O reaproveitamento de resíduos agroindustriais como fontes de carbono e de nitrogênio tem sido investigado na área de biotecnologia para produção de enzimas por micro-organismos. Dentre as enzimas microbianas importadas no Brasil, as proteases são aplicadas no processamento tecnológico de detergentes, fármacos, cosméticos, alimentos, dentre outros. O objetivo deste trabalho foi produzir proteases por cultivo submerso utilizando resíduos agroindustriais. A determinação da atividade proteolítica ocorreu na presença de azocaseína a 0,2 %. Cultivos submersos de culturas isoladas de Bacillus sp. foram realizados em frascos de Erlermeyer. A atividade máxima de proteases foi determinada na presença de milhocina. A concentração do líquido metabólico com atividade proteolítica por ultrafiltração reteve cerca de 80 % da atividade inicial. Um planejamento experimental fatorial foi realizado para investigar a estabilidade do líquido metabólico. A maior atividade proteolítica média do líquido metabólico livre de células (196 U/mL) foi determinada na presença de sorbato de sódio a 0,5 %, cloreto de cálcio a 0,5 %, glicerol a 7,5 % e polietilenoglicol-200 a 0,5 %. O extrato enzimático formulado reteve 68 % da atividade proteolítica com 10 dias de armazenamento à temperatura ambiente (28 ˚C). O retentado com atividade proteolítica apresentou pH ótimo 9 e 11 e retenção de 90 - 100 % da atividade durante 90 min em pH ótimo; a temperatura ótima foi 50 ˚C e a estabilidade térmica máxima a 40 ˚C durante 30 min a pH 11. A formulação de líquido metabólico concentrado com atividade proteolítica que apresenta estabilidade térmica em pH alcalino é um bioproduto que pode ser utilizado como aditivo em detergentes. / The reuse of agro-industrial waste as sources of carbon and nitrogen has been investigated in biotechnology for the production of enzymes by microorganisms. Among the microbial enzymes imported into Brazil, the proteases are applied in technological processes in the fields of detergents, pharmaceuticals, cosmetics, food, among others. The aim of this work was to produce proteases by submerged cultivation in the presence of agro-industrial waste. The determination of proteolytic activity was in the presence of 0.2 % azocasein. Submerged cultivation of Bacillus sp. strains isolated were carried out in Erlermeyer flasks. The maximum protease activity was determined in the presence of corn steep liquor. The concentration of the liquid metabolic by ultrafiltration of the metabolic liquid with proteolytic activity retained 80% of the activity. A factorial experimental design was carried out to investigate the stability of the metabolic liquid. The maximum proteolitic activity of the liquid metabolic cell-free (196 U/mL) was determined in the presence of 0.5 % sodium sorbate, 0.5 % calcium chloride, and 7.5 % of glycerol and polyethyleneglycol-200. The enzyme extract formulated retained 68 % of the proteolytic activity after 10 days at storage at room temperature (28 ˚C). The retentate with proteolytic activity showed optimum pH 9 and 11 and retention 90 - 100 % of the activity for 90 min at optimum pH; the optimum temperature was 50 ˚C e the maximum thermal stability was at 40 ˚C for 30 min at pH 11. The formulation of metabolic liquid concentrate with proteolytic activity which has thermal stability at alkaline pH is a bioproduct which can be used as an additive in detergents.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CHAPTER II: Bothrops snake venoms contain proteins that contribute to the local and systemic effects seen after envenoming, such as edema, myonecrosis, coagulation disorders and hemorrhage. These effects can be triggered by the toxic action of metalloproteinases present in the bothropic venom. This study aimed to perform the purification, biochemical and functional characterization of a metalloproteinase called Moozincin, from Bothrops moojeni snake venom. Moozincin has approximate molecular mass of 28 kDa, displays relevant fibrinogenolytic activity and can be classified as a non-hemorrhagic fibrinogenolytic metalloprotease, in the class P-I. Moozincin was also able to induce edema, myonecrosis and hyperalgesia in experimental animals. Morphological analysis of the evolution of muscle injury revealed the occurrence of degenerative events and leukocyte infiltration already at three hours after application of Moozincin. These effects dominate until 48 hours after administration of the metalloprotease, when hemorrhagic effect was also demonstrated later in skeletal muscle, probably triggered by the action characteristic of metalloproteinases on vascular components and / or indirect action resulting from muscle injury. / CAPÍTULO II: As peçonhas de