Les progéniteurs bronchioloalvéolaires situés aux jonctions bronchioloalvéolaires peuvent être impliqués dans l'embryogenèse ou la régénération. Ces cellules non décrites chez les gros animaux peuvent participer au développement de nouvelles thérapies contre les maladies pulmonaires aiguës ou chroniques. Dans cette étude, nous avons établi la présence de progéniteurs bronchioloalvéolaires dans les poumons des ovins nouveaux nés. Ces cellules ont été identifiées par leur co-expression des protéines CCSP, SP-C et CD34. Une population mineure de cellules CD34pos/SP-Cpos/CCSPpos (0,33% ± 0,31) était présente ex vivo. Le tri magnétique des cellules CD34pos a permis l'isolement des progéniteurs SP-Cpos/CCSPpos (> 80%). Ces cellules étaient maintenues et amplifiées in vitro en interface liquide/liquide. De même, ces progéniteurs étaient capables de se différencier soit en cellules de Clara soit en AEC II dans différents milieux de cultures synthétiques et diverses matrices extracellulaires. En outre, les progéniteurs bronchioloalvéolaires obtenus ex vivo et in vitro exprimaient les gènes NANOG, Oct4 et BMI1 spécifiques aux cellules souches. Nous rapportons ainsi, pour la première fois dans un grand animal, l'existence de cellules progénitrices bronchioloalvéolaires à fort potentiel de double différenciation et d'expression de certains gènes de cellules souches.

L’endothélium joue un rôle primordial dans le développement et le maintien des multiples fonctions vasculaires. Il est ainsi largement impliqué dans des situations pathologiques comme les maladies cardio-vasculaires. La description de marqueurs endothéliaux circulants a permis une exploration non invasive de l'endothélium. Notre équipe s’est intéressée principalement aux cellules endothéliales circulantes (CEC), dont le taux reflète la lésion ou l’activation de l’endothélium, et aux progéniteurs endothéliaux circulants (PEC), marqueurs de régénération endothéliale. La découverte en 1997 par Asahara de la présence chez l’adulte de ces PEC, participant à la formation de nouveaux vaisseaux par vasculogenèse, a ouvert de nouvelles perspectives, notamment pour la thérapie cellulaire des pathologies ischémiques. Ce travail a consisté à développer les méthodes d’étude de ces cellules dans plusieurs contextes. Tout d’abord, nous avons exploré l’utilité de ces marqueurs dans la physiopathologie de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Puis nous avons analysé le potentiel de mobilisation des progéniteurs endothéliaux à partir de la paroi vasculaire lors d’une ischémie locale chez des volontaires sains dans le cadre du développement d’un produit de thérapie cellulaire autologue. Une partie de ce projet a été de mettre en place et d’optimiser les techniques d’étude de ces marqueurs. Les CEC ont été quantifiées par immunoséparation magnétique (IMS), technique mise au point en 1992 (Dignat-George 1992) et transférée dans notre laboratoire. La quantification des PEC a été réalisée par cytométrie en flux et par culture cellulaire. En culture, deux types de PEC sont décrits : les PEC précoces, dont l’origine est monocytaire et pour lesquels la culture est déjà standardisée, et les « Endothelial Colony Forming Cells » (ECFC), seules cellules présentant des caractéristiques de cellules endothéliales progénitrices et pouvant être proposées comme produit de thérapie cellulaire. Nous avons optimisé la quantification des ECFC en culture en étudiant l’effet de diverses matrices et de la densité d’ensemencement des cellules mononucléées issues du sang total sur l’obtention de ces cellules et leurs propriétés angiogènes. La dysfonction endothéliale a été décrite comme un élément central dans le développement de l’HTAP dont le diagnostic repose sur la mesure de la pression artérielle pulmonaire par cathétérisme cardiaque droit. En l’absence de marqueur biologique non invasif dans cette maladie, nous avons quantifié les CEC et les progéniteurs circulants dans deux études. Une étude réalisée chez des patients adultes a montré une augmentation spécifique des CEC dans l’HTAP et non dans l’hypertension pulmonaire thromboembolique chronique. Ainsi les CEC semblent être le reflet des lésions endothéliales pulmonaires et non de la sévérité clinique des patients. L’autre étude a montré l’intérêt de la quantification des CEC dans