodoeiro (A.grandis) e da lagarta-do-cartucho (S. frugiperda), principais pragas do algodoeiro. Após expressão em fago, proteínas variantes foram testadas em bioensaios contra larvas dos insetos-alvo (A. grandis e S. frugiperda) e seqüenciadas. Os resultados de atividade, mostraram variantes mais efetivas para as duas pragas-alvo, quando comparado com a proteína original Cry8Ha1. O mutante Cry/BI-25 (ativo contra A. grandis) foi selecionado, por diferir estatisticamente do controle, e subclonado no vetor de expressão em bactéria. A proteína foi purificada e utilizada em bioensaio contra larvas de A. grandis. Os resultados indicaram um aumento de atividade entomotóxica de 333% da proteína mutante (Cry/BI-25) quando comparada com a proteína original (Cry8Ha1). A nova molécula, Cry/BI-25, está sendo utilizada em programas de melhoramento de plantas de algodão visando a obtenção de plantas resistentes à praga-alvo. / Bacillus thuringiensis is a gram-positive bacterium that produces protein crystals during its sporulation phase. These crystals are formed by Cry proteins that show specific toxicity to some insect-pest classes, which makes their use very common in agriculture. This work aimed at obtaining a library of cry8Ha1 gene variants, isolated from B. thuringiensis S811 and the selection of gene variants, whose products would have an improved insecticidal activity against cotton insect-pests. The library was constructed using DNA shuffling and selected against the insectpests Anthonomus grandis and Spodoptera frugiperda using Phage display. The variants were selected by affinity to Brush Border Membrane Vesicles (BBMVs) of A. grandis and S. frugiperda midguts. After phage expression, variant proteins were tested in bioassays against the target insects and their genes sequenced. The mutant Cry/BI-25 showed higher insecticidal activity against A. grandis and was subcloned to a bacterium expression vector. The purified expressed protein Cry/BI-25 is 333% more active when compared with protein original (Cry8Ha1). Gene variants selected against S. frugiperda are still under analysis. The new improved protein Cry/BI-25 will be used in cotton plant transformation experiments, with the purpose of developing insect-pest resistant GM cotton plants.

Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Lucia Maria Carareto Alves / Banca: Vitor Fernandes Oliveira da Miranda / Banca: Cristina Lacerda Soares Petrarolha Silva / Banca: Renato Pariz Maluta / Resumo: Aminopeptidases N (APNs) são uma classe de ectoenzimas presentes no intestino médio das larvas de lepidópteros, que participa no cenário do modo de ação das toxinas Bacillus thuringiensis (Bt). No presente trabalho, duas aminopeptidases (OnAPN5 e OnAPN6) foram clonadas a partir células do intestino de Ostrinia nubilalis, lepidópteros praga do milho dos climas temperados. As duas sequências foram identificadas como APNs pela da presença dos motivos HEXXH18(X)E e GAMEM, bem como o peptídeo sinal. As mesmas se agruparam corretamente quando analisadas com outras sequências de aminopeptidase em uma arvore fenogenética, Pode-se verificar a expressão em tempo real em diferentes tecidos (intestinal, adiposo e tegumento) da APN5 e APN6 e também de uma terceira aminopeptidase APN7 analisada nesta etapa do trabalho, onde APN7 apresentou expressão de 7,5 vezes mais no tegumento quando comparado com o intestino e de 4,9 vezes mais no tecido adiposo quando comparado com o intestino enquanto que a APN5 e APN6 apresentaram expressão relevante apenas no tecido do intestino. Estas identificações de APNs irão facilitar estudos para caracterizar interações de ligação com as toxinas Bt, proporcionando uma forma de compreender e evitar o desenvolvimento da resistência às proteínas Cry de B. thuringiensis. Estas informações são fundamentais para a elaboração de estratégias adequadas para o manejo da resistência de pragas e seu efetivo controle / Abstract: Aminopeptidases N (APNs) are a class of ectoenzymes present in the midgut of lepidopteran larvae, which participates in setting the mode of action of Bacillus thuringiensis toxin (Bt). In this work, two aminopeptidases (OnAPN5 and OnAPN6) were cloned from cells of the intestine Ostrinia nubilalis, Lepidoptera pests of temperate maize. The two sequences were identified as APNs for the presence of motifs HEXXH18 (X) and E GAMEM as well as the signal peptide. The same when analyzed correctly grouped with other aminopeptidase sequences in