serpentes do gênero Bothrops contêm toxinas que contribuem com efeitos locais e sistêmicos vistos no envenenamento, como edema, mionecrose, distúrbios de coagulação e hemorragia. Grande parte desses efeitos pode ser desencadeada pela ação tóxica de metaloproteases presentes na peçonha botrópica. Este trabalho teve o objetivo de realizar a purificação e caracterização bioquímica e funcional de uma metaloprotease, denominada Moozincina, presente na peçonha da serpente Bothrops moojeni. A Moozincina tem massa molecular aproximada de 28 kDa e apresenta atividade fibrinogenolítica relevante, podendo ser classificada como uma metaloprotease fibrinogenolítica não-hemorrágica, pertencente à classe P-I. A Moozincina também foi capaz de induzir edema, hiperalgesia e mionecrose em animais experimentais. A análise morfológica da evolução da lesão muscular evidenciou a ocorrência de eventos degenerativos e infiltrado leucocitário já na terceira hora após a aplicação da toxina (Moozincina). Esses efeitos predominam até 48 horas após a administração da metaloprotease, quando também foi evidenciado efeito hemorrágico tardio no músculo esquelético, provavelmente desencadeado pela ação característica de metaloproteases sobre componentes vasculares e/ou por ação indireta decorrente da lesão muscular. CAPÍTULO III: Moozincina é uma metaloprotease recentemente isolada da peçonha da serpente Bothrops moojeni. No presente trabalho foi realizada a caracterização farmacológica de efeitos inflamatórios induzidos pela Moozincina. A aplicação intraplantar da Moozincina (5, 25 and 50 μg/pata) induziu edema e hiperalgesia na pata de ratos. Os efeitos edematogênico e hiperalgésico máximos foram observados 3 e 4 horas após a injeção da toxina, respectivamente. Alguns fármacos como dexametasona (2,5 mg/kg) e indometacina (8,0 mg/kg) reduziram significantemente o edema e a hiperalgesia, já a prometazina (15 mg/kg) e o ácido nordiidroguaiarético (100 mg/kg) reduziram apenas o efeito edematogênico, enquanto HOE-140 (10 μg/pata) e NG-monometil-I-arginina (100 μg/pata) reduziu apenas a hiperalgesia. Esses resultados demonstram a participação de metabólitos de ácido araquidônico em ambos os efeitos inflamatórios induzidos pela Moozincina. Além disso, a ativação de receptores H1 de histamina está especificamente relacionada ao edema e a ação de bradicinina e de óxido nítrico à hiperalgesia. / Mestre em Genética e Bioquímica

Made available in DSpace on 2017-06-01T18:20:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertaca-_marcelo_silva.pdf: 974611 bytes, checksum: 8bf2b65106d8d1d7d04ec3c0dd5827f6 (MD5) Previous issue date: 2011-03-17 / The production of protease and biosurfactant by Bacillus licheniformis UCP-1014 was investigated in this work. The experiments were performed in Erlenmeyer flasks, in triplicate, and inoculum 10% v/v, 150 rpm and 37ºC. A factorial design was conducted to investigate the concentrations of the medium. Metabolic fluid samples were collected, centrifuged and the supernatant used to determine pH, proteolytic activity and surface tension. The liquid was concentrated by ultrafiltration metabolic the stability and proteolytic activity in the retentate was determined for pH and temperature. In making the retentate was used a factorial design, and protease stability was determined during 10, 20 and 30 days at 28ºC. The determination of protease was performed in the presence of azo-casein. The culture of B.licheniformis UCP-1014 produced 112 U/mL protease in the presence of 1% molasses and urea 0,5%, pH 7,5 at 24h of culture. The reduction in surface tension was not significant in these metabolic conditions. The concentration of proteases produced by B. licheniformis UCP-1014 had the highest stability of enzyme activity in the absence of substrate at pH 7 during 60 min of incubation and maximum thermal stability between 40 90ºC for 90 min. The liquid concentrate and formulated metabolic retained about 50% of proteolytic activity whose value decreased during storage at 28ºC. Proteases produced by B. licheniformis UCP-1014 in the presence of nutrients of low cost can be competitive in the market / A produção de proteases e biossurfactantes por Bacillus licheniformis UCP-1014 foi investigada neste trabalho. Os experimentos foram realizados em frascos de Erlenmeyer de 125 mL, em triplicata, inóculo 10% v/v, a 150 rpm e 37ºC. Um planejamento fatorial foi realizado para investigar as concentrações dos componentes do meio de cultivo. Amostras de líquido metabólico foram coletadas, centrifugadas e os sobrenadantes utilizados para determinar pH, atividade proteolítica e tensão superficial. O líquido metabólico foi concentrado por ultrafiltração e a estabilidade da atividade