la prise en charge thérapeutique des enfants souffrant d’HTAP secondaire à une cardiopathie congénitale, dont les formes irréversibles présentaient des taux élevés de CEC. Nous avons ainsi défini un nouveau marqueur non invasif à utilité diagnostique et pronostique. Les PEC sont des cellules rares dans le sang circulant, difficiles à expandre, et dont les essais de mobilisation médullaire se sont révélés insuffisants. L’hypothèse récente d’une réserve vasculaire des progéniteurs endothéliaux nous a conduits à étudier l’effet d’un processus d’ischémie locale sur la mobilisation de ces cellules chez des volontaires sains. Deux groupes d'âge ont été inclus afin d'évaluer l'impact du vieillissement sur la méthode de mobilisation étudiée. Malgré un effet de cette ischémie sur la dilatation endothéliale cette méthode n’a pas permis de mobiliser significativement les PEC issus de la paroi endothéliale, quel que soit l'âge des sujets. A l’inverse, l’hypoxie a eu un effet délétère sur les capacités angiogènes des ECFC. / The endothelium plays a key role in the development and the homeostasis of vascular functions. It is also well involved in pathological situations like cardiovascular diseases. Thanks to the description of circulating endothelial markers, non invasive study of the endothelium is now possible. Our group was particularly interested in circulating endothelial cells (CECs), the level of which reflects an endothelial activation or lesion, and to circulating endothelial progenitors cells (EPCs), markers of endothelial repair. EPC description by Asahara in 1997 in adult blood, involved in new blood vessel formation by vasculogenesis, offered new perspectives, specially for cell therapy in ischemic diseases. This work consisted in the development of methods to study these markers in different contexts. First, we explored the interest of these markers in the physiopathology of pulmonary arterial hypertension (PAH). Then we evaluated endothelial progenitors mobilization from the vascular wall by a local ischemia process in healthy volunteers, in the perspective of an autologous cell therapy product development. One part of this project was the implementation and optimization of the methods to study CEC and EPC. CEC were quantified by magnetic immunoseparation. This technique was developped in 1992 by F. Dignat-George's group and transferred in our laboratory. EPC were quantified by flow cytometry and cell culture. Two types of EPC are described in culture: the early EPC, which originate from monocyte lineage and which culture is standardized, and the « Endothelial Colony Forming Cells » (ECFC), the only cells presenting endothelial progenitor cell properties and which use as a cell therapy product can be considered. ECFC quantification by culture was optimized by assessment of the impact of diverse matrices and seeding concentrations of mononuclear cells isolated from whole blood, on ECFC commitment and their angiogenic properties. Endothelial dysfunction was described as a central element in the development of PAH, which diagnosis is based on the use of right heart catheterization. Due to the lack of noninvasive marker for this disease, CEC and circulating progenitors were quantified in two studies. One of them realized in adult patients showed a specific increase of CEC in PAH and not in post-embolic PH. CEC would then reflect the presence of specific endothelial lesions and not the clinical state of the patients. The other study demonstrated the interest of CEC quantification in the therapeutic care of children with PAH secondary to congenital heart disease, for whom patients in irreversible state had a higher level of CEC. We then defined a new noninvasive biomarker.that can be used for the diagnosis and prognosis of PAH. EPC are rare events in whole blood, difficult to expand and for which, mobilization protocols revealed insufficient. The recent hypothesis of a vascular reservoir for endothelial progenitor led us to study the effect of a local ischemia procedure on the mobilization of these cells in healthy volunteers. Two age groups were included to assess the impact of aging on this procedure. Despite a significant endothelial dilation with the local ischemia, no EPC were mobilized, whatever the age group. Ischemia even altered ECFC angiogenic properties.

