Rationnel : L'implication établie des progéniteurs endothéliaux circulants dans les phénomènes de néovascularisation chez l'adulte a stimulé la recherche de thérapeutiques angiogènes basées sur la greffe de ces cellules. Deux types cellulaires au phénotype endothélial sont actuellement définis entre autres par leur cinétique d'apparition en culture : les progéniteurs précoces (CFU-EC ou CAC) et tardifs (ECFC). Notre équipe a montré que l'injection thérapeutique de cellules mononucléées de moelle osseuse (BM-MNC) permettait la néovascularisation du site ischémié chez des patients atteints d'artériopathie des membres inférieurs, et que les néovaisseaux formés avaient le phénotype d'ECFC. Nous avons dans un premier temps mesuré les concentrations de différentes protéines modulant l'angiogenèse, chez des patients atteints de pathologies ischémiques et cardiovasculaires, ou impliquant des anomalies vasculaires associées à la fibrose. Ainsi, le transforming growth factor - β1 (TGF-β1) dans la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI), la thrombospondine-1 (TSP-1) dans l'artériopathie des membres inférieurs (AMI), et le placental growth factor (PlGF) chez les patients atteints de pathologies cardiovasculaires [syndrome coronarien aigu (SCA), ou patients devant subir une chirurgie de la valve ou un pontage coronarien], se sont distingués comme potentiel biomarqueur plasmatique dans ces pathologies, et ont été étudiés dans la biologie des ECFC humaines.Résultats : Le taux plasmatique de TGF-β1 est augmenté chez les patients atteints de FPI par rapport à la population contrôle ; il a un effet pro-angiogène in vivo (vascularisation des implants de Matrigel®) et in vitro (prolifération et migration des ECFC) via les récepteurs ALK-1, ALK-5 et TGF-βRII. Le taux plasmatique de TSP-1 est augmenté chez les patients artéritiques par rapport à la population contrôle. Par ailleurs les néovaisseaux formés de patients artéritiques ayant été traités par injection locale de BM-MNC expriment la TSP-1. Dans les modèles murins de Matrigel®-plugs et d'ischémie du membre inférieur (IMI), la TSP-1 induit une diminution de la vascularisation des implants ainsi qu'une diminution de la revascularisation du membre ischémié. In vitro, la TSP-1 augmente l'adhésion via un mécanisme N-Terminal dépendant, et diminue le potentiel angiogène (prolifération et migration) des ECFC via sa liaison au récepteur CD47, ce qui active la voie de signalisation SDF-1/CXCR4. Le taux plasmatique de PlGF est augmenté chez les patients atteints de SCA par rapport à 2 populations contrôles ; il est également augmenté chez les patients ayant subit une chirurgie cardiaque. Les PlGF-1 et -2 potentialisent la tubulogenèse des ECFC in vitro via la phosphorylation du récepteur VEGFR1. Cet effet est aboli lorsque le VEGFR1 est inhibé par ARN interférence ou par le composé chimique " 4321 ". De plus ce composé " 4321 " inhibe la vascularisation des implants de Matrigel®, ainsi que la revascularisation du membre ischémié dans le modèle d'IMI.Conclusions : Le TGF-β1 joue un rôle dans le remodelage vasculaire de la FPI via les ECFC ; la TSP-1 est un potentiel biomarqueur de l'angiogenèse induite par les ECFC dans l'AMI ; l'inhibition de la voie PlGF/VEGFR1 module la tubulogenèse induite par les ECFC, cellules impliquées dans la formation de nouveaux vaisseaux. Nous avons ainsi mis en évidence 3 protéines modulant l'angiogenèse dans 3 contextes pathologiques différents, caractérisés par un remodelage vasculaire et où les ECFC sont impliquées dans leurs mécanismes physiopathologiques. Ces 3 protéines se présentent donc comme de potentiels biomarqueurs plasmatiques, modulant les propriétés angiogènes des ECFC et pouvant influencer leur efficacité en tant que produit de thérapie cellulaire. Ces protéines jouent un rôle probable dans l'équilibre homéostatique au décours des pathologies concernées.

Les ephrines et leurs récepteurs Eph constituent une famille multigénique de facteurs de guidage cellulaire et axonal. Ces facteurs jouent un rôle-clé dans l’établissement de cartes neurales topographiques, notamment au niveau des connexions thalamocorticales, réseau neuronal majeur du cerveau des mammifères.<p><p>Notre projet visait initialement à étudier l’implication des ephrines corticales dans la génèse des connexions thalamocorticales par une approche de gain de fonction. Pour ce faire, nous avons généré des souris transgéniques présentant une expression ectopique spécifique de l’ephrine-A5 dans le cortex en développement, en utilisant une technique de transgénèse d’addition par chromosome artificiel de bactéries (BAC). <p><p>De façon surprenante, l’analyse de ces souris nous a révélé que les ephrines, à côté de leurs rôles classiques de facteurs de guidage, influençaient la taille du cortex cérébral en régulant l’apoptose des progéniteurs neuronaux. En effet, nous avons pu montrer que l’expression ectopique du ligand ephrine-A5 par les progéniteurs corticaux exprimant son récepteur EphA7 résultait en une déplétion précoce en progéniteurs corticaux par apoptose, et une diminution subséquente de la taille du cortex. Cette vague apoptotique est observée en l’absence de toute altération détectable de la prolifération, la différenciation et la migration neurale dans le cortex.<p><p>Nous avons étayé notre étude in vivo par des expériences in vitro, qui ont montré que l’ephrine-A5 recombinante était capable d’induire rapidement la mort des progéniteurs neuronaux dissociés. Nous avons également montré que cette mort cellulaire impliquait l’activation de la caspase-3, confirmant ainsi l’effet direct des ephrines et de leurs récepteurs sur une ou plusieurs cascades apoptotiques. Par contre, la stimulation des neurones post-mitotiques corticaux par l’ephrine-A5 est accompagnée d’une activation de la caspase-3 sans mort cellulaire apparente. La signalisation ephrine/Eph induirait donc l’activation de la caspase-3 dans différents types cellulaires, sans que celle-ci ne soit systématiquement le reflet d’une mort cellulaire programmée. <p><p>Parallèlement, afin d’évaluer l’importance physiologique de cette voie pro-apoptotique dépendante des ephrines, nous avons étudié des souris présentant une perte de fonction du récepteur EphA7. L’analyse de ces mutants nous a permis de mettre en évidence une diminution de l’apoptose des progéniteurs corticaux, une augmentation de la taille du cortex, ainsi qu’une hypercroissance exencéphalique de tout le cerveau antérieur dans les cas les plus extrêmes. Ces observations indiquent donc que les ephrines sont nécessaires au contrôle de la mort cellulaire programmée des progéniteurs du cortex cérébral. Nous avons également observé le même phénotype exencéphalique dans des mutants déficients en ephrines-A2, -A3 et -A5, dont l’analyse préliminaire suggère également des défauts de processus apoptotiques. <p><p>Nos diverses expériences, combinant une approche par gain et perte de fonction, à la fois in vivo et in vitro, ont ainsi permis de proposer un nouveau rôle des ephrines en marge de leur implication dans la guidance axonale, à savoir un rôle dans le contrôle de la taille cérébrale par induction de l’apoptose des progéniteurs corticaux.