proteolítica no retentado foi determinada quanto ao pH e à temperatura. A estabilidade do retentado foi investigada por planejamento fatorial e a atividade proteolítica determinada com 10, 20 e 30 dias de armazenamento a 28 ºC. A determinação de proteases foi realizada na presença de azo-caseína. A cultura de B. licheniformis UCP-1014 produziu 112 U/mL de proteases na presença de melaço 1% e uréia 0,5%, a pH 7,5 com 24 h de cultivo. A redução da tensão superficial do líquido metabólico não foi significativa nessas condições de trabalho. O líquido metabólico concentrado reteve cerca de 50% da atividade proteolítica inicial. O concentrado de proteases apresentou a maior atividade enzimática em pH 8 durante 30 min de incubação, retendo 97 % da atividade; a estabilidade térmica máxima foi a 50ºC durante 30 min, retendo 98 % da atividade enzimática. O retentado do líquido metabólico após formulado manteve 54 % da atividade com 30 dias de armazenamento a 28ºC. Proteases produzidas por B. licheniformis UCP-1014 na presença de nutrientes de baixo custo podem ser competitivas no mercado

Made available in DSpace on 2017-06-01T18:20:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_joao_caitano_alves_neto.pdf: 777326 bytes, checksum: 2e15b6afc4e315a3f94d61e55ec5b9ce (MD5) Previous issue date: 2012-09-04 / The reuse of agro-industrial waste as sources of carbon and nitrogen has been investigated in biotechnology for the production of enzymes by microorganisms. Among the microbial enzymes imported into Brazil, the proteases are applied in technological processes in the fields of detergents, pharmaceuticals, cosmetics, food, among others. The aim of this work was to produce proteases by submerged cultivation in the presence of agro-industrial waste. The determination of proteolytic activity was in the presence of 0.2 % azocasein. Submerged cultivation of Bacillus sp. strains isolated were carried out in Erlermeyer flasks. The maximum protease activity was determined in the presence of corn steep liquor. The concentration of the liquid metabolic by ultrafiltration of the metabolic liquid with proteolytic activity retained 80% of the activity. A factorial experimental design was carried out to investigate the stability of the metabolic liquid. The maximum proteolitic activity of the liquid metabolic cell-free (196 U/mL) was determined in the presence of 0.5 % sodium sorbate, 0.5 % calcium chloride, and 7.5 % of glycerol and polyethyleneglycol-200. The enzyme extract formulated retained 68 % of the proteolytic activity after 10 days at storage at room temperature (28 ˚C). The retentate with proteolytic activity showed optimum pH 9 and 11 and retention 90 - 100 % of the activity for 90 min at optimum pH; the optimum temperature was 50 ˚C e the maximum thermal stability was at 40 ˚C for 30 min at pH 11. The formulation of metabolic liquid concentrate with proteolytic activity which has thermal stability at alkaline pH is a bioproduct which can be used as an additive in detergents. / O reaproveitamento de resíduos agroindustriais como fontes de carbono e de nitrogênio tem sido investigado na área de biotecnologia para produção de enzimas por micro-organismos. Dentre as enzimas microbianas importadas no Brasil, as proteases são aplicadas no processamento tecnológico de detergentes, fármacos, cosméticos, alimentos, dentre outros. O objetivo deste trabalho foi produzir proteases por cultivo submerso utilizando resíduos agroindustriais. A determinação da atividade proteolítica ocorreu na presença de azocaseína a 0,2 %. Cultivos submersos de culturas isoladas de Bacillus sp. foram realizados em frascos de Erlermeyer. A atividade máxima de proteases foi determinada na presença de milhocina. A concentração do líquido metabólico com atividade proteolítica por ultrafiltração reteve cerca de 80 % da atividade inicial. Um planejamento experimental fatorial foi realizado para investigar a estabilidade do líquido metabólico. A maior atividade proteolítica média do líquido metabólico livre de células (196 U/mL) foi determinada na presença de sorbato de sódio a 0,5 %, cloreto de cálcio a 0,5 %, glicerol a 7,5 % e polietilenoglicol-200 a 0,5 %. O extrato enzimático formulado reteve 68 % da atividade proteolítica com 10 dias de armazenamento à temperatura ambiente (28 ˚C). O retentado com atividade proteolítica apresentou pH ótimo 9 e 11 e retenção de 90 - 100 % da atividade durante 90 min em pH ótimo; a temperatura ótima foi 50 ˚C e a estabilidade térmica máxima a 40 ˚C durante 30 min a pH 11. A formulação de líquido metabólico concentrado com atividade proteolítica que apresenta estabilidade térmica em pH alcalino é um bioproduto que pode ser utilizado como aditivo em detergentes.

