Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-05-08T17:24:45Z No. of bitstreams: 1 2017_DéborahBiancaSantosMartins.pdf: 4320625 bytes, checksum: 8a3bd1eead0328739a78a254969a6ecf (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-05-15T16:13:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DéborahBiancaSantosMartins.pdf: 4320625 bytes, checksum: 8a3bd1eead0328739a78a254969a6ecf (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-15T16:13:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DéborahBiancaSantosMartins.pdf: 4320625 bytes, checksum: 8a3bd1eead0328739a78a254969a6ecf (MD5) Previous issue date: 2018-05-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF). / Rhodnius neglectus (Hemiptera: Reduviidae) é um vetor potencial do Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas. Ele apresenta em suas glândulas salivares moléculas importantes que neutralizam os mecanismos hemostáticos do hospedeiro, auxiliam na alimentação sanguínea e, de forma indireta, na transmissão do T. cruzi. Assim, a saliva desse inseto hematófago se torna um relevante alvo de pesquisas devido à presença de moléculas com elevado potencial farmacológico. Este estudo teve por objetivos, a expressão heteróloga de membros das famílias de proteínas salivares triabina e antígeno 5 e a avaliação da atividade apirásica salivar de R. neglectus. As sequências nucleotídicas das proteínas foram obtidas a partir do transcriptoma de R. neglectus, clonadas no vetor pET100/D-TOPO e expressas em bactérias Escherichia coli da linhagem BL21(DE3). Ambas as proteínas recombinantes, triabina e antígeno 5, foram observadas na fração insolúvel após a lise das bactérias. Essas foram purificadas por cromatografia de afinidade e usadas para a produção de anticorpos policlonais em camundongos, os quais reagiram cruzadamente com antígenos das salivas das espécies R. prolixus e T. infestans. Após a otimização do protocolo de expressão, somente a triabina foi expressa na fração solúvel do lisado bacteriano. A atividade apirásica também foi avaliada na saliva de R. neglectus em solução e por zimografia em gel. As proteínas salivares com atividade apirásica foram identificadas por espectrometria de massas das bandas excisadas do zimograma contendo ADP como substrato. Os anticorpos antiapirase de R. prolixus reagiram cruzadamente com antígenos da saliva de R. neglectus. Os resultados mostram que há espécies nas tribos Rhodniini e Triatomini que compartilham epítopos semelhantes de triabina, antígeno 5 e apirase. Como perspectiva, a triabina recombinante solúvel poderá ser avaliada como potencial marcador de exposição aos triatomíneos, bem como ter determinadas as suas potenciais atividades farmacológicas e contribuir na compreensão das interações dinâmicas hospedeiro-vetor. / Rhodnius neglectus (Hemiptera: Reduviidae) is a potential vector for Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas disease. It presents in its salivary glands important molecules that neutralize the hemostatic mechanisms of the host, assist in the blood supply and in T. cruzi transmission. The saliva of this hematophagous insect is, therefore, a research target due to the presence of molecules with pharmacological potential. In this study, the heterologous expression of members from triabin and antigen 5 families and the evaluation of R. neglectus salivary apyrase activity are reported. Protein nucleotide sequences were selected from R. neglectus transcriptome, cloned into pET100/D-TOPO vector and expressed in Escherichia coli strain BL21(DE3). Both recombinant proteins, triabin and antigen 5, were observed in the insoluble fraction after bacterial lysis. They were purified by affinity chromatography and used to raise polyclonal antibodies in mice, which cross-reacted with antigens from saliva of R. prolixus and Triatoma infestans. After optimization of the expression protocol, only triabin was expressed in the bacterial soluble fraction. Apyrase activity was also evaluated in R. neglectus saliva, both in solution and by in gel zymography. Salivary proteins with apyrase activity were identified by mass spectrometry of bands excised from the zymogram containing ADP as substrate. R. prolixus anti-apyrase antibodies cross-reacted with R. neglectus salivary antigens. Results show that species from both Rhodniini and Triatomini tribes share similar antigen 5, triabin, and apyrase epitopes. As a perspective, soluble recombinant triabin can be evaluated as biomarker candidate to triatomine exposure, for potential pharmacological activities and may contribute in the understanding of host-vector dynamic interactions.