La thérapie cellulaire est une envisagée pour traiter des pathologies cardiaques ou squelettiques basée sur la médecine régénérative. Les progéniteurs cellulaires classiquement utilisés (myoblastes ou cellules mésenchymateuses) n'ont démontré qu'une efficacité limitée. Dans ce contexte, notre laboratoire a identifié une nouvelle catégorie de progéniteurs, sur la base de leur activité enzymatique aldéhyde déshydrogénase (ALDH) mise en évidence par un substrat fluorescent, l'Aldéfluor, et en association avec le marqueur CD34. Les ALDH sont impliquées dans le métabolisme et la détoxification des aldéhydes, et constituent un nouveau marqueur des cellules souches. Ce travail de thèse a permis de mieux caractériser les progéniteurs myogéniques (ALDH+/CD34-) et non myogéniques (ALDH+/CD34+), dans différents contextes physiopathologiques. Leur présence dans différents muscles de primates humains ou non humains, leur persistance au cours du vieillissement naturel ou lors d'atteinte par la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) chez l'Homme et dans des modèles animaux, suggèrent une utilisation possible des cellules ALDH+/CD34- pour des développements thérapeutiques ultérieurs. L'étude phénotypique révèle que des marqueurs transmembranaires sont associés à des sous-populations de cellules ALDH myogéniques ou non myogéniques dont la comparaison permettra de proposer de meilleurs candidats de thérapie cellulaire. En parallèle, les caractérisations histologiques et cytologiques ont identifié des sous-populations exprimant des isoenzymes et les analyses d'expressiongénique réalisées ex vivo et en culture suggèrent que certaines sont impliquées dans l'homéostasie musculaires. / Cell therapy is a regenerative medicine strategy considered for the treatment of cardiac or skeletal muscle diseases. The cellular progenitors used to date (myoblasts or mesenchymal stem cells) provided mitigated success, thus mandating the identification and characterization of new categories of progenitors. Our laboratory has identified new populations of progenitors, based on their Aldehyde Deshydrogenase activity (ALDH) detectable using the fluorescent substrate Aldefluor, associated with the expression of the CD34 marker. ALDH are involved in metabolism and detoxification of aldehydes, they play important roles in cell survival and differentiation and are considered a new marker of stem cells. The present project allowed characterizing extensively the myogenic (ALDH+/CD34-) and non myogenic (ALDH+/CD34+) progenitors, in several physiopathological contexts and animal models. The presence of ALDH+/CD34- cells in distinct muscle groups in Human and non-human Primates, their persistence through natural ageing and despite the ongoing degenerative process observed in Duchenne muscular dystrophy in Human patients and animal models suggest their future use for therapeutic applications. The phenotypic characterization indicated that membrane markers are associated to myogenic or non myogenic sub-populations of ALDH cells. The comparison on their efficacies in vito and in vivo will allow proposing new candidates for cell therapy. In parallele, histological and cytological analysis identified cell populations expressing isoenzymes The analysis of gene expressions suggested that, at least, some of them are involved in muscle homeostasis in situ or in vitro.

Malgré l’efficacité thérapeutique avérée des agents anti-angiogéniques et des agents anti-vasculaires (VDA), le mécanisme d’action précis des stratégies ciblant les vaisseaux sanguins tumoraux, les raisons de leur efficacité ainsi que les mécanismes de résistance à ces drogues sont encore mal compris. Il est rapidement apparu essentiel d’identifier des biomarqueurs capables de refléter l’angiogénèse tumorale ou les effets sur la vascularisation tumorale de ces traitements. Compte tenu de leur importance dans des pathologies vasculaires, les cellules endothéliales matures circulantes (CEC) et les progéniteurs endothéliaux circulants (CEP) ont d’emblée été pressenties comme des candidats intéressants pour être des biomarqueurs de réponse aux stratégies ciblant la vascularisation tumorale. Nous avons exploré l’intérêt de ces cellules en tant que biomarqueurs de l’angiogénèse dans des tumeurs pédiatriques, et leur rôle en tant que biomarqueurs de traitement par des agents anti-angiogéniques chez des sujets adultes atteints de cancer. Ces travaux ont mis en lumière l’intérêt des CEP et ont été à la source d’un travail plus « mécanistique » où nous avons étudié dans différents modèles murins le rôle des CEC et CEP dans le mécanisme d’action des agents anti-vasculaires et plus particulièrement le rôle fonctionnel des CEP dans la résistance à ces molécules. Par des stratégies d’association d’agents anti-angiogéniques aux VDA destinées à inhiber les CEP, nous montrons l’augmentation de l’activité anti-tumorale des VDA et offrons un rationnel mécanistique pour optimiser les schémas thérapeutiques actuels des traitements anti-vasculaires. Nos données apportent des arguments en faveur du rôle potentiel de ces cellules en tant que biomarqueurs de l’angiogénèse, des traitements anti-angiogéniques et de la résistance aux traitements anti-vasculaires. / Despite their therapeutic impact and clinical benefit, the mecanisms of action of anti-angiogenic agents and vascular disrupting agents (VDA), the reasons for their efficacy as well as the mechanisms underlying resistance to these drugs are not fully understood. Thus, identifying surrogate biomarkers of tumor angiogenesis and of the effects of these new therapeutic agents targeting tumor blood vessels has become a crucial objective. Because of their importance in vascular diseases, mature circulating endothelial cells (CEC) and circulating endothelial progenitor cells (CEP) were suggested to be potential candidate biomarkers of disease response and relapse to vascular targeting strategies. We investigated the role of these cells as biomarkers of tumor angiogenesis in pediatric solid tumors, as well as biomarkers of response to anti-angiogenic therapies in adult cancer patients. By revealing the particularly important role of CEP, these initial studies led to a more “mechanistic” study in which the cellular and molecular effects of a VDA were evaluated with regard to CEC and CEP in different mouse models; in particular, the “catalytic” role of CEP was explored as a mechanism of resistance to VDA. By combining anti-angiogenic agents aimed to inhibit CEP mobilized by the VDA, we demonstrate an increase in the anti-tumor activity of the VDA and offer a mechanistic rational to optimize VDA-based therapeutic strategies. Our data support the role of CEC and CEP as biomarkers of angiogenesis, of anti-angiogenic strategies and of resistance to vascular-disrupting therapies.