Este trabalho teve o objetivo de avaliar o efeito da adição da transglutaminase microbiana (MTGase) na fabricação de pão de forma, através do desenvolvimento de formulação ideal, com combinações de aditivos e enzima, e da avaliação do efeito da enzima nas proteínas, na massa crua, na massa após a fermentação e no produto final. Para comparar a qualidade dos pães produzidos com ou sem enzima, foram testadas três formulações: a básica, livre de aditivos (pão Zero); com a adição de emulsificante e ácido ascórbico (pão Controle); e a preparada com a formulação básica adicionada de enzima (pão MTGase). A avaliação da qualidade dos pães foi feita por meio de medidas físicas e instrumentais. A análise de textura foi realizada pelo método TPA (Texture Profíle Analysis), cujas respostas de firmeza, elasticidade, mastigabilidade e gomosidade podem ser correlacionadas com análises sensoriais. Paralelamente, de amostras de farinha, de massa e de pão foram obtidas as frações protéicas de gliadinas, gluteninas e os resíduos de extração. As gliadinas e as gluteninas foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa e por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS. Os resultados de volume e de firmeza dos diferentes pães apresentaram diferenças significativas a nível de 5%, em que as respostas do pão MTGase foram melhores que as do pão Zero, porém ainda inferiores às do Controle. A melhor formulação foi obtida por meio de um planejamento composto central, com variações nas concentrações de emulsificante, ácido ascórbico e enzima, com os resultados avaliados pela metodologia de superfície de resposta. Exceto para a coesividade, todos os outros parâmetros de volume, dureza (TA), firmeza, elasticidade, mastigabilidade e gomosidade (TPA) apresentaram resultados positivos pela ação da transglutaminase a 0,6%, combinada com 0,2 % de emulsificante e 70 ppm de ácido ascórbico. Os resultados sugerem que a enzima foi capaz de modificar as propriedades químicas das proteínas, o comportamento reológico da massa e as propriedades funcionais do pão, melhorando a força da massa, a textura e o volume dos pães. As análises das frações gliadínicas apresentaram cerca de 3% de Nitrogênio total, em base seca, e as frações glutenínicas apresentaram entre 2 e 5% de Nitrogênio total. Os perfis cromatográficos e eletroforéticos dessas frações sugerem que as gliadinas não foram afetadas pela presença da enzima, que envolveram sobretudo as gluteninas. O conjunto de resultados indica que a aplicação de MTGase em associação com aditivos convencionais pode ser uma alternativa à panificação, embora os mecanismos de sua ação na massa não estejam completamente esclarecidos. / The application of microbial transglutaminase on weak gluten flour used in breadmaking was studied over the process. To verify the enzyme effects, three formulations were tested: Base formulation, characterized by the absence of enzyme and emulsifying agents; Control formulation, comprised by the presence of emulsifying agents and ascorbic acid and MTGase formulation, with the enzyme. Samples of flour, dough and bread were analyzed. The effect of enzyme on bread quality was estimated by parameters of Texture Analysis, Texture Profile Analysis and specific volume. The protein contents from those samples were determined by the total nitrogen in glutenin and gliadin fractions, that were also analyzed by RP-HPLC (reversed phase high performance liquid chromatography) and by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). Although the MTGase bread did not reach the same quality parameters as those achieved by the Control samples, it showed as an alternative formulation to reduce the quantity of emulsifying agents and ascorbic acid as compared to the Control. The results indicate that the enzyme modified chemical and functional properties of glutenin fraction, improving dough strength and bread volume. Results of total nitrogen content, and electrophoretic and chromatographic profiles of the protein fractions suggest that while glutenin proteins were modified by enzyme, gliadin proteins were not affected.

