La résistance à l'insuline associée à l'obésité est une condition qui favorise les troubles métaboliques tels que le diabète de type 2 (T2D) et la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD). Des altérations de l'homéostasie des lipides et du glucose, ainsi qu'une inflammation chronique de bas grade sont les caractéristiques du T2D et de la NAFLD. SHP-1 (codé par le gène *PTPN6*) est une tyrosine phosphatase avec deux domaines SH2 et est connu pour agir comme modulateur du métabolisme du glucose et des lipides. SHP-1 régule également la signalisation des cytokines et l'expression des gènes inflammatoires. En plus d'être localisé dans le cytoplasme, SHP-1 se trouve également dans le noyau des cellules épithéliales. La fonction de ce SHP-1 nucléaire reste inconnue. Ici, nous avons étudié les fonctions dépendantes et indépendantes de la tyrosine phosphatase de SHP-1 dans le contrôle des voies métaboliques. Des découvertes antérieures de notre laboratoire ont établi un lien entre SHP-1 et l'activité du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes γ2 (PPARγ2). PPARγ2 est un facteur de transcription activé par des ligands et contrôle le métabolisme des lipides. Dans le chapitre II, nous avons constaté que SHP-1 interagit avec PPARγ2 principalement via son domaine SH2 en N-terminal et peut déphosphoryler PPARγ2 *in vitro*. Nos données suggèrent que PPARγ2 est phosphorylé sur le résidu tyrosine 78 (Y78) et que la déphosphorylation catalysée par SHP-1 est associée à la stabilité de PPARγ2. L'invalidation génétique de SHP-1 dans des cellules exprimant PPARγ2 augmente l'expression des cibles transcriptionnelles de PPARγ2 telles que *FABP4* et *CD36* en plus d'augmenter l'adipogenèse. Ces effets étaient atténués dans des cellules exprimant une forme mutée de PPARγ2 où la tyrosine 78 avait été remplacée par une phénylalanine ne pouvant être phosphorylée (Y78F). Collectivement, ces résultats indiquent que l'activité phosphatase de SHP-1 contrôle la stabilité de PPARγ2 et donc affecte l'adipogenèse. SHP-1 est un modulateur de la signalisation de l'insuline. L'invalidation génétique de SHP-1 spécifiquement dans les hépatocytes chez la souris (SHP-1 KO) est associée à une glycémie à jeun plus basse que celle de leurs congénères non transgéniques. Les souris SHP-1 KO présentaient également une diminution importante de la production hépatique de glucose, suggérant donc l'existence d'une autre fonction de SHP-1 sur l'homéostasie du glucose, possiblement indépendante de l'insuline. Dans le chapitre III, nous avons découvert que SHP-1 agit comme coactivateur pour contrôler la transcription du gène phosphoénolpyruvate carboxykinase 1 (PCK1) et donc régule la gluconéogenèse. SHP-1 est recruté à la région régulatrice du gène *PCK1*, le cite potentiel où il interagit avec l'ARN polymérase II (RNAPII). Le recrutement de SHP-1 à la chromatine est dépendant du facteur de transcription transducteur de signal et activateur de transcription 5 (STAT5). L'épuisement de STAT5 ainsi que SHP-1 résulte en une diminution du niveau de transcrit de *PCK1* et une réduction de la gluconéogenèse. Ensemble, ces résultats indiquent que nous avons découvert une nouvelle fonction de SHP-1 où la phosphatase agit comme un co-régulateur transcriptionnel clef du gène *PCK1* et exerce un contrôle sur la gluconéogenèse. / Insulin resistance coupled with obesity is a condition that promotes metabolic disorders such as type 2 diabetes (T2D) and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Alterations in lipid and glucose homeostasis, as well as low-grade chronic inflammation are the hallmarks of T2D and NAFLD. SHP-1 (encoded by the gene Protein Tyrosine Phosphatase Non-Receptor Type 6, *PTPN6*) is a tyrosine phosphatase with two SH2 domains and is known to act as a modulator of glucose and lipid metabolism. In addition, SHP-1 also regulates cytokine signaling and inflammatory gene expression. Besides being localized in the cytoplasm, SHP-1 is also found in the nucleus of epithelial cells. The function of this nuclear SHP-1 remains elusive. Here, we investigated tyrosine phosphatase dependent and independent functions of SHP-1 in controlling metabolic pathways. Previous findings from our laboratory established a link between SHP-1 and peroxisome proliferator-activated receptor γ2 (PPARγ2) activity. PPARγ2 is a ligand-activated transcription factor that controls lipid metabolism. In chapter II, we found that SHP-1 interacts with PPARγ2 mainly via its N-terminal SH2 domain and can dephosphorylate PPARγ2 *in vitro*. Our data suggest that PPARγ2 is tyrosine phosphorylated mainly on tyrosine residue 78 (Y78) and SHP-1-mediated dephosphorylation of PPARγ2 is associated with its stability. The knockdown of SHP-1 in PPARγ2 expressing cells resulted in enhanced expression of the classical PPARγ2 targets *FABP4* and *CD36* coupled with increased adipogenesis. These effects were blunted in cells expressing mutant PPARγ2 where tyrosine 78 has been replaced with the non-phosphorylatable phenylalanine (Y78F). Collectively, phosphatase activity of SHP-1 controls the stability of PPARγ2 thereby affecting lipid metabolism. SHP-1 is a modulator of insulin signaling. Hepatocyte-specific SHP-1 KO mice compared to their wild type control littermates exhibited lower fasting glucose and