Comme pour tous les autres processus en lien avec l’ADN, la structure de la chromatine lors de la transcription est dans un état de perpétuel changement. Ainsi, elle est ouverte pour permettre l’accès à l’ADN, pour ensuite se replier correctement. La dynamique de la structure chromatinienne est régulée finement par de multiples mécanismes qui agissent ensemble afin de rendre le processus hautement efficace. Ces mécanismes comprennent les modifications post-traductionelles des histones, le remodelage de la chromatine par les remodeleurs ATP-dépendants, l’incorporation des variants d’histones et l’assemblage/désassemblage des nucléosomes par les chaperons d’histones. En plus de ces activités, il y a un certain nombre de composantes non-reliées aux histones qui sont directement impliquées dans les modulations de la conformation de la chromatine associées à la transcription. Chez la levure, un de ces facteurs est la protéine HMG-like Spt2p, démontrée précédemment comme étant directement impliquée dans le réassemblage des nucléosomes dans le sillon de l’ARN polymérase II en déplacement le long du segment d’ADN transcrit. Dans la présente étude, nous démontrons que Spt2p est phosphorylée directement par la caséine kinase II (CKII) et que cette modification inhibe sa liaison à la chromatine. Nos résultats indiquent que la CKII altère l’interaction de Spt2p avec le chaperon d’histone Spt6p. Nous avons aussi trouvé que la phosphorylation directe de Spt6p par la CKII stimule l’association de ce facteur avec un autre partenaire, Iws1p. Cette association est absolument nécessaire pour le repliement correct des nucléosomes durant l’élongation. De plus, cette régulation positive du complexe Spt6p/Iws1p par la CKII module directement l’association de ce complexe avec la méthyltransférase de H3K36, Set2p. Finalement, nous avons montré que la phosphorylation de Spt6p par la CKII est essentielle à l’inhibition des promoteurs cryptiques et des erreurs de transcription. Dans l’ensemble, nos résultats suggèrent un nouveau mécanisme par lequel la CKII contrôle le repliement correct de la structure de la chromatine dans les régions codantes en modulant les interactions du chaperon d’histone essentiel Spt6p avec ses partenaires Spt2p, Iws1p et Set2p. / Like any other DNA-related process, chromatin structure is in a state of constant flux during transcription, unfolded to get access to DNA and refolded back properly. The dynamics of chromatin structure are tightly regulated and multiple mechanisms act together to make the process highly efficient. These include modifications of histones, chromatin remodeling by ATP-dependent remodeling factors, incorporation of histone variants and nucleosome disassembly and reassembly by histone chaperones. In addition to these activities, there are a number of non-histone chromatin components that are directly involved in the modulation of chromatin associated with transcription. In yeast, one of these factors is the HMG-like protein Spt2p previously shown to participate directly in the process of nucleosome reassembly in the wake of RNA polymerase II movement along transcribed DNA. In this work, we show that Spt2p is directly phosphorylated by the casein kinase II (CKII) and we demonstrate that this modification inhibits its association with chromatin. Our findings indicate that CKII disrupts the interaction of Spt2p with the histone chaperone Spt6p. Interestingly, we also found that direct phosphorylation of Spt6p by CKII stimulates the association of this factor with another partner, Iws1p. This association is absolutely required for the refolding of nucleosomes during elongation. Furthermore, this positive regulation of the Spt6p/Iws1p complex by CKII modulates directly the association of this complex with the H3K36 methyltransferase Set2p. Finally, we show that phosphorylation of Spt6p by CKII is essential to the inhibition of cryptic promoters and spurious transcription. Taken together, our results suggest a new mechanism whereby CKII directs chromatin structure refolding in coding regions by modulating the interaction of the essential histone chaperone Spt6p with its partners Spt2p, Iws1p and Set2p.