Neste trabalho visamos otimizar o isolamento da BnP1, uma SVMP presente no veneno de B. neuwiedi, e isolar disintegrinas desse veneno, ambas originadas de precursores tipo P-II, analisando as seqüências de cDNA e a ação sobre plaquetas. A purificação da BnP1 foi por exclusão molecular e troca iônica; duas novas disintegrinas, D2 e D4, foram isoladas por cromatografia em fase reversa; e outra disintegrina, MS, foi caracterizada a partir do SDS-PAGE. As proteínas foram parcialmente seqüenciadas por espectrometria de massas. Diferentes cDNAs foram clonados a partir da glândula de veneno de B. neuwiedi e os precursores da BnP1 e MS se localizaram em um cluster que inclui SVMPs classe P-I e P-II. O precursor de D4 correspondeu a uma SVMP tipicamente P-II. A BnP1, ao contrário das disintegrinas, não inibiu a agregação plaquetária induzida por diferentes agonistas. Este trabalho indica ainda que a biossíntese de SVMPs da classe P-II pode envolver processamento de mRNA, um novo mecanismo de geração de diversidade das SVMPs. / The aim of this study was to optimize the isolation of BnP1, a SVMP from B. neuwiedi venom, and isolate new disintegrins from this venom, both originated from P-II class precursors, and analyze the sequence of their precursors and their action on platelets. BnP1 was isolated by size exclusion and anion-exchange chromatography; the disintegrins D2 and D4 by reverse-phase chromatography and MS was isolated from SDS-PAGE. These proteins were partially sequenced by mass spectrometry. Several SVMPs cDNAs were cloned from B. neuwiedi venom gland, and BnP1 and MS precursors localized in a cluster enclosing P-I and P-II SVMPs. MS cDNA was tipical of P-II class of SVMPs. BnP1, unlike the disintegrins, was not able to inhibit platelet aggregation induced by different agonists. This work suggested that the biosynthesis of class P-II SVMPs include mRNA processing as a further step to generate venom diversity.

Neste trabalho visamos otimizar o isolamento da BnP1, uma SVMP presente no veneno de B. neuwiedi, e isolar disintegrinas desse veneno, ambas originadas de precursores tipo P-II, analisando as seqüências de cDNA e a ação sobre plaquetas. A purificação da BnP1 foi por exclusão molecular e troca iônica; duas novas disintegrinas, D2 e D4, foram isoladas por cromatografia em fase reversa; e outra disintegrina, MS, foi caracterizada a partir do SDS-PAGE. As proteínas foram parcialmente seqüenciadas por espectrometria de massas. Diferentes cDNAs foram clonados a partir da glândula de veneno de B. neuwiedi e os precursores da BnP1 e MS se localizaram em um cluster que inclui SVMPs classe P-I e P-II. O precursor de D4 correspondeu a uma SVMP tipicamente P-II. A BnP1, ao contrário das disintegrinas, não inibiu a agregação plaquetária induzida por diferentes agonistas. Este trabalho indica ainda que a biossíntese de SVMPs da classe P-II pode envolver processamento de mRNA, um novo mecanismo de geração de diversidade das SVMPs. / The aim of this study was to optimize the isolation of BnP1, a SVMP from B. neuwiedi venom, and isolate new disintegrins from this venom, both originated from P-II class precursors, and analyze the sequence of their precursors and their action on platelets. BnP1 was isolated by size exclusion and anion-exchange chromatography; the disintegrins D2 and D4 by reverse-phase chromatography and MS was isolated from SDS-PAGE. These proteins were partially sequenced by mass spectrometry. Several SVMPs cDNAs were cloned from B. neuwiedi venom gland, and BnP1 and MS precursors localized in a cluster enclosing P-I and P-II SVMPs. MS cDNA was tipical of P-II class of SVMPs. BnP1, unlike the disintegrins, was not able to inhibit platelet aggregation induced by different agonists. This work suggested that the biosynthesis of class P-II SVMPs include mRNA processing as a further step to generate venom diversity.