a tree fenogenética, can check in real time the expression in different tissues (gut, adipose tissue and carcass) from APN5 and APN6 and also a third aminopeptidase analyzed in this step APN7 work, where APN7 showed expression of 7.5 times the carcass when compared with the intestine and 4.9 times in adipose tissue when compared with the intestine while APN5 and APN6 relevant only showed expression in tissue of the intestine. These IDs APNs will facilitate studies to characterize binding interactions with Bt toxins, providing a way to understand and prevent the development of resistance to Cry proteins of B. thuringiensis. This information is fundamental to the development of appropriate strategies for managing pest resistance and its effective control / Doutor

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-10-22T13:48:39Z No. of bitstreams: 1 2012_LilianBotelhoPraça.pdf: 2439199 bytes, checksum: e72b1662fae9c4bccfa49841b222fa61 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-11-06T10:54:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_LilianBotelhoPraça.pdf: 2439199 bytes, checksum: e72b1662fae9c4bccfa49841b222fa61 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-06T10:54:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_LilianBotelhoPraça.pdf: 2439199 bytes, checksum: e72b1662fae9c4bccfa49841b222fa61 (MD5) / Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae) é uma praga de grande importância econômica, devido aos danos provocados em cultivos de brássicas em todo o mundo. O controle desta praga é dificultado pela seleção de populações de insetos resistentes a vários inseticidas e pelo seu hábito críptico entre as folhas na cabeça do repolho. A colonização das plantas de forma endofítica por microrganismos apresenta-se como uma forma inovadora de controle sistêmico de pragas como P. xylostella. Este tipo de controle depende da seleção de estirpes de Bacillus thuringiensis (Bt) com elevada eficiência contra o inseto-alvo associado à capacidade de penetração e colonização deste na planta. Neste trabalho foram selecionadas as estirpes S1905, S2122 e S2124 altamente tóxicas a P. xylostella. As estirpes S1905 e S2124 apresentaram perfil protéico de 130 e 65 kDa e a estirpe S2122 apenas a proteína de 130 kDa, fragmentos de DNA de tamanho esperado para a detecção de genes cry1 e cry2 e cristais bipiramidais, cubóides e redondos. A habilidade destas estirpes de Bt em colonizar endofiticamente diferentes híbridos de repolho foi observada através da detecção de células vegetativas, esporos e cristais nas diferentes partes das plantas de repolho. A predominância de colonização de Bt foi verificada nas raízes. As estirpes foram avaliadas quanto à promoção de crescimento em plantas de repolho. No tratamento das sementes por 15 minutos, o sedimento da estirpe S1905 com 48 horas de crescimento apresentou um incremento de 200% no tamanho inicial das plântulas, quando comparada com a testemunha. Este trabalho demonstrou pela primeira vez a habilidade de estirpes brasileiras de Bt em colonizar e promover o crescimento de plantas de repolho, além de protegê-las contra P. xylostella . _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae) is a pest of great economic importance due to damage to brassica crops worldwide. The control of this pest is hindered by the selection of resistant populations to various insecticides and by its cryptic habit between the leaves of the cabbage head. The colonization of plants by endophytic microorganisms is an innovative way to control pests such as P. xylostella. The use of Bacillus thuringiensis (Bt) for endophytical control of the pest depends on the selection of strains with high efficiency against target insects associated with the ability to colonize and penetrate cabbage plants. This work aimed to select and characterize three Brazilian strains of B. thuringiensis toxic to P. xylostella. The S1905, S2122 and S2124 strains were highly toxic to P. xylostella. S1905 and S2124 showed two major proteins of 130 and 65 kDa, and S2122 showed only the protein of 130 kDa. The strains presented DNA fragments of the expected size for the detection of various specific cry1 and cry2 genes and bipyramidal, cuboidal and round crystals. The endophytic ability of . The colonization of plants by endophytic microngiensis to colonize plants was verified by the presence of vegetative cells, spores and crystals of the three B. thuringiensis strains in different parts of cabbage plants. The colonization of Bt occurs predominantly on roots. The strains were also evaluated in terms of promotion growth in cabbage plants. In seeds treatment for 15 minutes, the sediment of S1905 grown for 48 hours showed a growth promoting 200 times greater than the control. This study demonstrated for the first time the ability of Brazilian strains to colonize and promote the growth of cabbage plants and protect them against P. xylostella.