markedly decreased hepatic glucose production suggesting the existence of an additional insulin-independent effect of SHP-1 on glucose homeostasis. In Chapter III, we found that SHP-1 acts as a co-activator for controlling the transcription of the phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (*PCK1*) gene thereby regulating gluconeogenesis. SHP-1 is recruited to the regulatory region of the *PCK1* gene, the potential site where it interacts with RNA polymerase II (RNAPII). The recruitment of SHP-1 to the chromatin was mediated by the transcription factor signal transducer and activator of transcription 5 (STAT5). Depletion of STAT5 as well as SHP-1 resulted in a decrease in *PCK1* transcript levels and blunted gluconeogenesis. Taken together, we discovered a novel function of SHP-1 whereby it acts as a key transcriptional co-regulator of the *PCK1* gene and exerts control over gluconeogenesis. Collectively, findings from these studies provide novel functions of SHP-1 in controlling lipid and glucose metabolism.

Titre de l'écran-titre (visionné le 12 février 2024) / La cellulose d'origine bactérienne est un matériau unique, dont les propriétés la rendent intéressante pour plusieurs domaines. En effet, la finesse de ses fibres, leur degré d'organisation cristalline, ainsi que l'absence de lignine, pectine, et d'hémicellulose en font une substance plus absorbante, résistante et biocompatible que le la cellulose végétale, ce qui la rend plus appropriée pour des applications médicales et optoélectroniques. Cependant, la production de cellulose bactérienne à échelle industrielle rencontre plusieurs obstacles, tels que la perte spontanée de la production de cellulose au cours de la culture des bactéries productrices, ainsi qu'un rendement qui est économiquement non rentable. De plus, les outils de biologie moléculaire adaptés aux souches productrices de cellulose sont limités ce qui restreint les essais de manipulation génétique ayant pour but d'augmenter leurs productivités de cellulose. Dans cette étude, nous démontrons que l'insertion de l'élément transposable IS*1032* dans un site spécifique situé à la base 502 dans le gène *bcsA* chez *Komagataeibacter rhaeticus* iGEM entraîne l'interruption de la production de cellulose dans au moins 12% des mutants cellulose négatif (Celˉ). Une analyse par qPCR a permis d'estimer le nombre de copies de cet élément par cellule à 16 ± 2 copies. Nous proposons une stratégie pour bloquer l'insertion de l'élément transposable IS*1032* en modifiant le site d'insertion de cet élément sur BcsA. Cela était effectué en se basant sur une analyse *in silico* des effets d'une substitution de l'acide aminé présent sur le site d'insertion tout en vérifiant que la structure 3D de la protéine BcsA ne soit pas déformée. Des essais préliminaires suggèrent que l'expression de la protéine modifiée chez un mutant Celˉ pourrait entraîner la réversion à un phénotype Cel⁺ stable. Nous démontrons donc l'efficacité de deux marqueurs de sélection chez *K. rhaeticus*, soit la tétracycline (*tetA*) et la streptomycine (*aadA*). Nous constatons aussi que le glycérol est une source de carbone efficace en milieu minimal pour une surproduction de cellulose chez cette souche bactérienne. / Bacterial cellulose, or BC, is a unique material, whose properties make it interesting for several fields. Indeed, the fineness of its fibers, their degree of organization, as well as the absence of lignin, pectin, and hemicellulose make it a more absorbent, tough and biocompatible substance than plant-based cellulose making it more appropriate for applications in medicine and optoelectronics. However, the industrial production of bacterial cellulose encounters several obstacles, such as the spontaneous loss of cellulose production during cultivation of these bacteria as well as its low yields making the whole production process economically nonviable. In addition, molecular biology tools adapted to cellulose-producing strains are limited, which restricts genetic manipulation trials aiming at increasing their cellulose productivity. In this study, we demonstrate that the insertion of the IS*1032* transposable element into a specific site located at base 502 in the *bcsA* gene in *Komagataeibacter rhaeticus* leads to the interruption of cellulose production in at least 12% of cellulose-negative (Celˉ) mutants. A qPCR analysis allowed us to estimate the number of copies of this element per cell at 16 ± 2 copies. We then propose a strategy to block the insertion of the transposable element IS*1032* by modifying the insertion site of this element on BcsA. This was conducted based on an *in-silico* analysis of the effects of a substitution of the amino acid present in the insertion site while verifying that the 3D structure of the BcsA is not affected. Preliminary experiments suggest that the expression of the mutant BcsA protein in a Celˉ mutant can cause a stable reversion to the Cel⁺ phenotype. We propose new and useful tools for genetic manipulation of *Komagataeibacter rhaeticus*. We also demonstrate the efficiency of two selection markers in *K. rhaeticus*, namely tetracycline (*tetA*) and streptomycin (*aadA*). We report that glycerol is an efficient carbon source to be used in minimal medium for high cellulose production in this bacterial strain.

