Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / Associação Fundo de Incentivo à Psicofarmacologia (AFIP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Estudos mostram que a populacao vem diminuindo o seu tempo de sono e que essa reducao, acompanhada por um maior consumo alimentar, pode aumentar o risco para o desenvolvimento de obesidade, diabetes mellitus do tipo II e doencas cardiovasculares. Ratos submetidos a privacao de sono paradoxal (PSP) tambem apresentam um aumento no consumo alimentar, porem com reducao do peso corporal. No entanto, esse aumento do consumo ocorre durante a fase clara, sugerindo que a PSP possa alterar o ritmo circadiano dos animais. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo avaliar o curso temporal das alteracoes metabolicas referentes ao consumo alimentar (nas fases clara e escura do ritmo circadiano), variacao de peso corporal e concentracoes sanguineas de glicose, insulina e leptina, durante quatro dias de PSP pelo metodo da plataforma unica; e investigar os efeitos das fases do ritmo circadiano (clara/escura), por meio da privacao alimentar, sobre os mesmos parametros metabolicos, durante a PSP. Para a privacao alimentar, a racao foi retirada, diariamente, das 07:00 h as 19:00 h (privacao alimentar na fase clara) ou das 19:00 h as 07:00 h (privacao alimentar na fase escura), sendo recolocada nas 12 h seguintes. Em relacao ao consumo alimentar, confirmou-se um aumento, apenas na fase clara, dos animais submetidos a PSP quando comparados com o grupo controle. A associacao da PSP com a privacao alimentar na fase clara aumentou o consumo alimentar na fase escura, porem, nao alterou o consumo total em comparacao aos animais apenas privados de sono. Entretanto, o consumo desses animais tambem nao e diferente daqueles apenas privados de alimento na fase clara, mostrando um papel relevante desta fase durante a PSP. Quando a privacao de alimento foi realizada na fase escura, observou-se um aumento do consumo alimentar na fase clara, independente da privacao de sono, uma vez que os animais deixaram de ter acesso a comida em seu periodo habitual. Apesar desse aumento, os animais PSP e privados de alimento na fase escura (PPE) nao conseguiram atingir valores semelhantes de consumo total em comparacao com animais apenas privados de sono, sugerindo uma incapacidade de habituacao decorrente da PSP. A PSP promoveu perda de peso corporal em todos os grupos, principalmente no primeiro dia; no entanto, essa perda foi maior no grupo PPE, possivelmente devido a sua defiCiência no consumo alimentar. Em relacao ao curso temporal das concentracoes plasmaticas de glicose, insulina e leptina, nao foram encontradas diferencas na glicemia, por outro lado, verificou uma relacao inversa entre o tempo de PSP e as concentracoes de insulina e leptina. Por fim, a associacao da PSP com a privacao alimentar provocou reducao das concentracoes plasmaticas de glicose, insulina e leptina, e novamente o grupo PPE apresentou valores inferiores, reforcando a ideia de que a privacao alimentar na fase escura possa potencializar os efeitos causados pela PSP. Nossos resultados sugerem que durante a PSP o consumo na fase clara seja significante para os animais e que as consequencias metabolicas da privacao de sono sao exacerbadas durante a privacao de alimento na fase escura / BV UNIFESP: Teses e dissertações

INTRODUÇÃO:A neuraminidase 1 (chamada a seguir por Neu1) regula o catabolismo de sialoglicoconjugados nos lisossomos. A deficiência congênita da Neu1 é a base da sialidose, doença neurossomática grave associada a deformidades osteoesqueléticas, hipotonia e fraqueza muscular. Camundongos com deficiência de Neu1 desenvolvem uma forma atípica de degeneração muscular caracterizada porproliferação anormal de fibroblastoslevando a invasão nas fibras musculares, expansão da matriz extracelular (MEC), fragmentação do citoplasma, formação vacuolar e atrofia muscular. A ocorrência de atrofia muscular indica que a deficiência da Neu1 podeestar relacionada com o controle da massa muscular, a qual é dependente do equilíbrio entre síntese e degradação proteica.Uma característica principalnaMacroautofagia (denominada a seguir por autofagia) é a principal via de degradação intracelular sendo expressamente essencial para a homeostase celular e remoção de materiais citoplasmáticos. Objetivos: Avaliarseos efeitos da deficiência da Neuraminidase 1 afetama indução de autofagia e a formação de autofagossomos e determinar os efeitos do bloqueio da função lisossomal sobre o fenótipo muscular na deficiência da Neuraminidase1.Metodologia:Camundongos Neu1+/-foram cruzados e os filhotes genotipados, onde camundongos Neu1-/-(nocaute) e Neu1+/+(normal),foram utilizados no estudon total=90, sendo 10 em padronizações, 20 para coleta de fibroblastos e 60 para procedimentos in vivo, os grupos experimentais foram divididos em privação alimentar por 2 dias que, por meio da inibição do mTOR, induz a autofagia;grupo detratamento com Colchicina por 4 dias onde irá impedir a junção autofagossomo/lisossomonão havendo a degradaçãolisossomaleadicionado nos dois últimos dias de privação alimentar e o grupo de tratamento comRapamicina por 7 dias, droga com função de inibir seletivamente o mTOR.Após os tratamentos, os animais foram eutanasiadospara coleta dos músculos gastrocnêmios e tibiais anterior. Os músculos foram