<p>La mise en évidence de cette nouvelle voie de signalisation pro-apoptotique pourrait avoir des implications importantes dans d’autres aspects de la biologie du développement et des cellules souches, ainsi que dans l’oncogénèse. <p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les infections et l’activation du système immunitaire stimulent l’hématopoïèse. L’activation des récepteurs Toll-like (TLRs) des cellules souches hématopoïétiques, par leur reconnaissance de motifs moléculaires portés par des agents infectieux, en oriente la différenciation vers les voies myéloïdes, renforçant la capacité de notre organisme à lutter contre les infections. Ici, nous avons étudié si les agonistes TLRs peuvent, au contraire, induire au sein de la moelle osseuse l’émergence de progéniteurs hématopoïétiques présentant des propriétés immunorégulatrices. Nous montrons que l’incubation de moelle osseuse de souris en présence de l’agoniste TRL-9, CpG-B, entraîne l’émergence d’une population de progéniteurs au stade pro-B (appelée CpG-proBs). Le transfert adoptif de seulement 60,000 CpG-proBs par receveur, à l’apparition des premiers signes cliniques, confère une protection à long terme dans deux modèles expérimentaux de maladies auto-immunes, le Diabète de Type I (T1D) et l’Encéphalomyélite Auto-immune Expérimentale (EAE). La migration, la différenciation, et les mécanismes cellulaires et moléculaires de cette population protectrice sont décrits et comparés entre ces deux modèles. Dans les deux modèles, les CpG-proBs migrent vers le tissu cible de la réponse auto-immune et se différencient en cellules B matures régulatrices. Dans le T1D, l’interféron-γ (IFN-γ) produit par les cellules T s’avère essentiel pour induire la surexpression de FasL à la surface des CpG-proBs, entraînant l’apoptose des cellules T effectrices. De plus, l’IFN-γ produit par les CpG-proBs réduit la production par les cellules T de l’IL-21, une cytokine pathogène majeure dans le T1D. La descendance des CpG-proBs est composée de précurseurs transitionnels B, de cellules B de la zone marginale et de cellules B folliculaires, exprimant de forts niveaux de FasL et toujours capables d’induire l’apoptose des cellules T, prolongeant ainsi le contrôle des cellules effectrices T auto-immunes in vivo. Dans l’EAE, l’IFNγ est indirectement responsable de la rétention des cellules T, par l’internalisation de CCR7, au sein des ganglions lymphatiques, inhibant ainsi leur migration au système nerveux central (SNC). Dans la moelle épinière, tissu cible de l’EAE, les CpG-proBs se différencient en cellules B220+CD5+CD1dhiCD11b+, secrétant la cytokine anti-inflammatoire IL-10. Enfin, la mobilisation des progéniteurs hématopoïétiques par un cocktail de facteurs hématopoïétiques confère à une sous-population multipotente au stade MPP2 la propriété d’augmenter l’expansion des Foxp3+ Tregs et de prévenir la survenue du diabète de type 1. Nous montrons que les MPP2 mobilisés s’avèrent également capables d’exercer un effet protecteur envers l’EAE. Leur capacité à induire l’expansion de Treg Foxp3+ au sein du SNC et à la périphérie joue un rôle essentiel dans la protection des souris envers l’EAE, puisque la déplétion des Treg abolit la protection déjà établie. Pour conclure, nous avons mis en évidence que diverses stimulations de l’hématopoïèse induisent l’émergence de nouvelles populations de progéniteurs hématopoïétiques qui présentent des propriétés immunorégulatrices et constituent de nouveaux outils de thérapie cellulaire des maladies auto-immunes. / It is well known today that various infectious events or other stimuli of the immune system can trigger hematopoiesis. The hematopoeitic stem and/or progenitor cells express on their cell surface Toll-like receptors which can recognize molecular motifs of infectious agents. The stimulation of TLRs on hematopoietic stem cells favors their differentiation into myeloid lineages, reinforcing the capacity of our body to fight against the pathogens. Herein, we have investigated whether the stimulation of TLRs can induce, instead, the emergence within the bone marrow of selective progenitor cells with immunoregulatory properties. We show that incubation of bone marrow cells with the TLR-9 ligand CpG-B can induce a pro-B cell population (named CpG-proBs) whose adoptive transfer at low numbers of 60,000 cells provided long-lasting protection in two models of autoimmune diseases, Type I Diabetes (TID) and Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) at the onset of clinical signs. The migration, differentiation and molecular mechanism of action of this protective population is described and compared between these two models. In both models, the CpG-proBs migrate to the target tissue of autoimmune responses and differentiate into more mature regulatory B cells. In TID, IFN-γ produced by both T and CpG-proB cells is essential for the upregulation of FasL at the surface of CpG-proBs, inducing the apoptosis of the effector T cells. In addition, IFN-γ reduced the T-cell production of IL-21, a major pathogenic cytokine in TID. The progeny of the adoptively transferred CpG-proBs, including transitional precursors B cells, marginal zone and follicular B cells, display high expression of FasL, promote apoptosis of effector T cells and prolong the control of autoimmune effector T cells in vivo. In EAE, IFN-γ was responsible for the restriction of T cells to the lymph nodes, inhibiting their homing to the CNS. IFN-γ indirectly induced the internalization of CCR7, a receptor required for the migration across the blood-brain barrier. In the spinal cord (target tissue in EAE), CpG-proBs differentiated into B220+CD5+CD1dhiCD11b+ cells secreting the anti-inflammatory cytokine IL-10. Finally, hematopoietic progenitor populations mobilized to the periphery by a cocktail of G-CSF and Flt3l, at the stage of MPP2, have already been shown to protect against TID by expanding the Foxp3+ Tregs. We evaluated them in the EAE model, showing that the ability of these mobilized progenitor cells to trigger the expansion of Foxp3+ Treg within the CNS and the periphery was necessary for providing protection to EAE mice since Treg depletion abrogated the protection once established. In conclusion, we provide evidence for the emergence of new populations of hematopoietic progenitor cells which can display immunoregulatory properties and might be used for cell therapy of autoimmune diseases.