Plusieurs études ont démontré que le virus d'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) possède la propriété d’incorporer diverses protéines de la cellule-hôte. Certaines observations indiquent que ce processus d'incorporation est sélectif. Cependant, les mécanismes expliquant la sélectivité des protéines incorporées demeurent largement inconnus. Les travaux présentés ciblent l'identification du facteur responsable de l'incorporation sélective de la protéine cellulaire ICAM-1 par le VIH-1. Parallèlement, nous avons évalué la sensibilité des virus porteurs de l’ICAM-1 à l’action de l’inhibiteur de fusion, T-20. Un système de transfection et d'expression transitoire a été utilisé afin de produire des particules virales isogéniques avec ou sans l’ICAM-1, et de certains de ses variants. Ce système nous a permis de démontrer que le VIH-1 s’approprie la molécule d’adhésion ICAM-1 par un processus indépendant de l’enveloppe virale (Env), mais dépendant de la portion intracytoplasmique de l’ICAM-1. Cette incorporation serait dirigée par une interaction directe ou indirecte entre la molécule d’adhésion et le précurseur immature Gag du VIH-1. Par ailleurs, la présence de l’’ICAM 1 sur le VIH-1 augmente la résistance des virions à l’action du T-20 en accélérant la cinétique de fusion du virion. La présence de l’ICAM-1 à la surface des virions et son rôle dans le cycle réplicatif du VIH 1 sont très importants dans la pathogenèse du VIH-1. / INTRODUCTION Previous works have indicated that incorporation of surface glycoprotein into retroviruses such as the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is not a highly specific process since several cellular glycoproteins can be inserted within the mature viral particle. The mechanism(s) that govern the acquisition of such host constituents have remained so far elusive. OBJECTIVES We have examined the molecular basis, associate to ICAM-1 localization and structural viral proteins responsible for the selective incorporation of the adhesion molecule ICAM-1 within HIV-1. We also investigated whether sensitivity to the newly developed fusion inhibitor T-20 is affected by incorporation of the adhesion molecule ICAM-1 in HIV 1. METHODS We have first investigated the role played by the viral envelope (Env) of HIV-1 in the acquisition of host ICAM-1. The incorporation process of ICAM-1 was also investigated by using different ICAM-1 constructs in which both transmembranes and intracytoplasmic tails were modified. These investigations were performed in combination with virus capture and immunoprecipitation studies, Western blot, confocal microscopy analyses, and infectivity assays. We finally used laboratory isolates of HIV-1 (X4- and R5-tropic) either lacking or bearing ICAM-1 as well as clinical variants into infectivity tests to both evaluate their respective IC50 for the fusion inhibitor and to understand the mechanism of resistance bring by the presence of this host molecule. RESULTS Mutation in the matrix (MA) domain or on Env-deficient viruses produced either in immortalized or primary human cell lines does not affect the incorporation of ICAM-1 by HIV-1. However, the incorporation seems to be conducted by the cytosolic tail of ICAM-1. Further experiments suggested that there is an association – direct or indirect – between ICAM-1 and virus-encoded Pr55Gag. We also demonstrate that ICAM-1-bearing virions are more resistant to T-20 than isogenic HIV-1 particles lacking this host adhesion molecule probably based on a reduction of the kinetic window during which the viral envelope is sensitive to T-20. CONCLUSION This study represents the first demonstration that structural Gag polyproteins mediate the uptake of a host-derived cell surface constituent (ICAM-1) by interacting directly with its cytoplasmic domain or by interacting with a partner into the cytosol. This observation describes a new strategy by which HIV-1 can modulate its replicative cycle considering that insertion of ICAM-1 within nascent virions has been shown to affect virus life cycle and also the sensitivity to the newly develop class of inhibitor including T-20.

La protéine PTP-BL possède, entre autres, 5 domaines PDZ dont deux ont été étudiés en détail. Il s'agit des domaines PDZ2 et PDZ3. Les signaux RMN de ces domaines, formant une chaîne de 252 acides aminés et possédant un poids moléculaire de 26,4 kDa, ont été attribués. L'attribution du squelette des deux domaines a été effectuée à 88%. De plus, les caractéristiques de liaison du domaine tandem PDZ2/3 ont été étudiées plus en profondeur. PDZ2 se lie, entre autres, à la protéine APC tandis que PDZ3 se lie à la protéine PRK2. Deux peptides dérivés de ces protéines ont été utilisés afin de titrer le domaine tandem PDZ2/3. Les deux domaines liaient les peptides choisis. Des perturbations ont été observées dans PDZ3 et dans le lieur lors de la titration du domaine tandem PDZ2/3 avec APC et d'autres perturbations ont été observées pour ce qui est de PDZ2 et du lieur lors de la titration avec le peptide dérivé de PRK2. Cela indiquerait une certaine coopérativité entre les deux domaines et le lieur lors de la liaison avec les peptides.