Les péricytes sont fortement suspectés de jouer un rôle déterminant dans la physiopathologie de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP), non seulement en raison de leur position et distribution, de leur rôle dans l'homéostasie vasculaire, de leur plasticité et spécificité tissulaire, mais aussi vu leur nette augmentation en nombre autour des artérioles pulmonaires remodelées. Cependant, les mécanismes impliqués dans leur accumulation autour des vaisseaux remodelés ainsi que leur importance dans la mise en place et la progression de l’HTAP restent encore incompris. De plus, nous ne savons pas si les péricytes présentent ou non des anomalies phénotypiques dans l’HTAP.C’est pourquoi ces travaux de doctorat ont visé à : 1) Identifier les possibles anomalies intrinsèques des péricytes provenant de patients HTAP ; 2) Préciser rôle de la voie de signalisation CXCL12/CXCR4/CXCR7 dans l’augmentation de la couverture péricytaire et tester des inhibiteurs de cette voie dans des modèles précliniques d’hypertension pulmonaire (HP) ; 3) Etudier l’impact du pouvoir mésenchymateux des péricytes dans le remodelage vasculaire pulmonaire associé à l’HTAP.Nos données ont permis d’une part de démontrer que les péricytes provenant de patients HTAP possédent des défauts intrinsèques dans les mécanismes de prolifération, de migration et de différenciation cellulaire et que la voie du CXCL12 contribue fortement à l’augmentation anormale de la couverture péricytaire autour des vaisseaux remodelés de patients HTAP. D’autre part, via leur capacité à se différencier en cellules contractiles, nous avons pu démontrer que les péricytes contribuaient directement au remodelage vasculaire pulmonaire.En conclusion, notre étude montre ainsi l’importance du rôle des péricytes pulmonaires dans la progression de l’hypertension artérielle pulmonaire humaine et expérimentale. / Pericytes (PCs) are strongly suspected to play a determining role in the pathophysiology of pulmonary arterial hypertension (PAH), because of their position and distribution, role in vascular homeostasis, versatility and tissue-specificity, but also because they accumulate around remodeled pulmonary arterioles in PAH. However, the underlying mechanisms and their dynamic role in PAH are still unknown. Furthermore, we do not know whether pulmonary PCs are phenotypically and functionally altered in PAH. To answer these questions, our objective were: 1) To examine the phenotypic and functional characteristics of human pulmonary PCs derived from control and PAH patients; 2) To precise the role of the intrinsic abnormalities in the altered phenotype of pulmonary PCs in PAH; 3) To study the dynamic role(s) of pulmonary PCs in preclinical PAH models, especially through modulation of the CXCL12/CXCR4/CXCR7 signaling pathway. Taken together, our findings identify for the first time phenotypic and functional abnormalities of pulmonary PCs in PAH with pathogenetic significance since they increased directly their proliferation, migration and capacity to differentiate in smooth muscle-like cells.