Rationnel : L’implication établie des progéniteurs endothéliaux circulants dans les phénomènes de néovascularisation chez l’adulte a stimulé la recherche de thérapeutiques angiogènes basées sur la greffe de ces cellules. Deux types cellulaires au phénotype endothélial sont actuellement définis entre autres par leur cinétique d’apparition en culture : les progéniteurs précoces (CFU-EC ou CAC) et tardifs (ECFC). Notre équipe a montré que l’injection thérapeutique de cellules mononucléées de moelle osseuse (BM-MNC) permettait la néovascularisation du site ischémié chez des patients atteints d’artériopathie des membres inférieurs, et que les néovaisseaux formés avaient le phénotype d’ECFC. Nous avons dans un premier temps mesuré les concentrations de différentes protéines modulant l’angiogenèse, chez des patients atteints de pathologies ischémiques et cardiovasculaires, ou impliquant des anomalies vasculaires associées à la fibrose. Ainsi, le transforming growth factor - β1 (TGF-β1) dans la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI), la thrombospondine-1 (TSP-1) dans l’artériopathie des membres inférieurs (AMI), et le placental growth factor (PlGF) chez les patients atteints de pathologies cardiovasculaires [syndrome coronarien aigu (SCA), ou patients devant subir une chirurgie de la valve ou un pontage coronarien], se sont distingués comme potentiel biomarqueur plasmatique dans ces pathologies, et ont été étudiés dans la biologie des ECFC humaines.Résultats : Le taux plasmatique de TGF-β1 est augmenté chez les patients atteints de FPI par rapport à la population contrôle ; il a un effet pro-angiogène in vivo (vascularisation des implants de Matrigel®) et in vitro (prolifération et migration des ECFC) via les récepteurs ALK-1, ALK-5 et TGF-βRII. Le taux plasmatique de TSP-1 est augmenté chez les patients artéritiques par rapport à la population contrôle. Par ailleurs les néovaisseaux formés de patients artéritiques ayant été traités par injection locale de BM-MNC expriment la TSP-1. Dans les modèles murins de Matrigel®-plugs et d’ischémie du membre inférieur (IMI), la TSP-1 induit une diminution de la vascularisation des implants ainsi qu’une diminution de la revascularisation du membre ischémié. In vitro, la TSP-1 augmente l’adhésion via un mécanisme N-Terminal dépendant, et diminue le potentiel angiogène (prolifération et migration) des ECFC via sa liaison au récepteur CD47, ce qui active la voie de signalisation SDF-1/CXCR4. Le taux plasmatique de PlGF est augmenté chez les patients atteints de SCA par rapport à 2 populations contrôles ; il est également augmenté chez les patients ayant subit une chirurgie cardiaque. Les PlGF-1 et -2 potentialisent la tubulogenèse des ECFC in vitro via la phosphorylation du récepteur VEGFR1. Cet effet est aboli lorsque le VEGFR1 est inhibé par ARN interférence ou par le composé chimique « 4321 ». De plus ce composé « 4321 » inhibe la vascularisation des implants de Matrigel®, ainsi que la revascularisation du membre ischémié dans le modèle d’IMI.Conclusions : Le TGF-β1 joue un rôle dans le remodelage vasculaire de la FPI via les ECFC ; la TSP-1 est un potentiel biomarqueur de l’angiogenèse induite par les ECFC dans l’AMI ; l’inhibition de la voie PlGF/VEGFR1 module la tubulogenèse induite par les ECFC, cellules impliquées dans la formation de nouveaux vaisseaux. Nous avons ainsi mis en évidence 3 protéines modulant l’angiogenèse dans 3 contextes pathologiques différents, caractérisés par un remodelage vasculaire et où les ECFC sont impliquées dans leurs mécanismes physiopathologiques. Ces 3 protéines se présentent donc comme de potentiels biomarqueurs plasmatiques, modulant les propriétés angiogènes des ECFC et pouvant influencer leur efficacité en tant que produit de thérapie cellulaire. Ces protéines jouent un rôle probable dans l’équilibre homéostatique au décours des pathologies concernées. / Rationale: The pro-angiogenic capacities of endothelial progenitor cells are now well established, and their involvement in neovascularization events in adults has stimulated the research in the field of angiogenic therapy based on transplant of these cells. Current data converge towards the notion of two cell types with endothelial phenotype, defined at least by their kinetics of appearance in culture: early endothelial progenitor cells (CFU-EC or CAC) and late (ECFC). Our team has shown that the therapeutic injection of bone marrow mononuclear cells (BM-MNC) led to neovascularization of the ischemic site in patients with critical limb ischemia, and that the new vessels formed bore the phenotype of ECFC. We initially measured the concentrations of different proteins modulating angiogenesis in patients with ischemic and cardiovascular diseases, or involving vascular abnormalities associated with fibrosis. Thus, the transforming growth factor - ß1 (TGF-ß1) in idiopathic pulmonary fibrosis, the thrombospondin-1 (TSP-1) in peripheral artery disease, and the placental growth factor (PlGF) in patients with cardiovascular diseases [acute coronary syndrome (ACS), patients undergoing valve surgery or coronary artery bypass surgery], emerged as potential plasmatic biomarkers