Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-09T12:02:26Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Janaina Gomes de Siqueira - 2016.pdf: 2965200 bytes, checksum: 015ab0c28746d09363a65c8817dd4068 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-09T12:03:04Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Janaina Gomes de Siqueira - 2016.pdf: 2965200 bytes, checksum: 015ab0c28746d09363a65c8817dd4068 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-09T12:03:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Janaina Gomes de Siqueira - 2016.pdf: 2965200 bytes, checksum: 015ab0c28746d09363a65c8817dd4068 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-11-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Histoplasma capsulatum var. capsulatum is a pathogenic fungus that causes the systemic disease known as histoplasmosis. This mycosis presents endemicity in the regions of the Mississippi and Ohio rivers in the United States, also found in several countries of South America. In Brazil, the number of people infected by this fungus has been growing in recent years, especially in immunocompromised people. H. capsulatum is a thermodymorphic microorganism, found in two morphotypes: mycelium at 25ºC and yeast at 37ºC. During the infection process the pathogenic microorganism needs to obtain nutrients so that it grows and develops within the tissue of the host. Among the essential nutrients, zinc is an essential metal ion, used in the maintenance of numerous metabolic pathways. Zinc is used as catalytic and structural cofactor of numerous metalloproteins. Zinc uptake is characterized as a virulence factor in H. capsulatum. In order to study the molecular mechanisms of zinc homeostasis in H. capsulatum, the in silico analysis of zinc homeostasis related proteins. The ZafA transcription factor, which acts on the regulation of genes in response to the zinc level in the medium and the transcription factor PacC that regulates genes in response to pH, were also found. ZrfA and ZrfC membrane transporters were also found ZrfF, ZrcA and ZrcC vacuolar transporters. The transcriptional profile analysis of these genes was measured by RT-PCR in infected macrophages and in vitro. During the infection the ZafA and ZrfA genes were induced, suggesting that these genes were expressed in order to supply the fungal cell with zinc, due to the metal deficiency caused by the infection. In vitro, ZafA, ZrfC, ZrfF, ZrcA and ZrcC were induced at zinc deprivation condition, compared with control condition. According with proteomic data of fungus under conditions of zinc deprivation, it was suggested the induction of proteins related to rescue, defense and virulence, related mainly to oxidative stress, besides other metabolic pathways such as gluconeogenesis. These data suggest that the fungus undergoes a metabolic remodeling in response to the oxidative stress caused by zinc deprivation. / Histoplasma capsulatum var. capsulatum é um fungo patogênico causador da doença sistêmica conhecida como histoplasmose. Essa micose apresenta endemicidade nas regiões do rio Mississipi e Ohio nos Estados Unidos, encontrado também em vários países da América do Sul. No Brasil, o número de pessoas infectadas por este fungo vem crescendo nos últimos anos, principalmente em pessoas imunocomprometidas. H. capsulatum é um micro-organismo termodimórfico, encontrado em dois morfotipos: micélio a 25ºC e levedura a 37ºC. Durante o processo de infecção o micro-organismo patogênico necessita obter nutrientes para que cresça e se desenvolva dentro do tecido do hospedeiro. Dentre os nutrientes essenciais, o zinco é um íon metal essencial, utilizado na manutenção de inúmeras vias metabólicas. O zinco é utilizado como cofator catalítico e ou estrutural de inúmeras metaloproteínas. A captação de zinco é caracterizada como um fator de virulência em H. capsulatum. Com o objetivo de estudar os mecanismos moleculares da homeostase de zinco em H. capsulatum, foi realizada primeiramente a análise in silico das proteínas relacionadas a homeostase de zinco. Foram encontrados o fator de transcrição ZafA que atua na regulação de genes em resposta ao nível de zinco no meio e o fator de transcrição PacC que atua na regulação de genes em resposta ao pH, adicionalmente foram encontrados transportadores de membrana ZrfA e ZrfC, além dos transportadores vacuolares ZrfF, ZrcA e ZrcC. A análise do perfil transcricional destes genes foi mensurada por RT-PCR em macrófagos infectados e in vitro. Durante a infecção os genes ZafA e ZrfA foram induzidos, sugerindo que estes genes foram expressos a fim de suprir a célula fúngica com zinco, devido a deficiência do metal causada pela infecção. In vitro, ZafA, ZrfC, ZrfF, ZrcA e ZrcC foram induzidos na condição de privação de zinco, comparado com a condição controle. De acordo com os dados proteômicos do fungo em condições de privação zinco, foi sugerido a indução de proteínas relacionadas ao resgate, defesa e virulência, relacionadas principalmente ao estresse oxidativo, além de outras vias metabólicas como gliconeogênese. Estes dados sugerem que o fungo sofre um remodelamento metabólico em resposta ao estresse oxidativo causado pela privação de zinco.