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-04-26T15:32:22Z No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaMagaliFreitasARezende.pdf: 928655 bytes, checksum: 0debcd6b5dcfb890f32d2dadf1072dca (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-04-29T00:16:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaMagaliFreitasARezende.pdf: 928655 bytes, checksum: 0debcd6b5dcfb890f32d2dadf1072dca (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-29T00:16:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaMagaliFreitasARezende.pdf: 928655 bytes, checksum: 0debcd6b5dcfb890f32d2dadf1072dca (MD5) / O tomateiro comum (Solanum lycopersicum L.) é uma olerícola de grande importância econômica e social, se destacando no Brasil, pelas extensas áreas agrícolas cultivadas. O Brasil é o sexto maior produtor de tomate no mundo. No entanto, a murcha bacteriana, causada pela bactéria Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi está entre as doenças de maior importância e de difícil controle, não existindo ainda medidas adequadas que possam ser recomendadas. Com objetivo de determinar um controle biológico eficaz, comparado às outras bactérias antagonistas e com comportamentos semelhantes contra muitos fitopatógenos, foi escolhido o estudo com bactérias extremófilas facultativas para verificar seu efeito na promoção do crescimento das plantas de tomate e ao mesmo tempo estudar a supressão da murcha bacteriana. Foram coletadas diferentes amostras de solos, no município de Brazlândia, em Brasília, DF, Brasil. Obteve-se um total de trinta e oito isolados os quais foram submetidos aos testes de temperaturas (45, 55, 65 e 75 ºC), pH (3, 4, 5, 9, 10 e 11) e salinidade (5, 10 e 15 % de NaCl). Onze isolados foram selecionados para caracterização bioquímica e identificação baseada nas sequências 16S DNAr. Verificou-se que em todas as amostras de solos determinaram-se quatro grupos de bactérias, sendo que em cada um observou a presença de isolados crescendo nas condições mais extremas. Dos onze isolados selecionados, todas as bactérias foram Gram negativa, podendo separá-los em três grupos distintos, com base nas reações positivas para as características bioquímicas: o primeiro grupo formado, com base no teste oxidação/fermentação da glicose, obteve-se sete isolados pertencendo à família Enterobacteriaceae; o segundo grupo com base no crescimento em meio King-B, obteve-se dois isolados de Pseudomonas sp.; e o terceiro grupo não relacionados taxonomicamente, com dois isolados, Giesbergeria sp. e Chryseobacterium sp. Estes onze isolados selecionados e identificados foram avaliados, em casa de vegetação, no estudo da promoção do crescimento das plantas de tomate. Foram montados três experimentos: (1) com aplicação individual, (2) com combinação de dois e (3) com combinação de três e com todos isolados simultaneamente, com dois sistemas orgânicos, composto (CO) e bokashi (BK). A aplicação individual dos isolados mostrou ser mais eficiente na promoção do crescimento das plantas, o isolado UnB 1327, no sistema CO apresentou maiores incrementos para altura, peso matéria fresca e seca de 233,9%, 55,9% e 24,2%, respectivamente maiores que a testemunha (100%). No estudo da supressão de R. solanacearum, no experimento 1, os isolados UnB 1321 no sistema BK e UnB 1326 e UnB 1322 no sistema CO, mostraram ser eficientes na supressão da bacteriose, destacando-se com 100% de controle. O experimento 2, mostrou ser mais eficiente na supressão da murcha bacteriana, independendo do tipo de sistemas avaliados. No experimento 3, no sistema BK, a testemunha diferenciou significativamente de todos os tratamentos, inclusive da combinação UnB 1329 + UnB 1322 + UnB 1330 apresentando 87% e 27%, respectivamente, de plantas mortas. No sistema CO, houve alta percentagem da doença em todos os tratamentos, no entanto nenhum tratamento diferenciou da testemuha que apresentou 60% de plantas mortas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The common tomato (Solanum lycopersicum