Avec leurs caractéristiques d'auto-renouvellement illimité et de pluripotence, les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) représentent une source infinie de cellules pour la thérapie cellulaire de maladies, telle que la dystrophie musculaire de Duchenne. Des études ont démontré que les hESC pouvaient être différenciées en cellules musculaires squelettiques, mais les techniques employées sont longues et inefficaces. Ce mémoire décrit un nouveau protocole de différenciation des hESC en cellules musculaires squelettiques à l'aide d'un adénovirus exprimant le gène MyoD sous le contrôle du promoteur CAO (Ad.CAO-MyoD). L'efficacité de ce virus pour induire la myogenèse des hESC a été mise en évidence par la présence de divers marqueurs myogéniques. Ensuite, le potentiel de fusion de ces cellules a été illustré par le marquage de la MyHC et par l'observation de quelques myotubes. Ces résultats préliminaires semblent indiquer que l'Ad.CAO-MyoD est un outil prometteur pour différencier les hESC en cellules musculaires squelettiques.

Le large éventail d'applications du système CRISPR-Cas a conduit à des innovations biotechnologiques qui sont sur le point de transformer l'industrie pharmaceutique actuelle. Néanmoins, l'atteinte d'un haut niveau d'efficacité à un gène cible reste encore aujourd'hui un défi pour l'édition du génome. Ceci est dû principalement à la capacité encore limitée de modifier tous les sites du génome humain, tout comme le faible taux de recombinaison homologue obtenu chez les cellules de mammifères. Ainsi, l'optimisation des processus de modification génique s'avère indispensable pour favoriser les diverses utilisations de l'édition du génome. Dans cette thèse, il a été question de (i) développer une méthode d'enrichissement de cellules génétiquement modifiées et (ii) augmenter la polyvalence de l'édition du génome en augmentant la plage de ciblage du système CRISPR-Cas9 dans le génome humain. L'objectif de la première partie de cette thèse visait à étudier la fonctionnalité du gène ATP1A1, codant pour la pompe sodium/potassium (Na⁺/K⁺ ATPase), comme marqueur endogène de l'édition du génome. Dans ce sens, nous avons modifié la sensibilité de cette pompe pour l'ouabaïne en insérant des mutations dominantes dans le locus ATP1A1, ce qui a permis de générer des cellules résistantes à l'ouabaïne. La capacité de multiplexage du système CRISPR-Cas permet de co-cibler simultanément ATP1A1 et le locus d'intérêt, où il est possible d'enrichir des évènements de réparation par NHEJ ou par RH dans les deux locus à la suite de l'ajout d'ouabaïne. Ainsi, nous avons démontré que cette approche peut être appliquée non seulement aux lignées cellulaires, mais aussi aux cellules primaires ce qui permet d'envisager une possible utilisation pour le développement thérapeutique ex vivo. Dans le deuxième objectif de cette thèse, il était question d'optimiser le système CRISPR1-Cas9 de Streptococcus thermophilus dans le but d'élargir le répertoire de nucléases pour l'édition du génome. Dans ce sens, nous avons optimisé l'expression de l'ARN guide et nous avons caractérisé diverses variantes de St1Cas9 permettant de cibler des régions riches en A/T. Autant sous forme de nucléase que d'éditeur de base, l'application de nos variantes de St1Cas9 in vitro a permis d'obtenir des hauts taux d'édition du génome humain. Ainsi, la taille de St1Cas9 est idéale pour sa vectorisation avec son ARN guide dans un seul vecteur adéno-associés (AAV). Dans ce sens, nous avons démontré que l'administration du vecteur AAV-St1Cas9 permet de sauver la létalité et les anomalies métaboliques dans un modèle murin de tyrosinémie héréditaire de type I. En tout, ces travaux illustrent des outils permettant d'augmenter le rendement d'édition et l'ouverture de nouvelles régions géniques pouvant être ciblées à l'intérieur du génome humain à l'aide du système CRISPR-Cas9. Ainsi, nous avons démontré la fonctionnalité des outils développés au cours de ce projet de thèse pour diverses applications ex vivo et in vivo, permettant ainsi d'élargir le potentiel thérapeutique de l'édition du génome.