Des études présentées dans cette thèse ont permis de démontrer que le gène du groupe Polycomb (PcG) Bmi1 est essentiel à l’auto-renouvellement des progéniteurs rétiniens immatures et pour le développement rétinien après la naissance. Ce travail illustre chez l’embryon que Bmi1 est hautement enrichie dans une sous-population de progéniteurs rétiniens exprimant le marqueur de surface SSEA-1 et différents marqueurs de cellules souches. À tous les stades de développement analysés, l’absence de Bmi1 résulte en une diminution de la prolifération et de l’auto-renouvellement des progéniteurs immatures. Pour mieux comprendre la cascade moléculaire en absence de Bmi1, nous avons inactivé p53 dans les colonies Bmi1-/-. Cette inactivation a permis une restauration partielle du potentiel d’auto-renouvellement. De plus, en absence de Bmi1, la prolifération et la maintenance de la population de progéniteurs rétiniens immatures localisés dans le corps ciliaire sont aussi affectées après la naissance. Bmi1 permet donc de distinguer les progéniteurs immatures de la population principale de progéniteurs, et est requis pour le développement normal de la rétine. Nous avons également démontré que l’oncogène Bmi1 est requis dans les neurones pour empêcher l’apoptose et l’induction d’un programme de vieillissement prématuré, causé par une baisse des défenses anti-oxydantes. Nous avons observé dans les neurones Bmi1-/- une augmentation des niveaux de p53, de la concentration des ROS et de la sensibilité aux agents neurotoxiques. Nous avons démontré ainsi que Bmi1 contrôle les défenses anti-oxydantes dans les neurones en réprimant l’activité pro-oxydante de p53. Dans les neurones Bmi1-/-, p53 provoque la répression des gènes anti-oxydants, induisant une augmentation des niveaux de ROS. Ces résultats démontrent pour la première fois que Bmi1 joue un rôle critique dans la survie et le processus de vieillissement neuronal. / The studies presented in this thesis establish that the Polycomb Group (PcG) gene Bmi1 is required for the self-renewal of immature retinal progenitor cells (RPCs) and for postnatal retinal development. Work performed in mouse embryos reveals that Bmi1 is highly enriched in a RPC subpopulation expressing the cell surface antigen SSEA-1 and different stem cell markers. Furthermore, at all developmental stages analysed, Bmi1 deficiency resulted in reduced proliferation and self-renewal of immature RPCs. To better understand the molecular cascade leading to this phenotype, we inactivated p53 in Bmi1-deficient colonies. p53 inactivation partially restored RPCs self-renewal potential. Moreover, the proliferation and the postnatal maintenance of an immature RPC population located in the ciliary body was also impaired in absence of Bmi1. Thus, Bmi1 distinguishes immature RPCs from the main RPC population and is required for normal retinal development. We have also shown that the oncogene Bmi1 is required in neurons to prevent apoptosis and the induction of a premature aging-like program characterized by reduced antioxidant defenses. We observed in Bmi1-deficient neurons an increased p53 and ROS levels, and a hypersensitivity to neurotoxic agents. We demonstrated that Bmi1 regulate antioxidant defenses in neurons by suppressing p53 pro-oxidant activity. In Bmi1-/- neurons, p53 induces antioxidant genes repression, resulting in increased ROS levels. These findings reveal for the first time the major role of Bmi1 on neuronal survival and aging.

Lors du développement, la coordination d’évènements moléculaires et cellulaires mène à la production du cortex qui orchestre les fonctions sensori-motrices et cognitives. Son développement s’effectue par étapes : les cellules gliales radiaires (RGs) – les cellules souches neurales (NSCs) du cerveau en développement – et les cellules progénitrices de la zone ventriculaire (VZ) et de la zone sous ventriculaire (SVZ) génèrent séquentiellement des vagues distinctes de nouveaux neurones qui formeront les différentes couches corticales. Autour de la naissance, les RGs changent de devenir et produisent des cellules gliales. Cependant, une fraction persiste tout au long de la vie dans la SVZ qui borde le ventricule, perdant au passage leur morphologie radiale. Ces NSCs produisent ensuite les différents sous types d’interneurones du bulbe olfactif ainsi que des cellules gliales en fonction de leur origine spatiale dans la SVZ. Ces observations soulèvent d’importantes questions non résolues sur 1) le codage transcriptionnel régulant la régionalisation de la SVZ, 2) le potentiel des NSCs postnatales dans la réparation cérébrale, et 3) le lignage et les spécificités transcriptionnelles entre les NSCs et leur descendants. Mon travail de doctorat repose sur une étude transcriptionnelle des domaines de la SVZ postnatale. Celle-ci soulignait le fort degré d’hétérogénéité des NSCs et progéniteurs et identifiait des régulateurs transcriptionnels clés soutenant la régionalisation. J’ai développé des approches bio-informatiques pour explorer ces données et connecter l’expression de facteurs de transcription (TFs) avec la genèse régionale de lignages neuraux distincts. J’ai ensuite développé un modèle d’ablation ciblée pour étudier le potentiel régénératif des progéniteurs postnataux dans divers contextes. Finalement, j’ai participé au développement d’une procédure pour explorer et comparer des progéniteurs pré et postnataux à l’échelle de la cellule unique. Objectif 1 : Des expériences de transcriptomique et de cartographie ont été réalisées pour étudier la relation entre l’expression régionale de TFs par les NSCs et l’acquisition de leur devenir. Nos résultats suggèrent un engagement précoce des NSCs à produire des types