La transcription par l’ARN polymérase II (ARNP II) est un mécanisme promiscuitaire à l’origine d’évènements transcriptionnels hasardeux, qui génèrent continuellement des transcrits aberrants dans la cellule. L’organisation précise du matériel génétique sous forme de chromatine est cruciale pour améliorer la précision de l’ARNP II en orientant sa fonction pour limiter ses erreurs et empêcher cette transcription cryptique. La structure chromatinienne est très dynamique et plusieurs mécanismes moléculaires coopèrent afin de déstabiliser les nucléosomes en amont de l’ARNP II, pour autoriser la lecture de l’ADN, et de les reconstituer dans son sillage, pour maintenir l’organisation chromatinienne du génome. De façon intéressante, une fonction potentielle de la caséine kinase 2 (CK2) dans la dynamique de la chromatine est suggérée dans la littérature. CK2 est une protéine kinase essentielle, conservée chez les eucaryotes, et impliquée dans des processus cellulaires variés. Dans notre étude, nous explorons le rôle de CK2 dans les modulations de la chromatine associées à la transcription. Nous avons démontré que CK2 phosphoryle le chaperon d’histones Spt6, régulant ainsi sa stabilité et sa fonction d’organisateur chromatinien. L’inactivation de cette voie de régulation conduit à l’accumulation considérable de transcrits cryptiques provenant d’initiations opportunistes intragéniques sens et antisens. La phosphorylation de Spt6 par CK2 favorise le recyclage des histones H3/H4 en 3’ des régions codantes et participe ainsi à la conservation de la structure de la chromatine lors de la transcription et à la suppression de la transcription cryptique. Notre étude suggère en outre que les fonctions de CK2 dans la modulation de la chromatine et la précision transcriptionnelle pourraient s’étendre au-delà de la régulation de Spt6, via la modulation de facteurs tels que les complexes PAF ou FACT. Enfin, nous proposons que la suppression de la transcription cryptique par CK2 contribue à optimiser la transcription afin d’améliorer la réponse transcriptionnelle à des stress extérieurs. L’ensemble de notre étude montre que CK2 stimule la précision transcriptionnelle en régulant directement Spt6 et probablement d’autres facteurs impliqués dans le maintien co-transcriptionnel de la chromatine. Ce mécanisme est crucial pour préserver le programme d’expression du génome et favorise la plasticité et l’efficacité de la réponse transcriptionnelle aux signaux de stress, nécessaires à l’adaptation de la cellule à son environnement. / Transcription by RNA polymerase II (RNAPII) is pervasive and aberrant transcripts are permanently generated within cells. Precise and controlled genomic organization in chromatin structure is essential to improve RNAPII accuracy and prevent cryptic transcripts accumulation. Chromatin structure is highly dynamic during transcription, unfolded to give access to DNA and refolded back in the wake of RNAPII to prevent spurious transcription. Multiple mechanisms act together to make this process highly efficient. Casein Kinase 2 (CK2) is a protein kinase ubiquitously present among eukaryotes and implicated in various important cellular processes. Interestingly, a potential function of this kinase in chromatin dynamics through the regulation of chromatin factors has previously been suggested. In this study, we address the role of CK2 in chromatin modulations associated with transcription. We found that CK2 depletion from yeast cells results in an increase of histone turnover in 3’ of transcribed regions and spurious transcription from cryptic promoters. Interestingly, we demonstrate that CK2 modulates directly Spt6 histone chaperone stability and function. This regulation promotes histone recycling during transcription elongation and maintain chromatin organization within coding regions, thereby inhibiting cryptic intragenic and antisense transcription. Our study also suggests that CK2 suppression of spurious transcription extend beyond Spt6 regulation. Indeed, we describe that additional role of CK2 with respect to spurious transcription could be related to its regulation of RNAP II activity through CTD Ser2 phosphorylation. Chromatin regulators such as PAF complex and FACT could also be involved in this regulation process. Finally, we propose that CK2 suppression of spurious transcription is essential for transcriptional optimal and efficient responses to environmental signals. Altogether, our data highlights CK2 signaling pathway as a regulator of transcription accuracy by affecting the essential histone chaperone Spt6, and probably other factors directly involved in the transcriptional process. This mechanism is important to the suppression of cryptic transcription in steady state conditions but also seems to contribute to the fitness of an optimal cellular response to stress signals.