Este trabalho teve o objetivo de avaliar o efeito da adição da transglutaminase microbiana (MTGase) na fabricação de pão de forma, através do desenvolvimento de formulação ideal, com combinações de aditivos e enzima, e da avaliação do efeito da enzima nas proteínas, na massa crua, na massa após a fermentação e no produto final. Para comparar a qualidade dos pães produzidos com ou sem enzima, foram testadas três formulações: a básica, livre de aditivos (pão Zero); com a adição de emulsificante e ácido ascórbico (pão Controle); e a preparada com a formulação básica adicionada de enzima (pão MTGase). A avaliação da qualidade dos pães foi feita por meio de medidas físicas e instrumentais. A análise de textura foi realizada pelo método TPA (Texture Profíle Analysis), cujas respostas de firmeza, elasticidade, mastigabilidade e gomosidade podem ser correlacionadas com análises sensoriais. Paralelamente, de amostras de farinha, de massa e de pão foram obtidas as frações protéicas de gliadinas, gluteninas e os resíduos de extração. As gliadinas e as gluteninas foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa e por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS. Os resultados de volume e de firmeza dos diferentes pães apresentaram diferenças significativas a nível de 5%, em que as respostas do pão MTGase foram melhores que as do pão Zero, porém ainda inferiores às do Controle. A melhor formulação foi obtida por meio de um planejamento composto central, com variações nas concentrações de emulsificante, ácido ascórbico e enzima, com os resultados avaliados pela metodologia de superfície de resposta. Exceto para a coesividade, todos os outros parâmetros de volume, dureza (TA), firmeza, elasticidade, mastigabilidade e gomosidade (TPA) apresentaram resultados positivos pela ação da transglutaminase a 0,6%, combinada com 0,2 % de emulsificante e 70 ppm de ácido ascórbico. Os resultados sugerem que a enzima foi capaz de modificar as propriedades químicas das proteínas, o comportamento reológico da massa e as propriedades funcionais do pão, melhorando a força da massa, a textura e o volume dos pães. As análises das frações gliadínicas apresentaram cerca de 3% de Nitrogênio total, em base seca, e as frações glutenínicas apresentaram entre 2 e 5% de Nitrogênio total. Os perfis cromatográficos e eletroforéticos dessas frações sugerem que as gliadinas não foram afetadas pela presença da enzima, que envolveram sobretudo as gluteninas. O conjunto de resultados indica que a aplicação de MTGase em associação com aditivos convencionais pode ser uma alternativa à panificação, embora os mecanismos de sua ação na massa não estejam completamente esclarecidos. / The application of microbial transglutaminase on weak gluten flour used in breadmaking was studied over the process. To verify the enzyme effects, three formulations were tested: Base formulation, characterized by the absence of enzyme and emulsifying agents; Control formulation, comprised by the presence of emulsifying agents and ascorbic acid and MTGase formulation, with the enzyme. Samples of flour, dough and bread were analyzed. The effect of enzyme on bread quality was estimated by parameters of Texture Analysis, Texture Profile Analysis and specific volume. The protein contents from those samples were determined by the total nitrogen in glutenin and gliadin fractions, that were also analyzed by RP-HPLC (reversed phase high performance liquid chromatography) and by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis). Although the MTGase bread did not reach the same quality parameters as those achieved by the Control samples, it showed as an alternative formulation to reduce the quantity of emulsifying agents and ascorbic acid as compared to the Control. The results indicate that the enzyme modified chemical and functional properties of glutenin fraction, improving dough strength and bread volume. Results of total nitrogen content, and electrophoretic and chromatographic profiles of the protein fractions suggest that while glutenin proteins were modified by enzyme, gliadin proteins were not affected.