cellulaires définis selon leur localisation spatiale dans la SVZ et identifient HOPX comme un marqueur d’une sous population biaisé à générer des astrocytes. Objectif 2 : J’ai mis au point un modèle de lésion corticale qui permet l’ablation ciblée de neurones de couches corticales définies pour étudier la capacité régénérative et la spécification appropriée des progéniteurs postnataux. Une analyse quantitative des régions adjacentes, incluant la région dorsale de la SVZ, a révélé une réponse transitoire de progéniteurs définis. Objectif 3 : Nous avons développé la lignée de souris transgénique Neurog2CreERT2Ai14, qui permet le marquage de cohortes de progéniteurs glutamatergiques et de leurs descendants. Nous avons montré qu’une large fraction de ces progéniteurs persiste dans le cerveau postnatal après la fermeture de neurogénèse corticale. Ils ne s’accumulent pas pendant le développement embryonnaire mais sont produits par des RGs qui persistent après la naissance dans la SVZ et qui continuent de générer des neurones corticaux, bien que l’efficacité soit faible. Le séquençage d’ARN sur cellule unique a révélé une dérégulation transcriptionnelle qui corrèle avec le déclin progressif observé in vivo de la neurogénèse corticale. Ensemble, ces résultats soulignent le potentiel des études transcriptomiques à résoudre mais aussi à soulever des questions fondamentales comme les changements trancriptionnels intervenant dans une population de progéniteurs au cours du temps et participant aux changements de leur destinée. Cette connaissance sera la clé du développement d’approches novatrices pour recruter et promouvoir la génération de types cellulaires spécifiques, incluant les sous-types neuronaux dans un contexte pathologique. / During development, a remarkable coordination of molecular and cellular events leads to the generation of the cortex, which orchestrates most sensorimotor and cognitive functions. Cortex development occurs in a stepwise manner: radial glia cells (RGs) - the neural stem cells (NSCs) of the developing brain - and progenitor cells from the ventricular zone (VZ) and the subventricular zone (SVZ) sequentially give rise to distinct waves of nascent neurons that form cortical layers in an inside-out manner. Around birth, RGs switch fate to produce glial cells. A fraction of neurogenic RGs that lose their radial morphology however persists throughout postnatal life in the subventricular zone that lines the lateral ventricles. These NSCs give rise to different subtypes of olfactory bulb interneurons and glial cells, according to their spatial origin and location within the postnatal SVZ. These observations raise important unresolved questions on 1) the transcriptional coding of postnatal SVZ regionalization, 2) the potential of postnatal NSCs for cellular regeneration and forebrain repair, and 3) the lineage relationship and transcriptional specificities of postnatal NSCs and of their progenies. My PhD work built upon a previously published comparative transcriptional study of defined microdomains of the postnatal SVZ. This study highlighted a high degree of transcriptional heterogeneity within NSCs and progenitors and revealed transcriptional regulators as major hallmarks sustaining postnatal SVZ regionalization. I developed bioinformatics approaches to explore these datasets further and relate expression of defined transcription factors (TFs) to the regional generation of distinct neural lineages. I then developed a model of targeted ablation that can be used to investigate the regenerative potential of postnatal progenitors in various contexts. Finally, I participated to the development of a pipeline for exploring and comparing select populations of pre- and postnatal progenitors at the single cell level. Objective 1: Transcriptomic as well as fate mapping were used to investigate the relationship between regional expression of TFs by NSCs and their acquisition of distinct neural lineage fates. Our results supported an early priming of NSCs to produce defined cell types depending of their spatial location in the SVZ and identified HOPX as a marker of a subpopulation biased to generate astrocytes. Objective 2: I established a cortical lesion model, which allowed the targeted ablation of neurons of defined cortical layers to investigate the regenerative capacity and appropriate specification of postnatal cortical progenitors. Quantitative assessment of surrounding brain regions, including the dorsal SVZ, revealed a transient response of defined progenitor populations. Objective 3: We developed a transgenic mouse line, i.e. Neurog2CreERT2Ai14, which allowed the conditional labeling of birth-dated cohorts of glutamatergic progenitors and their progeny. We used fate-mapping approaches to show that a large fraction of Glu progenitors persist in the postnatal forebrain after closure of the cortical neurogenesis period. Postnatal Glu progenitors do not accumulate during embryonal development but are produced by embryonal RGs that persist after birth in the dorsal SVZ and continue to give rise to cortical neurons, although with low efficiency. Single-cell RNA sequencing revealed a dysregulation of transcriptional programs, which correlates with the gradual decline in cortical neurogenesis observed in vivo. Altogether, these data highlight the potential of transcriptomic studies to unravel but also to approach fundamental questions such as transcriptional changes occurring in a population of progenitors over time and participating to changes in their fate potential. This knowledge will be key in developing innovative approaches to recruit and promote the generation of selected cell types, including neuronal subtypes in pathologies.