Les bactériophages sont des maîtres manipulateurs, prenant le contrôle complet d'une cellule bactérienne, contournant les systèmes de défense et détournant la machinerie de transcription et de traduction du génome bactérien pour la réplication virale. Les grandes étapes de la multiplication des phages sont connues, pourtant les mécanismes intrinsèques de cette prise de contrôle restent un mystère bien préservé. Malgré la petite taille et la simplicité relative des génomes de phages, seuls les gènes associés à la structure des virions sont amplement caractérisés. Toutefois, les protéines non structurales qui sont susceptibles d'être responsables de la prise de contrôle sont rarement étudiées. C'est effectivement le cas pour le phage modèle 2972, infectant la souche Streptococcus thermophilus DGCC7710 largement utilisée en industrie laitière. Son génome code pour 44 protéines putatives, dont 14 protéines sont classées comme étant non structurales et dont aucune fonction n'est encore associée. Lors de ce projet de maîtrise, le système CRISPR-Cas de type II-A, naturellement présent chez S. thermophilus, a été utilisé à des fins d'édition du génome de ce phage pour étudier le rôle des protéines non structurales. Ce système est idéal pour les manipulations génétiques des phages virulents généralement complexes à modifier. Ainsi, une connaissance approfondie des interactions entre le phage et son hôte sera un outil indispensable pour développer de meilleures méthodes de contrôle des phages en industrie laitière. / Bacterial viruses are master manipulators of bacterial cells. They are able to take complete control of a bacterium, bypassing bacterial immune systems, hijacking core transcription and translation machinery, and typically resulting in lysis of the host. Although the major steps of phage replication are well understood, very little is known about the mechanisms of the host-cell takeover. Despite phages having relatively small and 'simple' genomes, generally only the structural proteins have been well characterized. In contrast, non-structural proteins, which include those involved in host cell takeover, tend to be completely uncharacterized. This is certainly the case for the model of Streptococcus thermophilus phages, 2972, which infects the strain DGCC7710 widely used by the dairy industry. Its genome encodes for 44 putative proteins, 14 of which are non-structural and have no known function. In this master thesis, the type II-A CRISPR-Cas system naturally present in S. thermophilus was used for genome engineering purposes to investigate the role of non-structural proteins of phage 2972. This natural bacterial immune system provides an ideal means for genetic manipulation of virulent phages, which are otherwise intractable. This could lead to potentially valuable discoveries allowing us to further fine-tune the bacteria used in various biological processes.

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie génétique récessive caractérisée par des anomalies congénitales, une défaillance progressive de la moelle osseuse, une hypersensibilité aux pontages inter-brins de l’ADN (ICLs) et une susceptibilité à développer le cancer. La voie AF implique au minimum 20 gènes FANC (FANCA-FANCU) et les protéines encodées par ces gènes interagissent également dans une voie cellulaire connue permettant la résistance des cellules aux ICLs de l’ADN. Les agents pontants qui génèrent les ICLs lient de manière covalente les deux brins de l’ADN, créant de ce fait une obstruction physique aux processus cellulaires qui nécessitent le déroulement des deux brins d’ADN tels que la réplication de l’ADN et la transcription. La monoubiquitination de FANCI et FANCD2 par la E3 ubiquitine ligase FANCL est l’évènement culminant de l’activation de la voie AF. Ce processus est dépendant des protéines FANC ayant un rôle en amont de cette étape. Le complexe moléculaire formé par FANCI et FANCD2 coordonne plusieurs événements de la voie AF à la suite de sa monoubiquitination. Tout au long de mon travail de doctorat, nous avons étudié différents aspects de la voie de l’anémie de Fanconi. Nous avons montré deux importants domaines de liaison à l’ADN dans FANCD2 dans lesquels se trouvent six acides aminés polaires, principalement des résidus lysines, très conservés à travers l’évolution. Ces domaines contribuent de manière importante à la liaison à l’ADN dépendante des charges spécifiques. Un de ces domaines de liaison à l’ADN s’avère être également une séquence de localisation nucléaire (NLS) dont la mutation empêche la localisation nucléaire de FANCD2. Les mutants cytoplasmiques de FANCD2 ont aboli leur monoubiquitination et furent incapables de promouvoir la monoubiquitination de FANCI, de même que l’association à la chromatine. Lorsque les défauts de transport nucléaire sont complémentés par un NLS hétérologue, il en résulte une réduction de la monoubiquitination de FANCD2. Ainsi, nos résultats suggèrent que le domaine de liaison à l’ADN et le NLS identifiés dans cette étude soient des régions cruciales de FANCD2. Les cassures double-brins de l’ADN (CDB) sont un autre aspect de la voie de AF qui a fait l’objet de nos études. Les CDB sont des structures intermédiaires formées au moment du décrochage (« unhooking ») du pont inter-brin lors du processus de résolution des ICLs. Nous avons attribué de nouvelles fonctions pour la protéine FANCG dans l’inhibition de la résection des extrémités d’ADN générées par la CDB, affectant ainsi le choix de la voie de réparation de l’ADN. Cette fonction de FANCG est indépendante des autres protéines FANC ayant un rôle en amont, à l’exception de la protéine FANCA. Nous avons également mis en lumière de nouvelles fonctions pour les protéines AF/cancer