in these pathological settings, and have been studied in the biology of human ECFC.Results: TGF-ß1 plasma level is increased in patients with idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) compared to the control population; it exerts a pro-angiogenic effect in vivo (vascularization of Matrigel ®-plugs) and in vitro (proliferation and migration of ECFC) via ALK-1, ALK-5 and TGF-ßRII receptors. TSP-1 plasma level is increased in patients with peripheral artery disease (PAD) compared to the control population. In addition, the new vessels formed in PAD patients treated by local injection of BM-MNC express TSP-1. In murine models of Matrigel ®-plugs and hindlimb ischemia, TSP-1 induces a decrease in plugs vascularization and impaired revascularization of ischemic limb. In vitro, TSP-1 increases ECFC adhesion via an N-terminal dependent mechanism and reduces their angiogenic potential (proliferation and migration) via its binding to CD47 receptor, which activates the SDF-1/CXCR4 signaling pathway. PlGF plasma level is increased in ACS patients compared with the control population and stable angina patients and is also increased in patients undergoing cardiac surgery. PlGF-1 and -2 potentiate ECFC tubulogenesis in vitro via phosphorylation of the VEGFR1 receptor. This effect was abolished when the ECFC VEGFR1 is inhibited by RNA interference or by the chemical compound "4321". In addition this compound "4321" inhibits the vascularization of Matrigel ®-plugs, and revascularization of the ischemic limb in the hindlimb ischemia model.Conclusions: TGF-ß1 is involved in the IPF vascular remodeling through ECFC; TSP-1 is a potential biomarker of angiogenesis induced by ECFC in PAD; the inhibition of the PlGF/VEGFR1 pathway modulates ECFC tubulogenesis, cells involved in the formation of new vessels. We thus identified three proteins that modulate angiogenesis in three different pathological settings characterized by a vascular remodeling and where ECFC are involved in their pathophysiology. These three proteins therefore state as potential plasmatic biomarkers, modulating ECFC angiogenic properties and are able to influence their efficacy as a cell therapy product. These plasmatic biomarkers likely play a role in the homeostasis of those pathologies progress.

L’oncogène v-erbA transforme les progéniteurs érythrocytaires primaires aviaires (T2EC) en bloquantleur engagement d’un programme d’auto-renouvellement vers un programme de différenciation. Unecomparaison trancriptomique de T2EC exprimant soit v-erbA, soit une forme non transformante de verbAa été réalisée par SAGE et RT-qPCR. Seuls quelques uns, mais pas tous les messagers codant lesprotéines ribosomiques sont réprimés. Ces résultats suggèrent que v-erbA pourrait moduler lacomposition des ribosomes et/ou moduler les fonctions extra-ribosomiques de protéines ribosomiquesspécifiques. Ainsi, nous avons décidé d’analyser le taux des protéines ribosomiques associées auxribosomes par 2D-DIGE à partir des ribosomes purifiés. L’analyse statistique effectuée sur 4expériences indépendantes avec des marquages inversées a montré de manière significative que letaux de RPL11 est inférieur dans les T2EC exprimant v-erbA comparé à ceux exprimant la forme nontransformante de v-erbA. Ces données indiquent l’existence de ribosomes dépourvus de RPL11 dansles T2EC sous l’effet de v-erbA. Les résultats des expériences d’immunoprécipitation ont conforté cettehypothèse. L’ensemble des résultats obtenus suggèrent l’implication des protéines ribosomiques, etspécialement celle de RPL11, dans les processus de transformation induite par l’oncogène v-erbA, à lafois au niveau de la traduction, et probablement par sa fonction extra-ribosomique. L’analyse de lafonction biologique de RPL11 a montré qu’une sur-expression de RPL11 dans les T2EC retarderait laprolifération cellulaire. / The v-erbA oncogene transforms chicken erythroid progenitors by blocking their differentiation andpreventing them to exit a state of self-renewal. The transcriptome of primary avian erythroidprogenitors cells (T2EC) expressing either v-erbA or a non-transforming form of v-erbA werecompared by SAGE. Only some, but not all, mRNAs encoding ribosomal proteins were shown to beaffected. These results suggest that v-erbA could modulate the composition of ribosomes and/ormodulate the extraribosomal functions of specific ribosomal proteins. We therefore decided to analyzethe level of ribosomal proteins associated to ribosomes by 2D-DIGE performed on purified ribosomes.A statistical analysis performed on 4 independent flip-flop experiments demonstrated that the level ofRPL11 is significantly lower in T2EC expressing v-erbA as compared to the non-transforming form ofv-erbA. These data suggest the presence of ribosomes without RPL11 in T2EC expressing v-ErbA.Results obtained from immunoprecipitation experiments were strengthened this hypothesis. The set ofthese data evoke the involvement of ribosomal proteins, and specially RPL11, in the v-erbAtransformation process both at the translational level and possibly in its extra-ribosomal function.Overexpression of RPL11 in T2EC showed a decrease of cell proliferation.