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La protéine L-isoaspartate (D-aspartate) méthyltransférase (PIMT) est une enzyme de réparation qui cible les protéines endommagées par l'accumulation de résidus L-isoaspartates anormaux. Les voies de signalisation qui contrôlent l'expression de la PIMT sont peu connues. D'autre part, la kinase mTOR est une protéine centrale pour les cellules. Elle contrôle la synthèse des protéines, le cycle cellulaire et l'intégration des voies de signalisation régulées par des facteurs de croissance et des nutriments. Or, nous démontrons dans cette étude que l'expression de la PIMT est dépendante de mTOR. En utilisant des analyses par immunobuvardage de type Western et RT-PCR, nous montrons qu'une concentration physiologique (0.02 µM) et élevée (1 µM) de l'inhibiteur spécifique de mTOR, la rapamycine, inhibe (40% et 70%) l'expression de la PIMT sans modulation du niveau d'ARNm. D'un autre côté, l'expression de la PIMT diminue lorsqu'on prive les cellules en glutamine, une condition expérimentale connue pour inhiber mTOR. De plus, nous montrons que l'inhibition de l'expression de la PIMT est dépendante de mTOR mais semble indépendante de la PI3K. Pour cela, nous avons employé des inhibiteurs de la PI3K (Wortmannin, LY294002), un analogue inactif (LY303511) qui n'agit pas sur la PI3K mais qui a été rapporté pour inhiber l'activité de mTOR, et un inhibiteur d'AKT. Enfin, nous avons utilisé un siRNA dirigé contre mTOR et montré que cela entraînait une diminution de 50% de l'expression de mTOR et de la PIMT. Ces résultats suggèrent fortement un mécanisme de régulation de la PIMT par mTOR. Sachant que mTOR est surexprimée dans certains cancers, l'inhibition de l'expression de la PIMT par l'inhibition de mTOR pourrait avoir une implication thérapeutique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Protéine L-isoaspartate (D-aspartate) méthyltransférase (PIMT), Mammalian target of rapamycin (mTOR), Glioblastomes, Inhibiteurs des kinases, Voies de signalisation.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La transcription par l’ARN polymérase II (ARNP II) est un mécanisme promiscuitaire à l’origine d’évènements transcriptionnels hasardeux, qui génèrent continuellement des transcrits aberrants dans la cellule. L’organisation précise du matériel génétique sous forme de chromatine est cruciale pour améliorer la précision de l’ARNP II en orientant sa fonction pour limiter ses erreurs et empêcher cette transcription cryptique. La structure chromatinienne est très dynamique et plusieurs mécanismes moléculaires coopèrent afin de déstabiliser les nucléosomes en amont de l’ARNP II, pour autoriser la lecture de l’ADN, et de les reconstituer dans son sillage, pour maintenir l’organisation chromatinienne du génome. De façon intéressante, une fonction potentielle de la caséine kinase 2 (CK2) dans la dynamique de la chromatine est suggérée dans la littérature. CK2 est une protéine kinase essentielle, conservée chez les eucaryotes, et impliquée dans des processus cellulaires variés. Dans notre étude, nous explorons le rôle de CK2 dans les modulations de la chromatine associées à la transcription. Nous avons démontré que CK2 phosphoryle le chaperon d’histones Spt6, régulant ainsi sa stabilité et sa fonction d’organisateur chromatinien. L’inactivation de cette voie de régulation conduit à l’accumulation considérable de transcrits cryptiques provenant d’initiations opportunistes intragéniques sens et antisens. La phosphorylation de Spt6 par CK2 favorise le recyclage des histones H3/H4 en 3’ des régions codantes et participe ainsi à la conservation de la structure de la chromatine lors de la transcription et à la suppression de la transcription cryptique. Notre étude suggère en outre que les fonctions de CK2 dans la modulation de la chromatine et la précision transcriptionnelle pourraient s’étendre au-delà de la régulation de Spt6, via la modulation de facteurs tels que les complexes PAF ou FACT. Enfin, nous proposons que la suppression de la transcription cryptique par CK2 contribue à optimiser la transcription afin d’améliorer la réponse transcriptionnelle à des stress extérieurs. L’ensemble de notre étude montre que CK2 stimule la précision transcriptionnelle en régulant directement Spt6 et probablement d’autres facteurs impliqués dans le maintien co-transcriptionnel de la chromatine. Ce mécanisme est crucial pour préserver le programme d’expression du génome et favorise la plasticité et l’efficacité de la réponse transcriptionnelle aux signaux de stress, nécessaires à l’adaptation de la cellule à son environnement. / Transcription by RNA polymerase II (RNAPII) is pervasive and aberrant transcripts are permanently generated within cells. Precise and controlled genomic organization in chromatin structure is essential to improve RNAPII accuracy and prevent cryptic transcripts accumulation. Chromatin structure is highly dynamic during transcription, unfolded to give access to DNA and refolded back in the wake of RNAPII to prevent spurious transcription. Multiple mechanisms act together to make this process highly efficient. Casein Kinase 2 (CK2) is a protein kinase ubiquitously present among eukaryotes and implicated in various important cellular processes. Interestingly, a