La maladie d'Alzheimer (MA) est caractérisée par la présence de plaques amyloïdes. Le peptide amyloïde provient d'un clivage séquentiel du peptide précurseur amyloïde par l'activité de la β-sécrétase (BACE) et l'activité y-sécrétase des présénilines (PSI et PS2). L'activité présénilinase consiste à couper PSI pour former un complexe y-sécrétase fonctionnelle. Il a été démontré que BACE interagit directement avec PSI mais le rôle de cette interaction demeure inconnu. Pour explorer les voies de signalisation de ces deux protéines, nous avons utilisé le système double-hybride en levure en utilisant BACE comme appât. Le résultat de ce criblage a permis d'identifier un interacteur protéique potentiel de BACE: l'ubiquiline 1 (UBQLN1). L'UBQLN1 est impliquée dans la dégradation protéique et son variant (UBQLN1delta8) a été associé à la MA. Nous avons observé une interaction entre BACE et UBQLN1. Cette interaction est perdue quand BACE est exprimée avec le variant UBQLN1delta8. La surexpression de l'UBQLNl entraîne la réduction de l'activité de BACE ainsi qu'une réduction de sa demi-vie contrairement à l'expression d'UBQLN1delta8. L'UBQLN1delta8 s'avère à augmenter la production du peptide amyloïde. Par ailleurs, l'expression de dominant négatif de BACE affecte la maturation de PSI en augmentant le niveau de PSI FL. Un inhibiteur de BACE, le Z-VLL s'avère à ne pas inhiber l'activité de BACE. Par contre, il accumule PSI FL et inhibe l'activité de PSI. Nous suggérons que UBQLN1delta8 entraîne le développement de la MA via une dérégulation au niveau du mécanisme de dégradation de BACE augmentant ainsi son activité et la production du peptide amyloïde. Avec le Z-VLL, nous avons inhibé l'activité présénilinase entraînant une inhibition de l'activité γ-sécrétase. Les mutations dans PSI affectent également la signalisation de la β-caténine, une protéine similaire à une plakophiline neuronale (NPRAP). NPRAP est spécifique au cerveau et interagit avec PSI. Le rôle de cette interaction est inconnu. Le criblage en levure en utilisant NPRAP comme appât, nous a permis d'identifier certaines protéines comme la karyophérine-α2 (KPN2A). Pour découvrir les fonctions de NPRAP, nous avons effectué un ± microarray ¿. II en résulte que NPRAP fait varier l'expression de plusieurs gènes dont le gène codant pour la butyrylcholinestérase. La capacité de NPRAP de migrer au noyau et d'activer certains gènes est bien établi mais il est impossible pour le moment de la rallier à la MA.

Les bactériophages sont des maîtres manipulateurs, prenant le contrôle complet d'une cellule bactérienne, contournant les systèmes de défense et détournant la machinerie de transcription et de traduction du génome bactérien pour la réplication virale. Les grandes étapes de la multiplication des phages sont connues, pourtant les mécanismes intrinsèques de cette prise de contrôle restent un mystère bien préservé. Malgré la petite taille et la simplicité relative des génomes de phages, seuls les gènes associés à la structure des virions sont amplement caractérisés. Toutefois, les protéines non structurales qui sont susceptibles d'être responsables de la prise de contrôle sont rarement étudiées. C'est effectivement le cas pour le phage modèle 2972, infectant la souche Streptococcus thermophilus DGCC7710 largement utilisée en industrie laitière. Son génome code pour 44 protéines putatives, dont 14 protéines sont classées comme étant non structurales et dont aucune fonction n'est encore associée. Lors de ce projet de maîtrise, le système CRISPR-Cas de type II-A, naturellement présent chez S. thermophilus, a été utilisé à des fins d'édition du génome de ce phage pour étudier le rôle des protéines non structurales. Ce système est idéal pour les manipulations génétiques des phages virulents généralement complexes à modifier. Ainsi, une connaissance approfondie des interactions entre le phage et son hôte sera un outil indispensable pour développer de meilleures méthodes de contrôle des phages en industrie laitière. / Bacterial viruses are master manipulators of bacterial cells. They are able to take complete control of a bacterium, bypassing bacterial immune systems, hijacking core transcription and translation machinery, and typically resulting in lysis of the host. Although the major steps of phage replication are well understood, very little is known about the mechanisms of the host-cell takeover. Despite phages having relatively small and 'simple' genomes, generally only the structural proteins have been well characterized. In contrast, non-structural proteins, which include those involved in host cell takeover, tend