du sein BRCA2 et PALB2 aux fourches de réplication bloquées. Puis, nous avons également montré qu’un rôle pour ces protéines consiste en la stimulation de la polymérase eta (Polη) afin d’initier la synthèse de l’ADN. En effet, BRCA2 et PALB2 interagissent avec Polη et sont requises pour le recrutement de cette polymérase aux fourches de réplication bloquées. De plus, elles stimulent la synthèse d’ADN dans la D-Loop via la stimulation de la Polη, un élément essentiel à ce processus. Nous concluons donc que PALB2 et BRCA2, en plus de leurs fonctions dans la stimulation de la formation de la D-Loop par RAD51, jouent un rôle crucial dans la synthèse d’ADN associée à la recombinaison via la réparation de l’ADN régulée par la Polη. / Fanconi anemia (FA) is a recessive genetic disorder characterized by congenital abnormalities, progressive bone marrow failure, DNA interstrand cross-links (ICLs) hypersensitivity, and cancer susceptibility. The FA pathway consists of at least 20 FANC genes (FANCA-FANCU), and the encoded protein products interact in a common cellular pathway to gain resistance against DNA ICLs. The ICL-producing agents covalently cross-link two DNA strands and thus, are obstructions to processes which requires unwinding of the two DNA strands such as DNA replication, and transcription. FA pathway activation culminates in the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI proteins by E3 ubiquitin ligase FANCL, a process dependent on other upstream FA proteins. The molecular complex formed by FANCI and FANCD2 coordinates multiple events in the FA pathway upon its monoubiquitination. Throughout my doctoral work, we studied various aspects of the FA pathway. We have demonstrated two major DNA binding motifs (DBMs) in FANCD2, comprising of six evolutionally conserved polar amino acids predominantly consisting of lysine, which contributed to the specific charge dependent DNA binding. One of the DBM also consisted of a nuclear localization sequence (NLS), disruption of which abrogated the nuclear localization of FANCD2. The cytoplasmic mutants of FANCD2 had abolished monoubiquitination and were unable to promote FANCI monoubiquitination and chromatin association. Complementation of the nuclear transport defect by a heterologous NLS resulted in the reduction of FANCD2 monoubiquitination. Our results suggest that the DNA binding and NLS identified in this study are crucial regions of FANCD2. DNA double-strand breaks (DSB) are produced as one of the structural intermediates upon ICL unhooking step. We assigned novel functions to the FA protein FANCG in limiting the DNA end-resection, and thus it affects the repair pathway choice. This function of FANCG is independent of other upstream FA proteins except FANCA. We also reveal new functions for FA/breast cancer proteins BRCA2 and PALB2 at blocked replication forks and show a role for these proteins in stimulating polymerase eta (Polη) to initiate DNA synthesis. PALB2 and BRCA2 interact with Polη, and are required to sustain the recruitment of Polη at blocked replication forks. PALB2 and BRCA2 stimulate Polη-dependent DNA synthesis on Displacement loop (D-loop) substrates. We conclude that PALB2 and BRCA2, in addition to their functions in stimulating D-loop formation by RAD51, play crucial roles in the initiation of recombination-associated DNA synthesis by Polη-mediated DNA repair.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2015-2016 / L’unité neurovasculaire (NVU) est centrale dans l’élimination de la β-amyloïde dont l’accumulation promeut le développement de la maladie d’Alzheimer (AD). Suivant une perturbation vasculaire, le bris ou l’altération de la barrière hématoencéphalique induit le remodelage de la NVU. Par exemple, les cellules endothéliales sécrètent l’activateur tissulaire du plasminogène (t-PA), ce qui module les cellules composant la NVU. C’est pourquoi, nous nous sommes intéressés à ce remodelage dans la AD en étudiant l’effet de l’hypoperfusion cérébrale chronique sévère (SCCH) et de l’administration du t-PA. Suite à la SCCH, les souris développant la AD, APPswe/PS1, démontrent un déclin cognitif plus important causé par un dysfonctionnement des microglies. En contre partie, nous avons observé une amélioration des fonctions cognitives des APPswe/PS1 suite à l’injection systémique du t-PA qui induit l’activation des microglies via la protéine apparentée au récepteur des protéines de faibles densité, LRP1, et promeut l’élimination de l’Aβ. Ainsi, nos résultats démontrent que le remodelage de la NVU peut aggraver la pathogenèse, mais également fournir des pistes de traitement. / Brain remodeling by the neurovascular unit (NVU) has gain interest in disease such as Alzheimer’s disease (AD). Following vascular perturbation, NVU go through remodeling due to disruption or alteration of brain-blood barrier. One of the molecule inducing remodeling is the tissue-plasminogen activator (t-PA) released by endothelial cells. In fact, t-PA can act both as an enzyme and a cytokine. Thus, we studied the effect of vascular perturbation and t-PA system in AD. By developing a new model of a severe chronic cerebral hypoperfusion (SCCH), we demonstrate that SCCH aggravates memory loss in AD mice, APPswe/PS1, due to microglia dysfunction. Indeed, low glucose environment lowers microglia’s activity and phagocytosis capacity. On the other hand, systemic administration of t-PA improves cognition as well as decreases amyloid burden in APPswe/PS1. Acting as a cytokine, rt-PA binds LRP1 which induces microglia’s activation and promotes amyloid elimination. These data suggest that NVU remodeling occurring in AD may participate in the disease pathogenesis and provide new insight of treatment, such as rt-PA.