Afin de résoudre la problématique des substituts osseux faiblement vascularisés, un des challenges majeurs en ingénierie tissulaire osseuse est de favoriser le développement précoce d’une microvascularisation. La reproduction du microenvironnement local et l’organisation cellulaire in situ sont des approches innovantes pour optimiser la formation osseuse. En Biofabrication, la Bioimpression Assistée par Laser (LAB) est une technologie émergente permettant l’impression de cellules et de biomatériaux avec une résolution micrométrique. L’objectif de ce travail était d’étudier l’effet de l’organisation de la pré-vascularisation par LAB sur la régénération osseuse. La station de bioimpression Novalase a été utilisée pour imprimer des motifs de cellules endothéliales sur un « biopaper » constitué de collagène et de cellules souches issues de la papille apicale. Les paramètres d’impression, densités cellulaires et conditions de recouvrement ont été optimisés afin de favoriser la formation d’un réseau microvasculaire avec une architecture définie in vitro. Ce modèle a ensuite été transposé in vivo, grâce à la bioimpression in situ de cellules endothéliales au niveau de défauts osseux critiques chez la souris, afin d’évaluer si la prévascularisation organisée par LAB permettait de promouvoir et contrôler spatialement le processus de régénération osseuse. Les résultats ont montré que la bioimpression permettait d’augmenter la densité de vaisseaux dans les défauts osseux et de favoriser la régénération osseuse. / In order to solve the issue of poorly vascularized bone substitutes, development of a microvasculature into tissue-engineered bone substitutes represents a current challenge. The reproduction of local microenvironment and in situ organization of cells are innovating approaches to optimize bone formation. In Biofabrication, Laser-Assisted Bioprinting (LAB) has emerged as a relevant method to print living cells and biomaterials with micrometric resolution. The aim of this work was to study the effect of prevascularization organized by LAB on bone regeneration. The laser workstation Novalase was used to print patterns of endothelial cells onto a « biopaper » of collagen hydrogel seeded with stem cells from the apical papilla. Printing parameters, cell densities and overlay conditions were optimized to enhance the formation of microvascular networks with a defined architecture in vitro. This model was then transposed in vivo, through in situ bioprinting of endothelial cells into mouse calvarial bone defects of critical size, to investigate if prevascularization organized by LAB can promote and spatially control bone regeneration. The results showed that bioprinting allowed to increase blood vessel density in bone defects and promote bone regeneration.

Les taux élevés de mortalité et de morbidité associés aux maladies vasculaires en font des pathologies dont les conséquences physiopathologiques, chirurgicales et socio-économiques sont d’une importance majeure pour le système de santé. Malgré leurs avantages, la disponibilité limitée des vaisseaux autologues a conduit au développement de prothèses synthétiques. Cependant, leur surface hautement thrombogène limite leur utilisation dans la substitution des vaisseaux de petit calibre (< 6 mm). De ce fait, à cause de leur obstruction précoce, la reconstitution d’une surface luminale proche de l’endothélium natif est incontournable. Pourtant, les revêtements de surface actuellement disponibles possèdent de médiocres qualités de rétention des néo-endothélium lorsqu’ils sont soumis à des contraintes de cisaillement physiologiques. Dans ce travail, nous proposons un substitut vasculaire de petit calibre endothélialisé réalisé à partir de trois éléments : 1) une matrice préparée à partir d’une artère ombilicale désendothélialisée, 2) un recouvrement de surface innovant constitué du film multicouche de polyélectrolytes (MPE) (PAH-PSS)3-PAH, et 3) un néo-endothélium constitué de cellules endothéliales matures ou progénitrices. Les études in vitro menées sur ces substituts ont montré que la formation, la rétention sous contraintes de cisaillement et la fonctionnalité du néoendothélium élaboré sur la surface luminale étaient améliorées par le film MPE. L’implantation du substitut par pontage termino-latéral sur le lapin a montré que le cahier des charges imputé aux substituts de petit calibre était rempli, principalement en termes de perméabilité et de diamètre, mais aussi de résistance à la suture et aux infections. En conclusion, le film MPE favorise le développement d’un substitut vasculaire de petit diamètre perméable à « long » terme et qui pourrait répondre aux exigences des chirurgiens / Vascular diseases with their high rate of mortality and morbidity belong to the pathologies involving important socio-economic factors