to be completely uncharacterized. This is certainly the case for the model of Streptococcus thermophilus phages, 2972, which infects the strain DGCC7710 widely used by the dairy industry. Its genome encodes for 44 putative proteins, 14 of which are non-structural and have no known function. In this master thesis, the type II-A CRISPR-Cas system naturally present in S. thermophilus was used for genome engineering purposes to investigate the role of non-structural proteins of phage 2972. This natural bacterial immune system provides an ideal means for genetic manipulation of virulent phages, which are otherwise intractable. This could lead to potentially valuable discoveries allowing us to further fine-tune the bacteria used in various biological processes.

Les polymorphonucléaires neutrophiles sont les principales cellules effectrices du système immunitaire inné. Les cristaux d'urate monosodique sont l'agent étiologique de l'arthrite goutteuse. L'interaction directe entre les neutrophiles humains et les cristaux d'UMS est essentielle pour le déclenchement de la crise de goutte aiguë. Le principal objectif de ce projet de recherche est d'identifier les voies de signalisation activées par les cristaux d'UMS et de caractériser leurs fonctions dans les réponses des neutrophiles humains.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le pouvoir pathogène des microorganismes repose sur leur capacité à manipuler des processus cellulaires de l'hôte à l'aide de protéines sécrétées dans le tissu végétal : les effecteurs. En plus de leur rôle primordial dans le pouvoir pathogène, les effecteurs sont centraux pour la résistance des plantes. La reconnaissance de certains d'entre eux par des récepteurs du système immunitaire végétal, nommées protéines de résistance (R), déclenche la résistance de la plante. Cette thèse a permis la caractérisation moléculaire d'AVR-CO39, un effecteur du champignon pathogène du riz Magnaporthe oryzae. Nous montrons qu'AVR-CO39 est transloqué dans le cytoplasme des cellules infectées par un mécanisme indépendant de facteurs fongiques et est reconnu dans ce même compartiment par le produit du locus R nommé Pi-CO39. La surexpression d'AVR-CO39 dans des plantes transgéniques révèle que cet effecteur influence des processus développementaux et physiologiques du riz. Un crible double hybride dans la levure a permis d'identifier 9 protéines du riz potentiellement ciblées par AVR-CO39. Une d'elles, nommée RGA5, confère la résistance Pi-CO39 avec une seconde protéine R du riz appelée RGA4. Nos résultats indiquent que RGA4 induit l'activation de la défense tandis que RGA5 agit comme récepteur de protéines Avr. En effet, RGA5 interagit physiquement avec AVR-CO39 et AVR-Pia, un autre effecteur de M. oryzae, via un domaine C-terminal homologue à des protéines de liaison au cuivre. Cette thèse a donc permis l'identification d'un nouveau domaine de reconnaissance de protéines Avr et le développement d'un modèle mécanistique pour le fonctionnement de paires de protéines R chez les plantes. / Pathogenic microorganisms secrete numerous proteins during infection into the plant tissue to manipulate host cellular processes. These proteins are called effectors and are central to pathogenicity. Certain effectors are recognized by receptors of the plant immune system called resistance (R) proteins and this recognition triggers plant resistance. The objective of the thesis was the molecular characterization of AVR-CO39, an effector of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Localization studies indicate that AVR-CO39 is translocated into the cytoplasm of infected rice-cells by a mechanism independent of fungal factors and that it is recognized within this compartment by the product of the corresponding R locus Pi-CO39. Overexpression of AVR-CO39 in transgenic rice plants suggests that the effector influences plant physiology and development. Yeast two-hybrid screening identified 9 rice proteins potentially targeted by AVR-CO39. One of them, called RGA5, interacts with a second R protein, RGA4, to confer Pi-CO39 resistance. Our results suggest that RGA4 activates plant defense while RGA5 represses RGA4 function in the absence of effectors proteins and acts as an Avr receptor protein. Indeed, RGA5 physically interacts with AVR-CO39 and another M. oryzae effector named AVR-Pia through a previously undescribed C-terminal domain displaying homology to copper-binding proteins. Therefore, this work identified a new Avr recognition domain in R proteins and generated a new mechanistic model for the action of R protein pairs in plant resistance.