Os peptídeos da estaterina (DR9) e da histatina 3 (RR14), que ocorrem naturalmente na película in vivo, amplificam o efeito inibitório do crescimento de cristais de hidroxiapatita, função relacionada à remineralizarão do esmalte e formação de cálculos dentários. A hipótese da duplicação/hibridação de domínios funcionais dos peptídeos DR9 da estaterina e RR14 da histatina 3 foi testada. Para isto, os peptídeos peptidomiméticos (DR9-DR9, DR9-RR14), além deles individualmente e suas proteínas intactas (DR9, RR14, estaterina e histatina 3) foram estudados em sete concentrações diferentes para avaliar o efeito da inibição do crescimento de cristais de hidroxiapatita. Foi utilizado um ensaio colorimétrico de microplaca para quantificar o crescimento de cristais de hidroxiapatita. As experiências foram feitas em triplicata e a concentração inibitória (IC50) foi estabelecida para cada grupo. A IC50 foi calculada para todos os peptídeos e proteínas testados. A histatina 3 e o RR14 não atingiram o valor de IC50. O DR9- RR14 atingiu o valor de IC50 a 3,80 M. Como esperado, DR9 e DR9-DR9 demonstraram um efeito inibitório significativo na atividade de crescimento de cristais, atingindo o valor de IC50 a 2,82 M e 1,07 M, respectivamente. A estaterina atingiu o valor de IC50 a 2,50 M. Na análise estatística, foram aplicados os testes ANOVA e Student-Newman-Keuls para comparações por pares, para comparar os valores entre os grupos. O DR9-DR9 amplificou o efeito inibitório do crescimento de cristais de hidroxiapatita quando comparado com DR9 único (p <0,05), demonstrando que a multiplicação do domínio funcional é uma forte tendência evolutiva da proteína. De forma interessante, o peptídeo híbrido DR9-RR14 demonstrou um efeito inibitório intermediário quando comparado com outros dois grupos: DR9 único e DR9-DR9. Este estudo utilizou a abordagem peptidomimética para investigar uma via potencial de evolução da proteína relacionada com a duplicação/hibridação dos constituintes peptídicos naturais da película adquirida de esmalte. O conhecimento obtido por meio dos resultados deste trabalho pode fornecer uma base para o desenvolvimento de peptídeos sintéticos para uso terapêutico, tanto contra cárie dentária, como para a doença periodontal. / The statherin and histatin 3 peptides (DR9 and RR14 respectively), which occur naturally in the film in vivo, amplify the inhibitory effect for the growth of hydroxyapatite crystals, a function related to remineralization of the enamel and formation of dental calculi. The hypothesis of duplication/hybridization of functional domains of the DR9 peptides of the statherin and RR14 of histatin 3 was tested. For this, the peptidomimetic peptides (DR9-DR9, DR9-RR14), in addition to them individually and their intact proteins (DR9, RR14, statherin and histatin 3) were studied at seven different concentrations to evaluate the effect of growth inhibition of hydroxyapatite crystals. A colorimetric assay of microplate was used to quantify the growth of hydroxyapatite crystals. The experiments were done in triplicate and the inhibitory concentration (IC50) was established for each group. The IC50 was calculated for all peptides and proteins tested. Histatin 3 and RR14 did not reach the IC50 value. DR9-RR14 reached the IC50 value at 3.80 M. As expected, DR9 and DR9-DR9 demonstrated a significant inhibitory effect on crystal growth activity, reaching the IC50 value at 2.82 M and 1.07 M, respectively. Statherin reached the IC50 value at 2.50 M. ANOVA and Student-Newman-Keuls tests for paired comparisons were applied to compare the values between the groups. DR9-DR9 amplified the inhibitory effect of hydroxyapatite crystal growth when compared to single DR9 (p <0.05), demonstrating that the multiplication of the functional domain is a strong protein evolution pathway. Interestingly, the hybrid peptide DR9-RR14 demonstrated an intermediate inhibitory effect when compared to other two groups: single DR9 and DR9-DR9. This study utilized the peptidomimetic approach to investigate a potential pathway of protein evolution related to duplication/hybridization of the natural peptidic constituents of the acquired enamel film. The knowledge obtained through the results of this work can provide a basis for the development of synthetic peptides for therapeutic use, both against dental caries and for periodontal disease.

