Das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme werden unter anderem vom Hypothalamus reguliert. Dort werden Hormonelle Signale der Peripherie und neuronale Signale integriert. Die G-Protein gekoppelten Melanocortinrezeptoren 3 und 4 (MC3R und MC4R) werden von ihren Agonisten, den Melanocortinen aktiviert und durch den inversen Agonisten/Antagonisten Agouti-Related Peptide (AgRP) inaktiviert. Als weiterer Downstream-Mediatoren der MC4R-Aktivierung wurden kürzlich Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) und dessen Rezeptor TrkB (Tropomyosin-Related –Kinase) identifiziert. Mutationen im MC4R gelten als häufigste monogenetische Ursache für Adipositas. Da viele dieser Mutationen aber in vitro funktionell nicht relevant sind, wurde ein Amosäurevergleich von orthologen MC4R aus 70 verschiedenen Spezies erstellt. Funktionsverlustmutationen waren häufiger an koservierten Positionen, während Mutationen ohne Effekt überwiegend an schwach konservierten Positionen zu finden waren. Funktionelle Charakterisierung der von in Mausmodellen identifizierten Punktmutationen I194F und Y302C ergaben eine gute in-vivo/in-vitro Korrelation. Desweiteren wurden in der Normalbevölkerung in normalgewichtigen Personen identifizierte MC4R-Punktmutationen funktionell charakterisiert. Die Mutationen R7C, A70T, T112K, Q156R, M200V, V166I und R236H hatten keinen Effekt auf die Rezeptorfunktion, die H158R. Mutation zeigte eine hohe Basalaktivität, die aber durch AgRP erniedrigt werden konnte. Die in adipösen Patienten gefundenen Mutationen S136F und S139R wiesen einen kompletten Funktionsverlust auf, erstere verursachte zudem sogar einen dominant-negativen Effekt bei Koexpression mit dem Wildtyprezeptor. Für den MC3R wurde das zum Translationsstart bevorzugte Startcodon identifiziert. Für die Rezeptortyrosinkinase TrkB konnte in Hefe-2-Hybridscreens der neue Interaktionspartner Sept3 identifiziert werden. Dieses Protein bindet phosphorylierungsunabhängig an die intrazelluläre Juxtamembrandomäne. / Bodyweight and food intake are regulated by the hypothalamus which integrates peripheral hormonal and neural signals. The G-protein-coupled melanocortin-receptors 3 and 4 (MC3R and MC4R) are activated by melanocortins or inhibited by agouti-related pepetide (AgRP) and signal via the cAMP pathway. Brain-derived neurotrophic Factor (BDNF) was recently shown to signal downstream the MC4R via its receptor TrkB (tropomyosin-related kinase). Mutations in the MC4R are the most common cause of monogenetic obesity. However, many of these mutations are not functionally relevant in vitro. Here, an amino acid alignment of orthologous MC4R from over 70 species was used to evaluate reported mutations. Loss-of-function mutations were predominantly located at highly conserved positions whereas mutations without effect were located at non-conserved positions. Functional characterization of MC4R point mutations I194F (partial loss of function) and Y302C (complete loss of function) identified in mouse models showed good in vitro/in vivo correlation. Furthermore mutations found in normal weight persons were characterized: R7C, A70T, T112K, Q156K, M200V, V166I and R236H had no effect on receptor function in vitro, whereas the H158R Mutation showed high constitutive activity, which however could be diminished by AgRP. The mutations S136F and S139F identified in obese patients were characterized as complete loss-of-function mutations, the former additionally caused a dominant-negative effect on wildtype MC4R in vitro. For the MC3R the preferred start-codon for initiation of translation was identified. For TrkB Sept3 could be identified as a new interaction partner in a yeast-2-hybrid screen. This Protein belonging to the septin family binds to the intracellular juxtamembrane domain of TrkB independent of phosphorylation of the Shc-binding site.