Ce travail de thèse a porté sur l’étude d’activités enzymatiques virales impliquées dans la réplication de deux genres viraux : les Flavivirus et les Coronavirus. Dans un premier temps, nous avons étudié des activités enzymatiques impliquées dans la formation de la structure coiffe des ARNm viraux. En effet, du fait de leur cycle réplicatif cytoplasmique, ces virus n’ont pas accès à la machinerie de formation de la coiffe cellulaire et expriment donc une machinerie dédiée. Le processus canonique de formation de la coiffe fait appel à quatre activités enzymatiques, une ARN 5’-triphosphatase, une guanylyltransférase et deux méthyltransférases.Chez les flavivirus, nous avons développé des outils permettant d’identifier l’activité guanylyltransférase ainsi que des essais enzymatiques nécessaires à la caractérisation des activités méthyltransférases. Ces outils nous ont notamment permis d’évaluer l’effet inhibiteur de molécules choisies par des méthodes de criblages virtuels sur les deux activités méthyltransférases de la protéine NS5 nécessaires à la formation de la coiffe.Chez les coronavirus, nous nous sommes intéressés à une activité méthyltransférase impliquée dans la formation de la coiffe et notamment à sa régulation par un partenaire viral. Nous avons démontré que le processus de méthylation de la coiffe suit un ordre obligatoire, initié par la méthylation de la position N7 par la protéine nsp14. Dans une seconde étape, les structures coiffe-0 (7MeGpppA) sont converties en coiffe-1 (7MeGpppA2’OMe) par la protéine nsp16 en complexe avec nsp10. Nous avons démontré que l’activité 2’O-méthyltransférase portée par la protéine nsp16 nécessite une interaction spécifique avec la protéine nsp10 qui joue probablement un rôle d’échafaudage.Dans un second temps, nous avons démontré que l’activité exoribonucléase portée par la protéine nsp14 est également régulée par la protéine nsp10. La stimulation de l’activité passe par une interaction directe entre les deux protéines et il semble que les surfaces d’interaction de nsp10 avec nsp14 et nsp16 soient chevauchantes. Enfin, la caractérisation de l’activité exoribonucléase confirme la possibilité de son implication dans un mécanisme de réparation des erreurs incorporées lors de la synthèse d’ARN par la polymérase virale. / This work focused on enzymatic activities of two RNA virus genera, Flavivirus and Coronavirus.We first studied the mRNA cap synthesis machinery of these viruses. Indeed, as they replicate in the cytoplasm of the infected cell, these viruses encode their own mRNA cap-forming enzymes. The canonical mechanism of cap synthesis uses four enzymatic activities, a RNA 5’-triphosphatase, a guanylyltransferase and two methyltransferases.We tried to identify the guanylyltransferase activity involved in this process for flaviviruses and we developed enzymatic assays to characterize both guanylyltransferase and methyltransferase activities. We used the methyltransferase assay in order to test the inhibitor effect of molecules, selected by virtual screening, on the methyltransferase activities of the NS5 protein involved in the capping process.Concerning coronaviruses, we first focused on the methyltransferase activities of the nsp14 and nsp16 proteins. We have reconstituted the complete SARS-CoV mRNA cap methylation in vitro. We showed that mRNA cap methylation requires a third viral protein, nsp10, which acts as an essential trigger to complete RNA cap-1 formation. The obligate sequence of methylation events is initiated by nsp14, which first methylates capped RNA transcripts to generate cap-0 7MeGpppA-RNAs. The latter are then selectively 2′O-methylated by the 2′O-methyltransferase nsp16 in complex with its activator nsp10 to give rise to cap-1 7MeGpppA2′OMe-RNAs. Then, we took interest in the exoribonuclease activity of the nsp14 protein and found that this activity is also regulated by the same cofactor, the nsp10 protein. The interaction between the proteins is required to observe the stimulatory effect and it seems that the surface areas of nsp10 interacting with nsp14 and nsp16 overlap. The in vitro characterization of the nuclease activity of nsp14 is according with its potential implication in RNA proofreading mechanism.