Os peptídeos da estaterina (DR9) e da histatina 3 (RR14), que ocorrem naturalmente na película in vivo, amplificam o efeito inibitório do crescimento de cristais de hidroxiapatita, função relacionada à remineralizarão do esmalte e formação de cálculos dentários. A hipótese da duplicação/hibridação de domínios funcionais dos peptídeos DR9 da estaterina e RR14 da histatina 3 foi testada. Para isto, os peptídeos peptidomiméticos (DR9-DR9, DR9-RR14), além deles individualmente e suas proteínas intactas (DR9, RR14, estaterina e histatina 3) foram estudados em sete concentrações diferentes para avaliar o efeito da inibição do crescimento de cristais de hidroxiapatita. Foi utilizado um ensaio colorimétrico de microplaca para quantificar o crescimento de cristais de hidroxiapatita. As experiências foram feitas em triplicata e a concentração inibitória (IC50) foi estabelecida para cada grupo. A IC50 foi calculada para todos os peptídeos e proteínas testados. A histatina 3 e o RR14 não atingiram o valor de IC50. O DR9- RR14 atingiu o valor de IC50 a 3,80 M. Como esperado, DR9 e DR9-DR9 demonstraram um efeito inibitório significativo na atividade de crescimento de cristais, atingindo o valor de IC50 a 2,82 M e 1,07 M, respectivamente. A estaterina atingiu o valor de IC50 a 2,50 M. Na análise estatística, foram aplicados os testes ANOVA e Student-Newman-Keuls para comparações por pares, para comparar os valores entre os grupos. O DR9-DR9 amplificou o efeito inibitório do crescimento de cristais de hidroxiapatita quando comparado com DR9 único (p <0,05), demonstrando que a multiplicação do domínio funcional é uma forte tendência evolutiva da proteína. De forma interessante, o peptídeo híbrido DR9-RR14 demonstrou um efeito inibitório intermediário quando comparado com outros dois grupos: DR9 único e DR9-DR9. Este estudo utilizou a abordagem peptidomimética para investigar uma via potencial de evolução da proteína relacionada com a duplicação/hibridação dos constituintes peptídicos naturais da película adquirida de esmalte. O conhecimento obtido por meio dos resultados deste trabalho pode fornecer uma base para o desenvolvimento de peptídeos sintéticos para uso terapêutico, tanto contra cárie dentária, como para a doença periodontal. / The statherin and histatin 3 peptides (DR9 and RR14 respectively), which occur naturally in the film in vivo, amplify the inhibitory effect for the growth of hydroxyapatite crystals, a function related to remineralization of the enamel and formation of dental calculi. The hypothesis of duplication/hybridization of functional domains of the DR9 peptides of the statherin and RR14 of histatin 3 was tested. For this, the peptidomimetic peptides (DR9-DR9, DR9-RR14), in addition to them individually and their intact proteins (DR9, RR14, statherin and histatin 3) were studied at seven different concentrations to evaluate the effect of growth inhibition of hydroxyapatite crystals. A colorimetric assay of microplate was used to quantify the growth of hydroxyapatite crystals. The experiments were done in triplicate and the inhibitory concentration (IC50) was established for each group. The IC50 was calculated for all peptides and proteins tested. Histatin 3 and RR14 did not reach the IC50 value. DR9-RR14 reached the IC50 value at 3.80 M. As expected, DR9 and DR9-DR9 demonstrated a significant inhibitory effect on crystal growth activity, reaching the IC50 value at 2.82 M and 1.07 M, respectively. Statherin reached the IC50 value at 2.50 M. ANOVA and Student-Newman-Keuls tests for paired comparisons were applied to compare the values between the groups. DR9-DR9 amplified the inhibitory effect of hydroxyapatite crystal growth when compared to single DR9 (p <0.05), demonstrating that the multiplication of the functional domain is a strong protein evolution pathway. Interestingly, the hybrid peptide DR9-RR14 demonstrated an intermediate inhibitory effect when compared to other two groups: single DR9 and DR9-DR9. This study utilized the peptidomimetic approach to investigate a potential pathway of protein evolution related to duplication/hybridization of the natural peptidic constituents of the acquired enamel film. The knowledge obtained through the results of this work can provide a basis for the development of synthetic peptides for therapeutic use, both against dental caries and for periodontal disease.