Titre de l'écran-titre (visionné le 29 juin 2023) / Les techniques d'édition du génome telles que CRISPR-Cas9, permettant l'introduction ciblée de modifications génétiques, offrent de nombreuses possibilités de développement d'outils de recherche ainsi que d'applications thérapeutiques. Dans le cadre de mes travaux effectués en co-direction à Héma-Québec, je me suis intéressée au potentiel de CRISPR-Cas9 en lien avec le système hématopoïétique et plus particulièrement en lien avec les globules rouges. Premièrement, j'ai exploré dans le chapitre 1 la modification spécifique de groupe sanguins qui est d'intérêt pour augmenter les possibilités transfusionnelles. Des globules rouges (GRs) de groupe sanguin rare Rhnull ont été créés en supprimant le gène RHAG des cellules souches hématopoïétiques (CSH) avec CRISPR-Cas9, suivi d'une différentiation érythrocytaire in vitro. Ce groupe sanguin pourrait théoriquement être utilisé pour transfuser des individus ayant n'importe quel variant Rh, en plus d'être utile en tant que réactif de sérologie. Le gène ABO a aussi été supprimé des CSH de groupe A, pour produire des GRs de groupe O. L'absence d'expression résiduelle des antigènes de type A obtenue à partir des CSH hétérozygotes A/O pourrait permettre de futures applications transfusionnelles comme des cas de donneur/receveur compatibles pour des phénotypes rares mais incompatibles pour le système ABO. Ensuite, un aspect prometteur du système CRISPR-Cas9 étant la correction thérapeutique de maladies génétiques, les greffes autologues de CSH génétiquement modifiées par cette technologie font l'objet de plus en plus d'études cliniques. Dans ce contexte, j'ai travaillé sur la modélisation in vitro de variants génétiques avec comme preuve de concept l'anémie falciforme puisque cela pourrait contribuer à l'étude des répercussions potentielles de l'édition du génome sur les CSH et les GRs, et complémenter les études cliniques. Une récapitulation complète de l'érythropoïèse in vitro jusqu'à la production de GRs matures a été considérée pertinente pour une caractérisation plus fidèle à la réalité de phénotypes érythrocytaires, pour étudier l'impact de divers variants sur les GRs, en plus d'être avantageuse dans l'optique de futures transfusions. La production de GRs in vitro est un objectif important en médecine transfusionnelle depuis plusieurs années et il est possible de reproduire l'érythropoïèse in vitro à partir de plusieurs sources cellulaires, dont les CSH. Cependant, les protocoles publiés à ce jour mettent peu l'accent sur l'étape de maturation finale des réticulocytes en GRs matures, analogues à ceux retrouvés en circulation, ou requièrent l'utilisation de cellules accessoires ou nourricières. Or, l'utilisation de cellules accessoires ou nourricières pourrait restreindre de potentielles applications pertinentes du modèle comme les transfusions et l'édition génétique ex vivo. Dans un premier temps, j'ai développé dans le chapitre 2 un protocole de culture cellulaire permettant une maturation accrue des réticulocytes en GRs in vitro ainsi qu'une maximisation de leur survie en culture durant cette étape, dans un milieu ne contenant aucun composé animal, cellules accessoires ou cellules nourricières. Les GRs obtenus ont un phénotype similaire à celui des GRs produits par le corps humain et ils peuvent être conservés en solution nutritive pendant 42 jours comme pour les GRs récoltés de dons de sang. Dans un second temps, j'ai optimisé dans le chapitre 3 un protocole d'édition avec CRISPR-Cas9 compatible avec la clinique, sans vecteur viral et sans sélection, dans le but d'être combiné à la production de GRs. L'introduction à une fréquence élevée de la mutation causant l'anémie falciforme, notamment de manière bi-allélique, dans des CSH suivie de la différenciation complète en GRs a permis de générer des GRs adoptant la forme caractéristique en faucille après exposition à des niveaux d'oxygène physiologiques, récapitulant ainsi l'anémie falciforme in vitro. De plus, un sous-produit d'édition produisant un variant de globine beta qui semble exprimé à des niveaux significatifs dans les GRs est présent à la suite du ciblage de la mutation dans le gène de la globine beta. La présence de ce variant mérite attention dans l'optique du développement thérapeutique pour l'anémie falciforme. En conclusion, les procédures optimisées de culture de GRs et de modifications génétiques avec CRISPR-Cas9 présentées dans cette thèse peuvent être combinées de différentes façons afin de fournir une plateforme d'étude de variants érythrocytaires in vitro, en plus de contribuer aux efforts vers la transfusion de GRs produits in vitro et d'accompagner les thérapies d'édition génétique arrivant en clinique. / Genome editing techniques, such as CRISPR-Cas9, allowing the introduction of targeted genetic modifications, offer