L’hypoxo-ischémie (HI) cérébrale néonatale représente une des principales causes de mortalité et de morbidité chez les nouveau-nés. Sa physiopathologie implique différents processus délétères menant vers la perte neuronale et responsables de séquelles neuro-cognitives. L'hypothermie thérapeutique est le seul traitement actuel mais est insuffisant. Cette étude a caractérisé et comparé l’effet de deux types de cellules issues du sang de cordon humain, les cellules mononuclées (HUCBCs) et les progéniteurs endothéliaux tardifs (ECFCs) sur l’amélioration des scores neuro-comportementaux mais aussi à l’échelle moléculaire et fonctionnelle dans le modèle d’hypoxo-ischémie néonatale à court (7 jours après l’épisode ischémique) et long terme (12 semaines après l’épisode ischémique).L’injection intrapéritonéale d'ECFCs ou de HUCBCs, 2 jours après HI, améliore les capacités de motricité et de mémorisation précoce et tardive des animaux à l’âge adulte, et diminue les comportements anxieux. Ces résultats sont associés à une augmentation de la densité capillaire en temps précoce et tardif. L’imagerie de perfusion cérébrale SPECT/CT a objectivé une restauration complète de la perfusion cérébrale de l’hémisphère lésé à l’âge adulte par les deux types cellulaires. Ces observations tardives sont associées à un effet protecteur précoce de ces cellules sur l’augmentation de la survie neuronale et la diminution de l’astrogliose réactionnelle ou encore sur la composante inflammatoire par diminution de l’activation microgliale pro-inflammatoire au niveau striatal. Les résultats de cette étude ouvrent ainsi de nouvelles perspectives pour l’usage des ECFCs dans le traitement de l’HI néonatale. / Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (NHIE) is a dramatic perinatal complication, associated with poor neurological prognosis despite neuroprotection by therapeutic hypothermia, in the absence of an available curative therapy. We evaluated and compared ready-to-use human umbilical cord blood cells (HUCBCs) and bankable but allogeneic endothelial progenitors (ECFCs) as cell therapy candidate for NHIE. We compared benefits of HUCBC and ECFC transplantation 48 hours after injury in male rat NHIE model, based on the Rice-Vannucci approach. Based on behavioral tests, immune-histological assessment and metabolic imaging of brain perfusion using SPECT, HUCBC or ECFC administration provided equally early and sustained functional benefits, up to 8 weeks after injury. These results were associated with total normalization of injured hemisphere cerebral blood flow assessed by SPECT/CT imaging. In conclusion, even if ECFCs represent an efficient candidate, HUCBCs’ autologous criteria and easier availability make them the ideal candidate for hypoxic-ischemic cell therapy.

Lors du diagnostic de cancer colorectal, près d’un quart des patients ont des métastases hépatiques dites synchrones. Lorsque la tumeur primitive est asymptomatique, la stratégie chirurgicale (chirurgie première de la tumeur primitive versus chirurgie première des métastases hépatiques) reste débattue. Les recommandations actuelles ne reposent que sur des accords d’experts qui elles-mêmes sont basées sur des études cliniques rétrospectives. L’étude du microenvironnement tumoral a pris ces dernières années une place majeure dans la recherche sur le cancer. Elle a permis de changer de paradigme avec une nouvelle conception du processus métastatique : une tumeur primitive peut agir sur le microenvironnement du futur site métastatique pour créer une "niche pré-métastatique". Cette niche pré-métastatique permettrait secondairement la croissance des cellules tumorales via une angiogénèse tumorale et la formation de métastases. Par une triple approche à la fois fondamentale, translationnelle et clinique, nous avons obtenu des données qui suggèrent qu’une chirurgie première de la tumeur colique ou rectale permet de moduler l’angiogénèse au sein du microenvironnement hépatique. Cette stratégie chirurgicale permettrait également d’améliorer le pronostic oncologique des malades et l’efficacité des anti-angiogéniques. / At the time of the diagnosis of colorectal cancer, nearly 25% of patients have synchronous liver metastases. When this tumor is asymptomatic, the question of surgical strategy (primary tumor first versus liver-first strategy) remains debated. Current recommendations are based on agreements of experts which are by themselves based on retrospective clinical studies. The study of the tumor microenvironment has taken in recent years a major place in the field of cancer research. It leads to new paradigm with a new conception of the metastatic process. It may be possible that the microenvironment of the metastatic sites can be modulated by the primary tumor to promote the formation of the pre-“metastatic niche”. This leads to promote the growth of cancer cells and increase the metastatic potential of primary tumor. By a multidisciplinary research including fundamental, translational and clinical approaches, we have shown that primary tumor first strategy could modulate tumor angiogenesis and liver metastatic process. It is associated with improved survival of patients and efficacy of the anti-angiogenic therapy.