for health system. Despite the advantages of autografts, the limited availability of autologous vessels has led to the development of synthetic prostheses. However, their high thrombogenic surface limits their use as small calibre vascular substitutes (< 6 mm). To prevent narrowing of small diameter vascular grafts, the reconstruction of a luminal surface close to the native endothelium is essential. However, the retention of the neo-endothelium subjected to shear stress is poor on the coatings currently available. In this work, we developed a small calibre endothelialized vascular substitute thanks to three elements: 1) a natural matrix prepared from umbilical artery, 2) an innovative coating based on the polyelectrolytes multilayer film (PEM) (PAH-PSS)3-PAH, and 3) used for cell culture of mature or progenitor endothelial cells. In vitro studies have shown that the formation, the retention under shear stress and the endothelial function of the neoendothelium on the luminal surface were improved by PEM film. The anastomosis of this substitute on rabbits has shown that the specifications essential to small calibre vascular grafts were reached, mainly in terms of permeability and diameter but also of resistance to suture and infections. In conclusion, PEM films helped us to develop a small diameter vascular substitute with long term patency

Des études présentées dans cette thèse ont permis de démontrer que le gène du groupe Polycomb (PcG) Bmi1 est essentiel à l’auto-renouvellement des progéniteurs rétiniens immatures et pour le développement rétinien après la naissance. Ce travail illustre chez l’embryon que Bmi1 est hautement enrichie dans une sous-population de progéniteurs rétiniens exprimant le marqueur de surface SSEA-1 et différents marqueurs de cellules souches. À tous les stades de développement analysés, l’absence de Bmi1 résulte en une diminution de la prolifération et de l’auto-renouvellement des progéniteurs immatures. Pour mieux comprendre la cascade moléculaire en absence de Bmi1, nous avons inactivé p53 dans les colonies Bmi1-/-. Cette inactivation a permis une restauration partielle du potentiel d’auto-renouvellement. De plus, en absence de Bmi1, la prolifération et la maintenance de la population de progéniteurs rétiniens immatures localisés dans le corps ciliaire sont aussi affectées après la naissance. Bmi1 permet donc de distinguer les progéniteurs immatures de la population principale de progéniteurs, et est requis pour le développement normal de la rétine. Nous avons également démontré que l’oncogène Bmi1 est requis dans les neurones pour empêcher l’apoptose et l’induction d’un programme de vieillissement prématuré, causé par une baisse des défenses anti-oxydantes. Nous avons observé dans les neurones Bmi1-/- une augmentation des niveaux de p53, de la concentration des ROS et de la sensibilité aux agents neurotoxiques. Nous avons démontré ainsi que Bmi1 contrôle les défenses anti-oxydantes dans les neurones en réprimant l’activité pro-oxydante de p53. Dans les neurones Bmi1-/-, p53 provoque la répression des gènes anti-oxydants, induisant une augmentation des niveaux de ROS. Ces résultats démontrent pour la première fois que Bmi1 joue un rôle critique dans la survie et le processus de vieillissement neuronal. / The studies presented in this thesis establish that the Polycomb Group (PcG) gene Bmi1 is required for the self-renewal of immature retinal progenitor cells (RPCs) and for postnatal retinal development. Work performed in mouse embryos reveals that Bmi1 is highly enriched in a RPC subpopulation expressing the cell surface antigen SSEA-1 and different stem cell markers. Furthermore, at all developmental stages analysed, Bmi1 deficiency resulted in reduced proliferation and self-renewal of immature RPCs. To better understand the molecular cascade leading to this phenotype, we inactivated p53 in Bmi1-deficient colonies. p53 inactivation partially restored RPCs self-renewal potential. Moreover, the proliferation and the postnatal maintenance of an immature RPC population located in the ciliary body was also impaired in absence of Bmi1. Thus, Bmi1 distinguishes immature RPCs from the main RPC population and is required for normal retinal development. We have also shown that the oncogene Bmi1 is required in neurons to prevent apoptosis and the induction of a premature aging-like program characterized by reduced antioxidant defenses. We observed in Bmi1-deficient neurons an increased p53 and ROS levels, and a hypersensitivity to neurotoxic agents. We demonstrated that Bmi1 regulate antioxidant defenses in neurons by suppressing p53 pro-oxidant activity. In Bmi1-/- neurons, p53 induces antioxidant genes repression, resulting in increased ROS levels. These findings reveal for the first time the major role of Bmi1 on neuronal survival and aging.