L.) is a crop of great economic importance and social, standing out in Brazil due to largest agricultural areas cultivated. Brazil is the sixth largest tomato producer in the world. However, bacterial wilt caused by the bacterium Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi is one of the most important and difficult to control disease, with no further appropriate measures as may be recommended. This work aimed to establish an effective biological control, compared to other antagonists bacteria and with similar behavior for many plant pathogens, was chosen the study with facultative extremophiles bacteria for its effect on promoting growth of tomato plants and the suppression of bacterial wilt. To this end, several soil samples were collected in the municipality of Brazlândia, near Brasília, Federal District, Brazil. A total of 38 isolates were submitted to temperature tests (45, 55, 65 and 75 ºC), pH tests (3, 4, 5, 9, 10 and 11) and salinity tests (5, 10 and 15 % of NaCl). Eleven isolates were selected for biochemical characterization and identification based on the 16S DNAr sequences. It was confirmed that in all the soil samples four groups of bacteria were categorized, and in each one the presence of isolates growing in highly extreme conditions was observed. Of the 11 selected isolates, all the bacteria were Gram-negative, and these could be separated into three distinct groups, based on their positive reactions to biochemical characteristics. From the first group, based on the glucose oxidation/fermentation test, we obtained seven isolates belonging to the family Enterobacteriaceae; from the second group, based on growth in King-B medium, we obtained two isolates of Pseudomonas sp.; the third, taxonomically unrelated group, showed two isolates, Giesbergeria sp. and Chryseobacterium sp. These eleven isolates identified were selected and evaluated in a greenhouse in the study of growth promotion of tomato plants. Three experiments were carried out: (1) with individual application, (2) with a combination of two and (3) with a combination of three and all isolates simultaneously, with both systems, compound (OC) and bokashi (BK). Applying individual isolate was more efficient in promoting plant growth, the isolate UnB 1327, on conventional treatment showed more increase for height, fresh and dry weight of 233,9%, 55,9% and 24,2% respectively higher than the control 2 (100%). In the study of suppression of R. solanacearum, in experiment 1, isolates UnB 1321 in the BK system and UnB 1326 and UnB 1322 in the CO system were seen to be efficient in the suppression of bacteriosis, at 100% difference from the control. Experiment 2 was efficient in suppressing bacterial wilt, independently of the type of system being evaluated. In experiment 3, in the BK system, the control was significantly different from all the treatments, including from the UnB 1329 + UnB 1322 + UnB 1330 combination, presenting 87% and 27% dead plants, respectively. In the CO system, there was a high percentage of the disease in all treatments, but no treatment differed from the control, which presented 60% dead plants.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ecologia, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-05-27T16:07:18Z No. of bitstreams: 1 2010_CeciliaRodriguesVieira.pdf: 3218541 bytes, checksum: bb23d57ec7ea110a4f14801748b2b385 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-06-10T18:02:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_CeciliaRodriguesVieira.pdf: 3218541 bytes, checksum: bb23d57ec7ea110a4f14801748b2b385 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-10T18:02:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_CeciliaRodriguesVieira.pdf: 3218541 bytes, checksum: bb23d57ec7ea110a4f14801748b2b385 (MD5) / A manipulação da abundância e distribuição de inimigos naturais por semioquímicos tem potencial para melhorar as estratégias de controle biológico. Entretanto, estudos em ambientes complexos (campo), voltados para estabelecer a ação cairomonal de semioquímicos e sua influência na distribuição e abundância de parasitóides ainda são escassos. Esses conhecimentos são fundamentais para estabelecer bases científicas sólidas que permitam a aplicação dos semioquímicos no manejo integrado de pragas. Nesse trabalho foram avaliadas duas estratégias de uso de semioquímicos para manejo comportamental de parasitóides de ovos de percevejos, visando estabelecer o efeito da sua aplicação