potential function of this kinase in chromatin dynamics through the regulation of chromatin factors has previously been suggested. In this study, we address the role of CK2 in chromatin modulations associated with transcription. We found that CK2 depletion from yeast cells results in an increase of histone turnover in 3’ of transcribed regions and spurious transcription from cryptic promoters. Interestingly, we demonstrate that CK2 modulates directly Spt6 histone chaperone stability and function. This regulation promotes histone recycling during transcription elongation and maintain chromatin organization within coding regions, thereby inhibiting cryptic intragenic and antisense transcription. Our study also suggests that CK2 suppression of spurious transcription extend beyond Spt6 regulation. Indeed, we describe that additional role of CK2 with respect to spurious transcription could be related to its regulation of RNAP II activity through CTD Ser2 phosphorylation. Chromatin regulators such as PAF complex and FACT could also be involved in this regulation process. Finally, we propose that CK2 suppression of spurious transcription is essential for transcriptional optimal and efficient responses to environmental signals. Altogether, our data highlights CK2 signaling pathway as a regulator of transcription accuracy by affecting the essential histone chaperone Spt6, and probably other factors directly involved in the transcriptional process. This mechanism is important to the suppression of cryptic transcription in steady state conditions but also seems to contribute to the fitness of an optimal cellular response to stress signals.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Dans notre laboratoire, des études antérieures ont montré que la stimulation du récepteur AT[indice inférieur 2] par l'angiotensine II menait à l'activation des p42/p44[indice supérieur MAPK] (GENDRON et al., 1999) par une voie impliquant les protéines Rapt et B-Raf chez les cellules NG108-15 (GENDRON et al., 2003a) et que cette voie était nécessaire à l'élongation neuritique. Parallèlement à l'activation de la voie MAPK, il a été montré que le R-AT[indice inférieur 2] active la voie NOS/GCs/GMPc (GENDRON et al., 2002). Puisqu'il est connu que les protéines kinases C (PKC) participent à la différenciation neuronale dans certains types cellulaires, le but de mon travail a été de déterminer si les PKC pouvaient participer aux mécanismes initiaux menant à l'activation des voies précédemment décrites. Nos résultats indiquent que les isoformes [alpha], [epsilon], [iota] et [zéta] sont exprimées dans cette lignée cellulaire et que l'inhibiteur de PKC[alpha], le Gö6976, induit une élongation neuritique importante en plus d'une diminution de la prolifération. Lors de traitements courts avec l'Ang II, nos données indiquent qu'il y a translocation de PKC[alpha] de la membrane plasmique à la fraction soluble, entraînant ainsi son inactivation. De plus, le traitement des cellules avec le Gö6976 provoque l'inhibition de p21[indice supérieur ras] mais active Rap1 de façon similaire à l'Ang II. Par contre, l'inhibition de PKC[alpha] n'a pas d'effet sur la capacité de l'Ang II à activer les p42/p44 MAPK . L'ensemble de ces résultats indique que PKC[alpha] serait en amont de la cascade de signalisation des p42/p44[indice supérieur MAPK]. Ainsi, l'inhibition de PKC[alpha] mène à la diminution de l'activité de p21 ras et de la prolifération cellulaire, ce qui pourrait contribuer à favoriser l'activation de la voie menant à p42/p44[indice supérieur MAPK] et l'élongation neuritique. Les isoformes PKC[epsilon], et PKC[zéta] seraient impliquées dans des processus différents de PKC[alpha] puisque l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques sélectifs, soit le Gö6983 (inhibe PKC[alpha] et PKC[zéta] ou le GF109203X (inhibe PKC[alpha] et PKC[epsilon]), a montré qu'ils induisent l'élongation neuritique de façon similaire à l'Ang II ou l'inhibiteur de PKC[alpha]. En conditions basales, PKC[zéta] est associée à l'actine tandis que l'activation du récepteur AT[indice inférieur 2] cause sa relocalisation dans le cytosol. Il pourrait s'agir d'un mécanisme de régulation de la polymérisation de l'actine. Pour sa part, l'isoforme [epsilon] semble impliquée dans la production de GMPc induite par le R-AT[indice inférieur 2]. De plus, la différenciation des cellules avec un traitement de 3 jours avec l'Ang II augmente l'association de PKC[epsilon] avec les microtubules. Cette isoforme pourrait être utile à la régulation de la ramification neuritique des cellules NG108-15. Ces résultats indiquent que les PKC sont impliquées dans la physiologie des cellules NG108-15, chacune ayant un rôle précis et distinct à jouer.