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Pluripotenz wird durch viele Stammzell-spezifische Transkriptionsfaktoren wie Oct3/4, Nanog und Sox2 sowie deren Funktion in ihrem regulatorischen Netzwerk etabliert und aufrechterhalten. Viele Studien haben gezeigt, wie diese Pluripotenz-assoziierten Faktoren ihre Zielgene regulieren. Dies geschieht durch die Interaktion mit bekannten und unbekannten Interaktionspartnern. In der vorliegenden Arbeit haben wir Zfp819 als einen neuen Pluripotenz-assoziierten Faktor beschrieben und dessen Funktion in pluripotenten Stammzellen untersucht. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit haben wir zwei cDNA-Banken für Yeast two Hybdrid (Y2H)-Assays aus unterschiedlichen pluripotenten Stammzelltypen generiert. Dies hatte zum Ziel, potentielle Interaktionspartner eines Kandidatenproteins zu identifizieren um dadurch Eindrücke über die Funktion des Proteins zu gewinnen. Für die Identifizierung von potentiellen Interaktionspartnern von Zfp819 haben wir die cDNA-Bank aus embryonalen Stammzellen benutzt. Wir konnten 17 putative Interaktionspartner identifizieren und daraus ein hypothetisches „Interaktom“ von Zfp819 generieren. Die Einordnung der putativen Interaktionspartner nach ihrer Gen-Ontologie (GO) ließ vermuten, dass Zfp819 eine Rolle in der Regulation der Transkription, der Aufrechterhaltung der genetischen Integrität und im Zellzyklus bzw. bei der Apoptose spielt. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die sehr intensive Expression von Zfp819 in undifferenzierten pluripotenten Zelllinien gezeigt. Desweiteren konnte die Promotorregion von Zfp819 identifiziert werden, und es wurde gezeigt, dass diese mit epigenetischen Mustern ausgestattet ist. Zusätzlich konnten wir Regionen im Zfp819-Gen identifizieren, die für die nukleäre Lokalisation von Zfp819 verantwortlich sind. Desweiteren konnten wir zeigen, dass Zfp819 in der transkriptionellen Repression von spezifischen endogenen, retroviralen Elementen (ERVs) in pluripotenten Zellen eine Rolle spielt. Durch zelluläre und biochemische Studien konnten wir zeigen, dass Zfp819 mit vielen Proteinen interagiert (z.B. Kap1 und Chd4), welche für die Aufrechterhaltung der genomischen Integrität von Bedeutung sind. Tatsächlich resultierte der Verlust von Zfp819 in embryonalen Stammzellen in einer erhöhten Anfälligkeit für DNA-Schäden und in einer verminderten DNA-Reparatur. Zusammenfassend lassen die Identifizierung der Interaktionspartner sowie die Ergebnisse der molekularen und der funktionellen Studien vermuten, dass Zfp819 durch die Unterdrückung von ausgewählten ERVs eine Rolle in der Regulation der genomischen Stabilität von pluripotenten Zellen spielt.

Zahlreiche pathogene „missense“-Mutation, die verhindern, dass Proteine korrekt gefaltet werden, befinden sich in geordneten Regionen von Proteinen. Andere krankheitsrelevante Mutationen befinden sich in ungeordneten Regionen und beeinflussen somit nur begrenzt die Funktionalität, zum Beispiel durch Veränderungen kurzer linearer Sequenzmotive, die Protein-Protein Interaktionen vermitteln. In dieser Arbeit wird ein peptidbasierter Interaktionsscreen präsentiert mit dem sich Veränderungen im Interaktom identifizieren lassen. Synthetische Peptide von wild-typ und zugehörigen mutierten Proteinregionen ermöglichen die gleichzeitige Untersuchung von mehr als hundert Mutationen mittels Massenspektrometrie. Mehr als ein Drittel aller getesteten Mutationen hatten veränderte Interaktionen zur Folge. Darunter befanden sich auch drei Prolin zu Leucin Mutationen in zytosolischen Regionen von Transmembranproteinen, die zusammen mit dem benachbarten Leucin einem Dileucinmotiv ergeben und dadurch verstärkt mit Clathrin interagieren. Dieses Motiv wurde bereits mit Clathrin-vermittelter Endozytose in Verbindung gebracht. Die hinzugewonnene Endozytose könnte Krankheitsmechanismen erklären, da die Mislokalisation der betroffenen Transmembranproteine zum effektiven Verlust derer Funktion führen würde. Diese Hypothese wurde hier von verschiedenen in vitro und in vivo Experimenten bezüglich der P485L Mutation im Glukose Transporter-1 (GLUT1), die das GLUT1-Defizit-Syndrom hervorruft, bestätigt. Weitere Evidenz wurde außerdem für die Funktionalität anderer mutationsbedingter Dileucinmotive gewonnen. Die systematische Analyse von pathogenen Mutationen hat gezeigt, dass Dileucinmotive signifikant und spezifisch in ungeordneten zytosolischen Regionen von Transmembranproteinen überrepräsentiert sind. Dieser Peptidescreen macht das Potenzial unvoreingenommener Analysen zur Aufklärung von Krankheitsmechanismen deutlich, die von Veränderungen in Protein-Protein Interaktionen hervorgerufen werden. / Many disease-associated missense mutations prevent proteins from folding correctly and lead to loss-of-function. These mutations are often found in ordered regions of proteins. Another class of disease-related missense mutations can be found in disordered regions. These are thought to impair only specific parts of a protein’s functions. Those mutations could modify short linear motifs that mediate protein-protein interactions. Here, we designed a peptide-based interaction screen to identify interactions that are affected by mutations in disordered regions. We used synthetic peptides corresponding to the wild type and mutated protein regions spotted on cellulose membrane to pull-down interaction partners. This setup allows for the screening of more than hundred mutations at a time via mass spectrometry. Here, we focused on mutations implicated in neurological diseases. More than one-third of tested variant pairs show differential interactions. Three disease-related proline to leucine mutations in cytosolic tails of transmembrane proteins lead to gain of a dileucine sequence. Several dileucine-containing peptide motifs are involved in clathrin-mediated endocytosis (CME). Also in the presented screen, the newly created motifs mediate interaction with the CME machinery. This could explain the disease mechanisms since mislocalization of the affected transmembrane proteins would lead to their loss of function. This hypothesis has been corroborated for glucose transporter-1 (GLUT1) P485L, causing GLUT1 deficiency syndrome. We were able to provide functional evidence also for additional gained dileucine motifs. A systematic analysis of pathogenic mutations revealed dileucine motifs to be overrepresented in structurally disordered cytosolic regions of transmembrane proteins. The data gained with the peptide screen highlights the power of differential interactome mapping as a generic approach to unravel disease mechanisms caused by changes in protein-protein interactions.

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