De nos jours, la greffe de cellules souches hématopoïétiques (GCSH) de type allogénique est le traitement standard pour de nombreuses hémopathies malignes, et ce, en dépit des taux élevés de complications liées à la transplantation, telles que les infections, les rechutes et la maladie du greffon contre l’hôte (GVH), associées à cette procédure. Depuis les deux dernières décennies, plusieurs stratégies visant à contrôler la maladie du GVH ont émergé et incluent la déplétion partielle et la manipulation ex vivo des cellules T du greffon. En revanche, ces stratégies peuvent entrainer de sévères déficits immunitaires post-greffe. En comparaison avec les autres sources de cellules souches, une faible incidence de la maladie du GVH et de rechute est observée chez les patients recevant une greffe de sang de cordon ombilical (SC). En contrepartie, ce type de greffe engendre des retards dans la restauration immunitaire, rendant ainsi les patients plus susceptibles aux agents pathogènes. À l’inverse, une augmentation plus importante de la production de cellules T naïves, d’émigrants thymiques récents et de l’abondance des clonotypes des cellules T fut détectée chez les patients ayant reçu une GCSH dérivée du sang d’un seul cordon traité avec UM171, une molécule utilisée pour l'amplification ex vivo des CSHs dérivés de SC, relativement aux patients ayant reçu une GCSH standard. Dans ce mémoire, nous essaierons de comprendre le mécanisme moléculaire sous-jacent à la restauration immunitaire chez les patients transplantés avec un greffon de SC traité avec UM171, nous tenterons de déceler des progéniteurs lymphoïdes au sein des cellules de SC traitées avec UM171 et nous essaierons d’identifier un marqueur de surface qui pourrait être utilisé pour enrichir les progéniteurs lymphoïdes. Nos résultats démontrent la présence de deux "clusters" lymphoïdes, PCL et LMPP, qui expriment potentiellement CD10, et sont plus nombreux dans les échantillons de SC CD34+ traités avec UM171 comparativement aux contrôles. En utilisant les marqueurs de surface CD10 et CD45RA, nous avons pu identifier deux populations CD34+ (CD10medCD45RAmed/lo et CD10hiCD45RAhi) qui sont multipliées dans les cultures traitées avec UM171 relativement aux contrôles. En outre, nous démontrons également que seules les cellules CD45RA- peuvent générer les deux populations CD10+ in vitro, ce qui suggère que les cellules CD10medCD45RAmed/lo définissent une population plus primitive que les cellules CD10hiCD45RAhi. De surcroit, nous proposons que la population CD10medCD45RAmed/lo pourrait contenir des LMPPs qui se différencieront en PCLs inclus dans la population CD10hiCD45RAhi. D'un point de vue fonctionnel, nous observons un développement et une maturation des lymphocytes T nettement plus rapide pour la population CD10+CD34+ relativement à la population CD34+ totale à 3 et 6 semaines, ce qui suggère que CD10 pourrait être utilisé comme marqueur de progéniteurs lymphoïdes. Par ailleurs, nous détectons également un pourcentage plus élevé de cellules ayant un phénotype ILC dans la population CD10+CD34+ comparativement à la population CD34+ totale, ce qui suggère que la population CD10+CD34+ peut potentiellement contenir des progéniteurs lymphoïdes capables de produire différents types de cellules immunitaires. D’autre part, la population CD45RA+ produit plus rapidement des lymphocytes T contrairement à la population CD45RA-. En conséquence, nous proposons que la population CD45RA- contient des cellules primitives (ex. CSH) qui à leur tour génèrent des progéniteurs multipotents contenus dans la population CD10+CD34+ (ex. LMPP) et qui éventuellement produiront des progéniteurs à potentiel plus restreint inclus dans la population CD45RA+ (ex. CLP). En somme, ce mémoire identifie pour la première fois une population CD10+CD34+ présente dans le greffon traité avec UM171 avec un potentiel T et produisant potentiellement des ILCs. L’un des problèmes majeurs liés à la GCSH dérivée du SC est une restauration immunitaire retardée; par conséquent, optimiser l’infusion de cellules CD34- en augmentant le nombre de progéniteurs lymphoïdes pourrait considérablement aider à stimuler la restauration immunitaire chez les patients recevant une GCSH dérivée de SC. / Currently, allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is a standard treatment for many hematological malignancies, although high rates of transplant-related complications such as infections, relapse, and GVHD has constrained the implementation of HSCT. Strategies have emerged to manage GVHD and include partial T-cell depletion and ex vivo manipulation of donor T cells, albeit they have adverse effects on post-transplantation immune recovery and can cause profound immunodeficiency. In comparison to other stem cell sources, a lower incidence of chronic GVHD and relapse is reported in patient receiving cord blood (CB) transplant, although they also display an enhanced susceptibility to pathogens caused by an ineffective T-cell reconstitution. In contrast, we reported a greater increase in naïve T cells production, recent thymic emigrants and T cell clonotype from 3 months to 6 and 12 months in patient transplanted with a single CB graft expanded with UM171, a small molecule used for the ex vivo expansion of CB HSCs, as compared to counterpart patients receiving unmanipulated CB graft. In this master research, we aimed to understand the molecular mechanism underlying T-cell reconstitution in patients transplanted with UM171- expanded CB graft. We tried to identify lymphoid progenitors within the highly heterogeneous CD34+ CB cells treated with UM171 using Cite-Seq, find a surface marker that can be used to enrich for early lymphoid progenitors using flow cytometry, and assess their lineage potential using artificial thymic organoids. Our results highlight the presence of two lymphoid clusters, CLP and LMPP, expressing CD10. The LMPP cluster is about 6 fold expanded in UM171-treated cells as compared to uncultured and DMSO-treated cells. Using the marker CD10 and CD45RA we identify two CD34+ populations (CD10medCD45RAmed/lo and CD10hiCD45RAhi) that are significantly expanded in CD34+ CB cells cultured in the presence of UM171 in contrast to uncultured CD34+ CB cells and DMSO-supplemented cultures. Furthermore, we demonstrate that only the CD45RA-negative cells can give rise to both CD10-positive subsets in vitro, suggesting that CD10medCD45RAmed/lo cells define a subset with a more primitive phenotype than CD10hiCD45RAhi. We propose that the CD10medCD45RAmed/lo subset could contain LMPPs that will commit to CLPs contained within the CD10hiCD45RAhi subset. Functionally, we compared T-cell development and maturation of the CD10+CD34+ subset (including CD10medCD45RAmed/lo and CD10hiCD45RAhi) to the CD45RA+CD34+, CD45RA-CD34+ and total CD34+ subsets and denote a faster T cell development and maturation at 3 and 6 weeks within the CD10-positive subset in contrast to the total CD34+ subset, suggesting that CD10 can be used as a marker of lymphoid precursors in UM171 cultures. We also observe a higher percentage of ILC-like cells within the CD10-positive subset as compared to total CD34+ cells suggesting that the CD10- positive subset potentially contains lymphoid precursors with multilineage capacity. Faster T cell development is observed for the CD45RA+ subset whereas CD45RA- cells display the slowest T cell development, hence we propose that the CD45RA- subset contains primitive cells (e.g. HSC) that segregate into lineage-biased multipotent progenitors enriched in the CD10-positive subset (e.g. LMPP) that will give rise to lineage-restricted precursors that are CD45RA+ (e.g. CLP). In sum, our findings represent the first identification of a CD10-positive population within the UM171- expanded graft that has T potential and could potentially produce ILCs. Delayed immune reconstitution is a major obstacle impeding the implementation of CB HSCT; therefore optimizing infusion of CD3+ donor cells by enriching for lymphoid precursors could help boost T-cell reconstitution following allogeneic HSCT.