Submitted by Cássia Santos (cassia.bcufg@gmail.com) on 2017-08-03T15:48:21Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marielle Garcia Silva - 2014.pdf: 4245927 bytes, checksum: 01ba5c62c3b90ad1f08e7f5fd48439e6 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-08-07T15:38:38Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marielle Garcia Silva - 2014.pdf: 4245927 bytes, checksum: 01ba5c62c3b90ad1f08e7f5fd48439e6 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T15:38:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marielle Garcia Silva - 2014.pdf: 4245927 bytes, checksum: 01ba5c62c3b90ad1f08e7f5fd48439e6 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2014-08-04 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Paracoccidioides spp. are pathogenic fungi that causes paracoccidioidomycosis, an important systemic mycosis in Latin American countries. The success of infection depends on the pathogen ability to obtain essential micronutrients (metals) from the host. This process of nutrient uptake occurs through membrane associated transporters. The membranes are constituted of a lipid bilayer with associated proteins and are involved in different processes during the establishment of infection, such as transport of nutrients and homeostatic regulation. As zinc is a metal that plays an important role in the regulation of host-pathogen interaction and changes in this micronutrient homeostasis are implicated in the pathogenesis of infectious diseases, the aim of this study was to identify the membrane proteins expressed under conditions of zinc deprivation. NanoUPLC-MSE technique was employed in order to identify membrane proteins of yeast cells (Pb01) grown in chemically defined media in the presence and absence of zinc. Transmission electron microscopy was performed to confirm the sample enrichment with membranes. Subsequently, the samples were digested and analyzed by NanoUPLC-MSE. In silico analysis was performed to determine the location of 460 proteins identified in extracts of Pb01 grown in + Zn (control) and TPEN (treated) medium. Among the identified proteins, 141 were classified as belonging to membranes and of those, 120 proteins were repressed and 21 were induced during zinc deprivation. Among the 141 membrane proteins, 81 showed transmembrane domains and 9 were classified as membranes proteins with post-transcriptional modification. A total of 15 membrane proteins showed signal peptide. Analysis of the function of membrane proteins, allowed the description that phospholipid metabolism and cell integrity maintenance pathways were affected by zinc deprivation. / Paracoccidioides spp. são fungos patogênicos, causadores da paracoccidioidomicose, uma importante micose sistêmica nos países latino-americanos. O sucesso da infecção depende da capacidade do patógeno obter micronutrientes essenciais (metais) a partir do hospedeiro. Este processo de captação de nutrientes ocorre através de transportadores associados às membranas. As membranas são constituídas por uma bicamada lipídica com proteínas associadas e estão envolvidas em diferentes processos durante o estabelecimento da infecção, como transporte de nutrientes e regulação homeostática da célula. Como o zinco é um metal que desempenha um papel importante na regulação da interação patógeno-hospedeiro e distúrbios na homeostase deste micronutriente estão implicados na patogênese de doenças infecciosas, o objetivo deste estudo foi identificar as proteínas de membranas expressas em condições de privação de zinco. A técnica NanoUPLC-MSE foi empregada para identificar proteínas de membranas de células de levedura (Pb01) cultivadas em meio quimicamente definido na presença e ausência de zinco. Microscopia eletrônica de transmissão foi realizada para confirmar o enriquecimento da amostra com membranas. Posteriormente, as amostras foram digeridas e analisadas por NanoUPLC-MSE. Análises in silico foram realizadas para determinação da localização de 460 proteínas obtidas do extrato proteico de Pb01 cultivado em meio com zinco (controle) e TPEN (tratado). Do total de proteínas identificadas, 141 proteínas foram classificadas como pertencentes a membranas e destas, 120 proteínas foram reprimidas e 21 foram induzidas durante privação de zinco. Dentre as 141 proteínas de membranas, 81 apresentaram domínio transmembrana e 9 foram classificadas como sendo de membrana, em decorrência de modificação pós-traducional. Um total de 15 proteínas de membrana apresentou peptídeo sinal. Análises da função das proteínas de membranas permitiu a descrição de que o metabolismo de fosfolipídeos e a integridade celular foram afetados pela privação de zinco.