na abundância e distribuição dos parasitóides e o impacto nas populações de percevejos através do parasitismo de ovos. Uma das estratégias testadas foi o uso de (E)-2-hexenal, componente do feromônio de alarme de percevejos, que também é um constituinte dos voláteis verdes de plantas. Esse composto tem ação cairomonal em parasitóides de ovos comprovada previamente em laboratório. A liberação por septos de borracha com diferentes doses (4 mg, 10 mg e 5 mg) de (E)-2-hexenal em áreas de cultivo de soja, mostrou que a abundância de parasitóides foi maior em parcelas com aplicação do composto na concentração de 4 mg e esse efeito ocorreu principalmente nos estágios de enchimento dos grãos de soja até a maturidade fisiológica da planta. No entanto, em parcelas tratadas com (E)-2-hexenal a intensidade e a ocorrência de parasitismo em ovos e o nível populacional de percevejos fitófagos não diferiu de parcelas controle. Uma segunda estratégia testada foi a utilização de cis-jasmone, um fitormônio que atua como indutor de voláteis componentes da defesa indireta da soja. Experimentos em campo foram realizados pulverizando 6 ml de solução de cis-jasmone (250 mg cis-jasmone + 100 mg de tween 20, em 1 l de água) sobre plantas de soja no início do estágio reprodutivo. A estrutura da comunidade (riqueza e equidade) foi similar, em geral, entre parcelas tratamento e controle. Entretanto, o número total de Scelionidae, parasitóides de ovos de percevejos, principalmente Telenomus podisi e Trissolcus basalis foi significativamente maior em parcelas tratadas durante as três semanas posteriores a aplicação do composto. Essa atração não gerou resposta de aumento na ocorrência e intensidade de parasitismo em ovos e o nível populacional de percevejos-praga não foi diferente entre parcelas tratamento e controle. O controle de percevejos em culturas de soja pode ser incrementado pelo adensamento de parasitóides Scelionidae em áreas tratadas, aumentando assim a probabilidade de localização de ovos do hospedeiro. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The manipulation of the abundance and distribution of natural enemies by semiochemicals can improve strategies for biological control. However, studies in complex environments (field), aimed to establish the kairomonal action of semiochemicals and their influence on the distribution and abundance of parasitoids are scarce. Such knowledge is fundamental to establish a solid scientific basis for applying the semiochemicals in integrated pest management. In this study we evaluated two strategies for use of semiochemicals for management of behavioral egg parasitoids of stink bugs, to establish the effect of its application in the abundance and distribution of parasitoids and the impact on populations of stink bugs through the egg parasitism. One strategy was tested using (E)-2-hexenal, an alarm pheromone component of stink bugs, which is also a green leaf volatile produced by plants. This compound showed a kairomonal effect on egg parasitoids in laboratory. The release by rubber septa of different doses (4 mg, 10 mg and 5 mg) of (E)-2-hexenal in soybean crops indicated that the abundance of parasitoids was higher in plots treated with a concentration of 4 mg of (E)-2-hexenal and this effect occurred mainly in the grain filling stages of soybeans to physiological maturity of plants. However, in plots treated with (E)-2-hexenal intensity and occurrence of egg parasitism and population level of phytophagous bugs did not differ from control. We also investigated the use of cis-jasmone, a plant phytormone that induces indirect defenses in soybean. Field experiments were performed by spraying 6 ml of cisjasmone (250 mg cis-jasmone + 100 mg of tween 20 in 1 l of water) on soybean plants, during the early reproductive stage. The community structure (richness and equity) was similar, in general, between treatment and control plots. However, the total number of Scelionidae, stink bug’s egg parasitoids, mainly Telenomus podisi and Trissolcus basalis, was significantly higher in treated plots during the three weeks after the application of the compound. This attraction did not increase the occurrence and intensity of egg parasitism and the abundance of stink bugs did not differ between treatment and control plots. The stink bug control in soybean can be increased by the high density of parasitoid Scelionidae in treated areas, thereby increasing the probability of location of host eggs.