numerous research tool possibilities and potential cellular therapies. As part of my work done in co-direction at Héma-Québec, I became interested in the potential of CRISPR-Cas9 in relation to the hematopoietic system and more particularly in relation to red blood cells. First, I explored in chapter 1 specific blood type modifications that are of interest in increasing transfusion opportunities. Rhnull cultured red blood cells (cRBCs) were produced by deleting RHAG gene in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with CRISPR-Cas9, followed by in vitro erythroid differentiation. These red blood cells (RBCs) could theoretically be used to transfuse all Rh types, in addition to their relevance as RBC reagents for serology laboratories. ABO gene was also deleted in type A HSPCs to produce type O RBCs. The absence of residual A antigen expression when starting with heterozygotes A/O donors could allow future transfusion applications like cases of individuals compatible for rare phenotypes but frustratingly not for ABO. Then, a promising aspect of the CRISPR-Cas9 system being the therapeutic correction of genetic diseases, autologous hematopoietic stem cell (HSC) transplants genetically modified by this technology are the subject of more and more clinical studies. In this context, I worked on the in vitro modeling of genetic variants with sickle cell anemia (SCA) as proof of concept since it could contribute to the efforts aiming at studying and understanding potential side effects of genome editing on HSCs and RBCs, and complement clinical studies. The complete recapitulation of erythropoiesis in vitro, including terminal RBC maturation, was considered essential for the faithful characterization of erythroid phenotypes, for studying the impact of genetic variants on RBCs, in addition to being beneficial for future transfusion purposes. Production of cRBCs has been a major objective in the field of transfusion medicine for several years and erythropoiesis can be reproduced in vitro starting with several cell sources, one of which being HSPCs. However, current protocols do not focus on the process of reticulocyte maturation into RBCs, analogous to those found in the circulation, or they require accessory or feeder cells. Of note, accessory or feeder cells could restrict potentially relevant applications of the model like transfusions or ex vivo genome editing. First, I developed in chapter 2 a cell culture protocol allowing an increased maturation of reticulocytes into RBCs in vitro as well as a maximization of their survival in culture, using an animal component-free, accessory-free, and feeder-free medium. The resulting cRBCs had a similar phenotype as native RBCs and they could be stored for 42 days like RBCs collected from blood donations. Second, I optimized a virus-free and selection-free CRISPR-Cas9 strategy compatible with the clinic to use it in combination with cRBCs production. High efficiency introduction of the SCA-causing mutation, notably bi-allelic introduction, followed by mature cRBCs production yielded cells acquiring the characteristic sickled shape after exposition to physiological oxygen levels, thereby recapitulating SCA in vitro. Furthermore, an editing by-product giving rise to a beta globin variant seemingly expressed at significant levels in RBCs was present following the targeting of the mutation in the beta globin gene. The presence of this beta globin variant thus deserves further attention in the context of therapeutic development for SCA. To conclude, optimized procedures of RBCs' culture and CRISPR-Cas9-mediated genome editing presented in this thesis can be combined in several ways to provide a platform for the study of erythroid variants in vitro, in addition to contributing to the efforts towards future cRBCs transfusion and accompanying the coming gene editing therapies.

Le virus de l'hépatite C (VHC) infecte plus de 170 millions de personnes dans le monde. À l'heure actuelle, les thérapies utilisées contre ce virus sont insatisfaisantes. La protéine de la capside (C) du VHC est impliquée dans l'assemblage viral et l'encapsidation du génome. Les domaines chargés positivement de la moitié NH2-terminale de la protéine C (C 1-82) sont suspectés être responsables de l'interaction avec l'ARN viral génomique. Dans cette étude, différents mutants (ponctuels et de délétion) de la C 1-82 ont été générés et exprimés dans E. coli afin d'identifier une (des) région(s) de la protéine essentielle(s) pour l'assemblage viral. Or, tous les mutants produits dans cette étude ne sont affectés ni dans la reconnaissance de l'ARN ni dans la formation de pseudo-nucléocapsides virales (PNV). Ces résultats suggèrent que c'est la charge globale de la protéine qui est importante pour l'interaction avec l'ARN et non une région précise dans la portion NH2-terminale.