La formation des agrégats des peptides et des protéines par l'interaction de feuillets β a de plus en plus attiré l'attention car elle se produit dans de nombreuses maladies humaines généralisées, telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la maladie d'Alzheimer (AD), la maladie de Parkinson (PD), les maladies à prions et la maladie de Huntington (HD). La maladie d'Alzheimer est la forme la plus courante de démence qui provoque la perte de la mémoire chez les personnes âgées. En 2013, il y avait 35 millions de personnes souffrant de AD à travers le monde, un chiffre qui devrait doubler d'ici 2050. Etiologiquement ces maladies se manifestent par des dépôts anormaux de protéines, y compris les plaques neuritiques séniles (PNS) et les dégénérescences neurofibrillaires (DNF). L'accumulation extracellulaire d'agrégats insolubles de la protéine β-amyloide (A) conduit à la formation de plaques séniles, tandis que DNF se produisent à l’intérieur des neurones et sont composés par des filaments hélicoidaux appariés de la protéine tau hyperphosphorylée. Les peptides A sont produits en tant que monomères solubles et subissent l'oligomérisation et la formation de fibrilles amyloides par un processus qui n’a pas été complètement clarifié. Il est suggéré que les peptides Aß solubles jouent un rôle important dans la croissance neuronale, la survie et la modulation synaptique, tandis que les oligomères et fibrilles ont des propriétés toxiques. Une nouvelle stratégie thérapeutique vers la prévention ou le traitement de maladies associées à des structures -feuillet et, en particulier, AD, est représentée par la synthèse de mimes de -brins qui peuvent antagoniser la formation ou la reconnaissance de feuillet ß. En fait, dans la maladie d’Alzheimer, le processus d'agrégation des protéines implique une transition de la structure secondaire non ordonnée/α-hélice à une conformation riche en feuillet β, conduisant à la formation de feuillet croisés. Sur la base des quelques données publiées récemment sur des mimes d’épingles  et en particulier des structures macrocycliques de Nowick, comme inhibiteurs de l'agrégation des protéines, nous avons supposé qu’une pré-structuration des molécules peptidomimétiques pourrait augmenter leur affinité pour les peptides A et donc augmenter leur activité inhibitrice de l'agrégation. Notre conception vers un mime d’épingle stable, qui pourrait interagir et éventuellement agir en tant que ligand de feuillets β et inhibiteur de l'agrégation, implique l’assemblage d’une dicétopipérazine bifonctionnelle en tant que scaffold , d’un brin peptidomimétique pour stabiliser la formation de feuillets β et enfin d’une séquence peptidique convenable pour la liaison à la protéine. Ces molécules ont montré une interaction avec le peptide Aβ1-42 ainsi qu’une modulation de la cinétique d’agrégation. / The formation of peptide and protein aggregates through the interaction of β-sheets has increasingly drawn attention since it occurs in many widespread human diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer’s disease (AD), Parkinson's disease (PD), prion diseases, and Huntington's disease (HD). Alzheimer’s disease is the most common form of dementia that causes memory loss in the elderly. In 2013, 35 million people were afflicted with AD worldwide, a number expected to double by 2050. Etiologically, the most common findings are abnormal protein deposits, including senile neuritic plaques (SNPs) and neurofibrillary tangles (NFTs). The extracellular accumulation of insoluble aggregates of β-amyloid protein (Aβ) leads to the formation of senile plaques, whereas NFTs occur intracellulary and are composed of paired helical filaments of hyperphosphorylated tau protein. Aβ peptides are produced as soluble monomers and undergo oligomerization and amyloid fibril