Introdução: A saliva total (ST) além do produto das glândulas salivares estará acrescida de resíduos da descamação celular das mucosas oral, cavidade nasal, faringe; fluidos gengivais, leucócitos, bactérias, restos alimentares, hormônios, drogas e etc. Entre outras características está sua capacidade protetora e cicatrizante. Objetivo: Avaliar e verificar a atividade das enzimas, alfa amilase e peroxidases; ácido siálico, concentração proteica de mucinas e proteínas totais; pH e fluxo na ST não estimulada de recém nascido a termo (RNT) em aleitamento materno exclusivo. Casuística e Metodologia: As amostras salivares foram colhidas de 22 RNT em aleitamento materno exclusivo; do alojamento conjunto, do Hospital Universitário da Universidade de São Paulo (HU-USP), no período de setembro a outubro de 2017, após assinatura de termo de consentimento livre e esclarecido pelos responsáveis. Critérios de Inclusão: RNT saudáveis, em aleitamento materno exclusivo, com peso adequado para idade gestacional (AIG). Critérios de Exclusão: Portadores de doença sistêmica, Malformação Congênita, Doenças Neurológicas, Sepse neonatal, Distúrbios metabólicos de difícil correção (hipoglicemia refratária),Distúrbios hidroeletrolíticos, Distúrbios acido/básicos, Doenças hemolíticas, Infecções Congênitas do grupo ZTORCHS. Resultados: Verificamos a presença de todos os componentes do estudo (alfa amilase, peroxidases; ácido siálico, concentração proteica de mucinas e proteínas totais, pH e fluxo), em quantidade pequena, justificada pela imaturidade funcional das glândulas salivares, sem diferenças estatísticas entre elas. Verificamos para esta amostra diferenças estatisticamente significante quanto à: idade das mães de primeira gestação; a evolução das notas do índice Apgar de primeiro minuto para as notas do quinto minuto de vida extrauterina; como elemento mais significativo dos resultados, está a quantidade aumentada de alfa amilase para os recém nascidos de nota oito na índice de Apgar do primeiro minuto. Conclusão: A saliva total embora sofra modificações quantitativas e qualitativas com o crescimento desenvolvimento da criança, neste precoce período neonatal reflete não só seu caráter protetor e indiretamente imunológico; o funcionamento glandular; assim como através da quantidade aumentada de alfa amilase nos recém nascidos com nota oito do índice de Apgar, mostrando a ação do Sistema Nervoso Simpático e Parassimpático, uma vez que as glândulas salivares reagem de forma direta a seus estímulos / Introduction: The total saliva (TS) in addition to the salivary gland product will be increased by residues of the cellular desquamation of the oral mucosa, nasal cavity, pharynx; gingival fluids, leukocytes, bacteria, food debris, hormones, drugs, and so on. Among other characteristics is its protective and healing capacity. Objective: To evaluate and verify the activity of the enzymes, alpha amylase and peroxidases; sialic acid, protein concentration of mucins and total proteins; pH and flow in the unstimulated ST of term newborn (TNF) in exclusive breastfeeding. Casuistry and Methodology: Salivary samples were collected from 22 TNF in exclusive breastfeeding; of the University Hospital of the University of São Paulo (HU-USP), from September to October 2017, after signing an informed consent form. Inclusion Criteria: RNT healthy, exclusively breastfed, with adequate weight for gestational age (AIG). Exclusion Criteria: Systemic disease carriers, Congenital malformation, Neurological diseases, Neonatal sepsis, Metabolic disorders of difficult correction (hypoglycemia refractory), Hydroelectrolytic disorders, Acid / basic disorders, Hemolytic diseases, Congenital infections of the ZTORCHS group. Results: We verified the presence of all components of the study (alpha amylase, peroxidases, sialic acid, protein concentration of mucins and total proteins, pH and flow), in a small amount, justified by the functional immaturity of the salivary glands, without statistical differences between them . We verified for this sample statistically significant differences as to: the age of the mothers of first gestation; the evolution of the first-minute Apgar score notes to the fifth-minute notes of extrauterine life; as the most significant element of the results is the increased amount of alpha amylase for infants of note eight in the first minute Apgar score. Conclusion: Although total saliva undergoes quantitative and qualitative changes with the child\'s growth development, in this early neonatal period it reflects not only its protective and indirectly immunological nature; glandular functioning; as well as through the increased amount of alpha amylase in newborns with an eight note Apgar score, showing the action of the Sympathetic and Parasympathetic Nervous System, since the salivary glands react directly to their stimuli