L’allogreffe des cellules souches hématopoïétiques (CSH) dans les situations d’incompatibilité HLA partielle représente une option thérapeutique irremplaçable pour des patients nécessitant une greffe de cellules souches hématopoïétiques, en absence d’un donneur HLA-identique. Toutefois, le retard de la restauration du système immunitaire en particulier dans du compartiment lymphocytaire après greffe est l'une des complications majeures. Une nouvelle stratégie pour promouvoir la reprise de la thymopoïèse à partir des CSH provenant du donneur et d'accélérer la reconstitution cellulaire T chez des patients après greffe de CSH consiste en le transfert adoptif des progéniteurs T générés in vitro. L’identification de Notch1 comme le régulateur-clé du développement lymphocytaire T a permis l’établissement de systèmes de culture à base de ligands de Notch, qui permettent la génération efficace de progéniteurs lymphoïdes T in vitro. L'efficacité des progeniteurs T-lymphoïdes murins pour promouvoir la reconstitution des lymphocytes T a été bien démontrée dans des modèles de greffe chez la souris. De même, des progéniteurs T-lymphopoïétiques humains générés in vitro et greffés aux souris humanisées favorisent la reprise de la thymopoïèse. Pourtant, aucune donnée n’a encore démontré leur capacité à donner naissance à un compartiment lymphocytaire T périphérique. De plus, les systèmes de co-culture à base de ligand de Notch actuellement utilisés consistent en des lignées stromales murines génétiquement modifiées. Afin d'établir un système cliniquement applicable, il est donc indispensable d’établir des systèmes de culture qui soutiennent la génération de progéniteurs T en absence d’un support des cellules nourricières. Au cours de mon projet de thèse, j'ai développé un nouveau système de culture pour la génération des progéniteurs T-lymphopoïétiques humains T basé sur l’immobilisation du ligand de Notch Delta-like-4 (DL-4) sous sa forme protéique. La culture des progéniteurs hématopoïétiques CD34+ issue de sang en présence de DL-4 immobilisé permet la génération d’un grand nombre de cellules ayant un phénotype de progéniteurs thymiques précoces (early thymic progenitor: ETP) et de prothymocytes (proT). Les cellules ETP et ProT ainsi générées expriment à des niveaux élevés des gènes impliqués dans le développement lymphocytaire précoce (i.e. pTa, Rag1, IL7Ra et BCL11b). Elles montrent des signes de réarrangement du récepteur des cellules T (TCR) similaires à leurs homologues thymiques. Par des expériences de dilution limite sur une co-culture OP9/DL-1 secondaire, j’ai pu montrer que les progéniteurs générés sur DL-4 possédaient un potentiel lymphoïde T très augmenté, qui pourrait être entièrement attribué aux sous populations ETP et ProT. Suite à leur transfert dans des souris NOD/SCID/γc-/-, les progéniteurs lymphoïde T générés par exposition a DL-4 sont capable de migrer dans le thymus, d’y poursuivre des étapes ultérieures de leur développement et d’accélérer la différentiation T intra thymique ainsi que l’émergence des lymphocytes T mature, polyclonaux et fonctionnels en périphérie. Dans une approche de co-transplantation, qui se rapproche des conditions cliniques envisagées, j’ai simultanément injecté dans le même récipient des progéniteurs générées sur DL-4 et des cellules CD34+ non traitées (d’un 2èm donneur HLA-incompatible). Cette procédure a permis une reconstitution des lymphocytes T encore plus rapide et plus. Etant donné que les progéniteurs T générées sur DL-4 et les cellules CD34+ non-traitées étaient issue de deux donneurs avec un HLA différent, cette expérience a permis de montrer que les progéniteurs préalablement exposés à DL-4 reconstituaient spécifiquement les compartiments lymphoïdes T alors que les autres lignées hématopoïétiques provenaient des progéniteurs CD34+ non-traités... / Human leukocyte antigen (HLA)-mismatched haematopoietic stem cell transplantation (HSCT) represents an important therapeutic option for patients lacking suitable donors. Delayed posttransplant immune recovery constitutes one of its major complications and is most pronounced in the T cellular compartment. A novel strategy to promote de novo thymopoiesis from donor derived HSCs and to accelerate T cellular reconstitution in patients after HSCT consists in the adoptive transfer of in vitro generated T cell progenitor cells. Identification of Notch1 as the key regulator of early T-lineage development has allowed the generation of Notch ligand-based culture systems, which provide a powerful tool to generate T-lymphoid progenitors in vitro. The efficacy of murine T-lymphoid progenitors to promote T cell reconstitution has been well demonstrated in conventional mouse models. In consistency, in vitro-generated human T cell progenitors were demonstrated to promote thymic recovery in humanized mice. Yet, positive effects of in vitro generated human T cell precursors on peripheral T cell reconstitution have not been demonstrated. Moreover currently used Notch-based co-culture systems consist of genetically modified murine cell lines. With view to establishing a clinically applicable system, feeder-cell-free Notch-ligand culture systems for the generation of T-lymphopoietic progenitors are warranted. During my PhD project I developed a new culture system based on the immobilized Notch ligand Delta-like-4 (DL-4). Exposure of human CD34+ cord blood cells to immobilized DL-4 enabled the in vitro generation of high number of T cell progenitors, which