analisados apósas coloraçõeshistológicas porHematoxilina & Eosina e Fosfatase Ácida; Imunofluorescência de LC3-I/II; Western Blottingdas proteínas LC3-I/II, Lamp-1 e p62/SQSTM e a análise Ultra-estrutural. Além disso, foi realizada cultura de fibroblastos, os quais foram submetidos à privação de nutrientes e ao tratamento com Rapamicina, seguidos dasmesmas metodologias de análise invivo. Resultados:As análises histológicas através de H&E e Fosfatase Ácida não revelaram alterações consistentes na musculatura esquelética de animais submetidos aos tratamentos, mostrando em animais com deficiência de Neu1 um aumento anormal do espaço endomisial, e aumento da atividade lisossomalintracitoplasmáticos. Na análise ultra-estruturalobservou-se em todos os grupos, a presença de diversas estruturas com aspecto autofágico, de diferentes tamanhos, formas e constituintes. Naanálise da expressão do LC3 através de Western Blottingmostrou importante ativação do LC3-II na privação alimentar (com e sem administração de Colchicina) tanto em animais controles quanto em animais com deficiência de Neu1 e uma importante ativação do LC3-I em Rapamicina em ambos os grupos mostrando assim que houve um aumento da via da autofagia através do bloqueio do mTOR. Já na análise de Imunofluorescência não foi possível observar diferença consistenteentre os grupos.A análise in vitrode Western Blottingmostrou que tal ativação foi similar entre fibroblastos Neu1+/+e Neu1-/-. Conclusão:Os experimentos relacionados com a ativação ou inibição da autofagia, não resultaram em diferenças consideráveis entre músculos normais e músculos com deficiência de Neu1. Desta forma, podemos concluir com estes experimentos que aparentemente a Neu1, apesar de ser uma importante enzima lisossomal, não interfere com o processo de autofagia / Introduction:Neuraminidase 1 (hereinafter Neu1) regulates the catabolism of sialoglycoconjugates in lysosomes. The congenital deficiency of Neu1 is the basis of sialidosis, a severe neurosomatic disease associated with osteo-skeletal deformities, hypotonia, and muscle weakness. Mice with Neu1deficient develop an atypical form of muscle degeneration characterized by abnormal fibroblast proliferation leading to muscle fiber invasion, extracellular matrix expansion (ECM), cytoplasm fragmentation, vacuolar formation, and muscle atrophy. The occurrence of muscle atrophy indicates that deficiencyofNeu1 may be related to the control of muscle mass, which is dependent on the balance between synthesis and protein degradation. A major feature in Macroautophagy (hereinafter referred to as autophagy) is the main pathway of intracellular degradation being expressly essential for cellular homeostasis and removal of cytoplasmic materials. Objectives:To evaluate whether the effects of neuraminidase 1 deficiency affect autophagy induction and autophagosome formation and to determine the effects of lysosomal function block on muscle phenotype in neuraminidase 1 deficiency. Methodos:Mice Neu1+/-were crossbred and the genotyped pups, where mice Neu1-/-(knockout) and Neu1+/+(normal), were used in the study ntotal = 90, 10 for standardization, 20 for fibroblast collection and 60 for in vivo procedures, experimental groups were divided into food deprivation for 2 days that, through mTOR inhibition, induces autophagy; Colchicine treatment group for 4 days whereit will prevent autophagosome/lysosome junction without lysosomal degradation and added in the last two days of food deprivation and Rapamycin treatment group for 7 days, drug with function to selectively inhibit mTOR. After the treatments, the animals were euthanized to collect the anterior gastrocnemius and tibial muscles. The muscles were analyzed after histological staining by Hematoxylin & Eosin and Acid Phosphatase; LC3-I/II immunofluorescence; Western Blottingof LC3-I/II, Lamp-1 and p62/SQSTM proteins and Ultra-structural analysis. In addition, fibroblasts were cultured and subjected to nutrient deprivation and Rapamycin treatment, followed by the same in vivo analysis methodologies. Results:Histological analyzes by H&E and Acid Phosphatase did notreveal consistent changes in skeletal muscle of animals submitted to treatments, showing in animals with Neu1 deficiency an abnormal increase in endomysial space and increased intracytoplasmic lysosomal activity.In ultrastructural analysis, it was observed in all groups, the presence of several structures with autophagic aspect, of different sizes, shapes and constituents. The analysis of LC3 expression by Western Blottingshowed important activation of LC3-II in food deprivation (with and without Colchicine administration) in both control and Neu1 deficient animals and an important activation of LC3-I in Rapamycininboth groups,thus showing an increase in the autophagy pathway through mTOR blockade. In the immunofluorescence analysis, it was not possible to observe consistent difference between the groups. In vitro Western Blottinganalysis showed that such activation was similar between Neu1+/+and Neu1-/-fibroblasts. Conclusion: Experiments related to activation or inhibition of autophagy did not result in considerable differencesbetween normal muscles and Neu1 deficient muscles. Thus, we can conclude from these experiments that apparently Neu1, despite being an important lysosomal enzyme, does not interfere with the autophagy process