formation via an unclear process. It is suggested that soluble A peptides play an important role in neuronal growth, survival, and synaptic modulation, while the oligomers and fibrils have toxic properties. Mimicking -strands to antagonize -sheet formation or recognition represent a new therapeutic strategy toward the prevention or treatment of diseases associated with -sheet structures such as AD. In this pathology, protein aggregation process involves a secondary structure transition from unordered/α-helix to a β-sheet rich conformation, leading to cross β-sheet structure formation. Based on the few recent published data on β-hairpin mimics, in particular on the macrocyclic structures of Nowick, as inhibitors of protein aggregation, we hypothesized that pre-structuring the peptidomimetic molecules might increase their affinity for Aβ peptides and thus increase their aggregation inhibitory activity. Our design towards a stable β-hairpin mimic (Figure 1), which could interact and eventually act as a β-sheet binder and aggregation inhibitor, involved assembling of a bifunctional diketopiperazine scaffold , a peptidomimetic strand to stabilize the formation of β-sheets and finally a suitable peptide sequence for binding to the aggregating protein. These molecules were shown to interact with the native Aβ1-42 peptide and modulate the kinetics of aggregation.

Le recyclage de récepteurs et de lipides vers la membrane plasmique, est un processus finement régulé, essentiel pour l’homéostasie de la membrane plasmique et pour la migration cellulaire. Il requière l’intervention des petites GTPases de la famille Rabs et leurs effecteurs. La protéine MICAL-L1, effecteur de plusieurs Rabs, comme Rab 8, 11, 13 et 35, a été impliquée dans le recyclage vers la membrane plasmique. Dans cette étude, nous avons identifié une nouvelle interaction entre MICAL-L1 et la PACSINE3, une protéine à domaine F-BAR capable de façonner les membranes intracellulaires et qui contribue à la génération d’endosomes de recyclage tubulaires. MICAL-L1 est nécessaire pour la localisation de la PACSINE3 au niveau des membranes des endosomes. La perturbation du complexe MICAL-L1/PACSINE3 affecte le recyclage du récepteur de la transferrine (TfR) vers la membrane plasmique. Le complexe MICAL-L1/PACSINE3 est associé à des longs tubules membranaires contenant la transferrine comme cargo. La dynamique de ségrégation et de détachement des cargos Tf à partir des tubules contenant MICAL-L1 et PACSINE3, suggère que ce complexe contrôle le tri/adressage des endosomes de recyclage vers la membrane plasmique. Notre travail révèle un nouveau mécanisme de régulation de la voie de recyclage vers la surface cellulaire. / The recycling to the plasma membrane of receptors and lipids is tightly regulated and is essential for PM homeostasis, adhesion and cell migration. It requires small GTPase Rab proteins and their effectors. The MICAL-L1 protein, an effector of several Rabs including Rab 8, 11, 13 and 35, has been shown to play an important role in the recycling. Here, we report a novel interaction between MICAL-L1 and the BAR domain containing protein PACSIN3/Syndapin3 that contributes to generate tubular recycling endosomes. MICAL-L1 is required for the localization of PACSIN3 to endosomal membranes. Importantly, disruption of MICAL-L1/PACSIN3 interaction promotes the transferrin receptor (TfR) delivery back to the plasma membrane. The MICAL-L1/PACSIN3 complex accumulates in elongated tubules that contain transferrin carriers. The dynamic of transferrin positive endosomes segregation from MICAL-L1/PACSIN3 tubules suggests that MICAL-L1/PACSIN3 complex controls TfR recycling endosomes delivery to the plasma membrane. Our data provide novel mechanistic insights on the dynamical regulation of the plasma membrane recycling pathway.