harboured the phenotype of immature early thymic progenitor cells (ETP) and prothymocytes (proT). ETP and proT cell generated during DL-4 culture upregulated essential genes involved in early T-lymphoid development (i.e. IL7Rα, PTα, RAG1 and BCL11b) and had undergone stage-specific recombination of the T cell receptor (TCR) locus in a similar way as in native human thymopoiesis. In limiting dilution analysis after secondary OP9/DL-1 co-culture, DL-4 progenitors displayed a highly increased T-lymphoid potential, which could be entirely attributed to the ETP and proT subset. When transferred into NOD/SCID/γc-/- mice, DL-4 primed T cell progenitors migrated to the thymus and accelerated intrathymic T cell differentiation and emergence of functional, mature and polyclonal αβ T cells in the periphery. In a co-transplantation approach, which more closely mimics a clinical setting, DL-4 progenitors and untreated CD34+ cells from HLA-disparate donors were simultaneously injected in the same recipient. This procedure allowed even more rapid and more robust T cell reconstitution. HLA-tracking of the distinct graft sources further showed, that DL-4 progenitors specifically reconstituted the T-lymphoid compartments. This work provides further evidence for the ability of in vitro-generated human T cell progenitors to promote de novo thymopoiesis and shows for the first time, that these cells accelerate peripheral T cell reconstitution in humanized mice. The availability of the efficient feeder-cell-free DL-4 culture technique represents an important step towards the future clinical exploitation translation of in vitro generated T-lymphoid progenitor cells to improve posttransplant immune reconstitution / Die Wiederherstellung der T-lymphozytären Immunität nach T-Zell depletierter hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) ist ein langwieriger Prozess. Eine potentielle Strategie zur Beschleunigung der Neubildung von T-Zellen aus den transplantierten Stammzellen besteht in der Gabe von T-lymphozytären Vorläuferzellen. Die Entdeckung von Notch1 als wichtigster Regulator der frühen T-Zell-Entwicklung hat zur Etablierung Notchligand-basierter Zellkulturen geführt, mit deren Hilfe T-lymphoide Vorläuferzellen aus hämatopoetischen Stammzellen in vitro gebildet werden können. Das therapeutische Potential dieses Zelltyps wurde eindrucksvoll in konventionellen, syngenen und allogenen Maustransplantationsmodellen belegt, in denen nach Injektion in vitro generierter, muriner T-Vorläuferzellen eine Verbesserung der Neubesiedlung des Thymus sowie eine beschleunigte Wiederherstellung der T-zellulären Immunität erreicht werden konnte. Notchbasierte Co-Kultursysteme wurden ebenfalls für die invitro Herstellung humaner T-lymphoider Vorläuferzellen verwendet. Das in-vivo Potential humaner T Vorläuferzellen ist bislang jedoch nur lückenhaft charakterisiert: Zwar konnte gezeigt werden, dass humane T-Vorläuferzellen den hypoplastischen Thymus von immundefizienten NOD/SCID/γc-/- Mäusen besiedeln können. Ihre Wirksamkeit, die Wiederherstellung eines funktionellen, peripheren T-Zellkompartiments zu beschleunigen, gelang bislang jedoch nicht. Darüber hinaus werden Notchliganden in derzeit verwendeten Kultursystemen von genetisch modifizierten, murinen Stromazellen präsentiert. Die Entwicklung stromazellfreier, proteinbasierter Notchligand-Kultursysteme ist daher von grosser Bedeutung für eine mögliche therapeutische Nutzung in vitro generierter T-Vorläuferzellen. Durch Immobilisierung von Notchligand Delta-like 4 (DL-4) habe ich im Rahmen meines PhD Projekts ein stromazellfreies Kultursystem zur Züchtung T-zellulärer Vorläuferzellen aus humanen CD34+ Nabelschnurblutzellen etabliert. In DL-4 Kultur generierte Zellen besitzen phänotypische und molekulare Eigenschaften von frühen thymischen Vorläuferzellen (ETP) und Prothymocyten (proT). ETP und proT Zellen aus DL-4 Kulturen exprimieren wesentliche Geneder frühen T-Zellentstehung (z.B. IL7Ra, PTa, RAG1 und BCL11b). Die entwicklungsstadiumspezifischen TCR-Rekombinationsprozesse in DL-4 Zellen erfolgen nach dem gleichen Muster wie in der nativen Thymusentstehung. Die in DL4 Kultur generierten T-Vorläuferzellen können sich in reife T-Zellen weiterentwickeln und durchlaufen die weitere T-Zelldifferenzierung innerhalb kürzerer Zeit als native CD34+ hämatopoetische Vorläuferzellen. 13 Darüber hinaus können DL-4 generierte T-Vorläuferzellen nach Xenotransplantation den hypoplastischen Thymus von immundefizienten NOD/SCID/γc-/- Mäusen besiedeln, intrathymische T-Zellentwicklung begünstigen und die Neubildung reifer und funktionaler TZellen in der Peripherie beschleunigen. Zur Simulation einer klinischen Anwendung führte ich weiterhin Co-Transplantationen mit DL-4 Vorläuferzellen und unbehandelten CD34+ Zellen in gleiche Empfänger durch und konnte hiermit eine weitere Verbesserung der Immunrekonstitution erzielen. Durch Verwendung HLA-divergenter Spender in diesen Versuchen konnte ich zeigen, dass DL-4 Zellen sich vornehmlich in T-Zellen weiterentwickelten, während die restlichen Blutzellreihen von unbehandelten CD34-poitiven Zellen gebildet wurden. Im Rahmen dieses Projekts konnte ich mit einem für die klinische Anwendung geeigneten Kulturmodell wichtige präklinische Belege für das therapeutische Potential in vitro generierter TVorläuferzellen erbringen. Diese Arbeit bildet somit eine wichtige Grundlage für eine zukünftige klinische Anwendung von T-Vorläuferzellen zur Verbesserung der T-Zell-Immunität nach HSZT