Introdução: A saliva total (ST) além do produto das glândulas salivares estará acrescida de resíduos da descamação celular das mucosas oral, cavidade nasal, faringe; fluidos gengivais, leucócitos, bactérias, restos alimentares, hormônios, drogas e etc. Entre outras características está sua capacidade protetora e cicatrizante. Objetivo: Avaliar e verificar a atividade das enzimas, alfa amilase e peroxidases; ácido siálico, concentração proteica de mucinas e proteínas totais; pH e fluxo na ST não estimulada de recém nascido a termo (RNT) em aleitamento materno exclusivo. Casuística e Metodologia: As amostras salivares foram colhidas de 22 RNT em aleitamento materno exclusivo; do alojamento conjunto, do Hospital Universitário da Universidade de São Paulo (HU-USP), no período de setembro a outubro de 2017, após assinatura de termo de consentimento livre e esclarecido pelos responsáveis. Critérios de Inclusão: RNT saudáveis, em aleitamento materno exclusivo, com peso adequado para idade gestacional (AIG). Critérios de Exclusão: Portadores de doença sistêmica, Malformação Congênita, Doenças Neurológicas, Sepse neonatal, Distúrbios metabólicos de difícil correção (hipoglicemia refratária),Distúrbios hidroeletrolíticos, Distúrbios acido/básicos, Doenças hemolíticas, Infecções Congênitas do grupo ZTORCHS. Resultados: Verificamos a presença de todos os componentes do estudo (alfa amilase, peroxidases; ácido siálico, concentração proteica de mucinas e proteínas totais, pH e fluxo), em quantidade pequena, justificada pela imaturidade funcional das glândulas salivares, sem diferenças estatísticas entre elas. Verificamos para esta amostra diferenças estatisticamente significante quanto à: idade das mães de primeira gestação; a evolução das notas do índice Apgar de primeiro minuto para as notas do quinto minuto de vida extrauterina; como elemento mais significativo dos resultados, está a quantidade aumentada de alfa amilase para os recém nascidos de nota oito na índice de Apgar do primeiro minuto. Conclusão: A saliva total embora sofra modificações quantitativas e qualitativas com o crescimento desenvolvimento da criança, neste precoce período neonatal reflete não só seu caráter protetor e indiretamente imunológico; o funcionamento glandular; assim como através da quantidade aumentada de alfa amilase nos recém nascidos com nota oito do índice de Apgar, mostrando a ação do Sistema Nervoso Simpático e Parassimpático, uma vez que as glândulas salivares reagem de forma direta a seus estímulos / Introduction: The total saliva (TS) in addition to the salivary gland product will be increased by residues of the cellular desquamation of the oral mucosa, nasal cavity, pharynx; gingival fluids, leukocytes, bacteria, food debris, hormones, drugs, and so on. Among other characteristics is its protective and healing capacity. Objective: To evaluate and verify the activity of the enzymes, alpha amylase and peroxidases; sialic acid, protein concentration of mucins and total proteins; pH and flow in the unstimulated ST of term newborn (TNF) in exclusive breastfeeding. Casuistry and Methodology: Salivary samples were collected from 22 TNF in exclusive breastfeeding; of the University Hospital of the University of São Paulo (HU-USP), from September to October 2017, after signing an informed consent form. Inclusion Criteria: RNT healthy, exclusively breastfed, with adequate weight for gestational age (AIG). Exclusion Criteria: Systemic disease carriers, Congenital malformation, Neurological diseases, Neonatal sepsis, Metabolic disorders of difficult correction (hypoglycemia refractory), Hydroelectrolytic disorders, Acid / basic disorders, Hemolytic diseases, Congenital infections of the ZTORCHS group. Results: We verified the presence of all components of the study (alpha amylase, peroxidases, sialic acid, protein concentration of mucins and total proteins, pH and flow), in a small amount, justified by the functional immaturity of the salivary glands, without statistical differences between them . We verified for this sample statistically significant differences as to: the age of the mothers of first gestation; the evolution of the first-minute Apgar score notes to the fifth-minute notes of extrauterine life; as the most significant element of the results is the increased amount of alpha amylase for infants of note eight in the first minute Apgar score. Conclusion: Although total saliva undergoes quantitative and qualitative changes with the child\'s growth development, in this early neonatal period it reflects not only its protective and indirectly immunological nature; glandular functioning; as well as through the increased amount of alpha amylase in newborns with an eight note Apgar score, showing the action of the Sympathetic and Parasympathetic Nervous System, since the salivary glands react directly to their stimuli